專利名稱：一種近紅外光譜快速、無損傷鑒別人參種子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速無損傷鑒別人參種子的方法，特別是涉及一種采用近紅外
光譜技術(shù)快速無損傷鑒別人參種子的方法，屬于植物種質(zhì)資源鑒定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
藥用植物種質(zhì)繁殖材料的鑒定是中藥材GAP實施的關(guān)鍵和基礎(chǔ)，但在引種栽培 過程中，形形色色的藥用植物種子混淆的事件時有發(fā)生。人參有吉參1號、黃果人參等 品種，以及大馬芽、二馬芽、長脖、圓膀、圓蘆、竹蘆、線蘆、草蘆等農(nóng)家品種，產(chǎn)量 與、質(zhì)量與適應(yīng)性不盡相同，但是種子的外形幾乎一樣，品種間感官幾乎無法鑒別。因 此建立一些快速、無損傷鑒別人參種子的方法至關(guān)重要。 人參種子寬卵形或?qū)挼孤研?，略扁，長4.8 7.2mm，寬3.9 5.0mm，厚2.1 3.4mm，表面黃白色或淺棕色，粗糙；背側(cè)呈弓狀隆起，兩側(cè)面較平，腹部平直或稍內(nèi) 凹，基部有一小尖突，上具一小點狀的吸水孔，吸水孔上方有一脈(有時脫落或部分脫 落)，由種子腹側(cè)經(jīng)頂端，再經(jīng)背側(cè)達(dá)基部，脈至種子上端后開始分為數(shù)枝，凡脈經(jīng)過 處，種子均向內(nèi)微凹而呈淺溝狀，外種皮木質(zhì)，厚約0.5mm，內(nèi)表面平滑，有光澤；內(nèi) 種皮菲薄，淡黃色，貼生于胚乳；腹側(cè)平或稍內(nèi)凹，具一黃色或棕黃色線狀種脊，至頂 端常分為2(1 3)枚，至基部相連于一小尖狀種柄。胚乳有油性，胚細(xì)小，埋生于種仁 的基部，千粒重27g，特大者可達(dá)40g。 目前有人開展了DNA指紋分析方法鑒別人參種子研究，但不系統(tǒng)。馬小軍等采 用DNA指紋技術(shù)對山參和栽培參的5個農(nóng)家類型進(jìn)行了分析，用RAPD和AFLP方法， 檢測92個樣品基因組上6000多個引物結(jié)合位點對山參DNA中ITS進(jìn)行了序列測定，獲 得了關(guān)于人參不同種質(zhì)的遺傳性及種質(zhì)間遺傳關(guān)系的量代指標(biāo)，為人參的栽培、育種以 及資源保護(hù)提供了新的依據(jù)。 人參種內(nèi)有較豐富的遺傳多樣性，分析了大馬芽、二馬芽、長脖、圓膀、圓蘆5 個主要農(nóng)家類型的RAPD指紋，多態(tài)位點為56.9%，證明人參農(nóng)家類型有較豐富的遺傳 多樣性。經(jīng)過檢測人參農(nóng)家類型的AFLP，各自的特征多態(tài)性，但是長脖類型內(nèi)部有更多 的染合態(tài)個體，可能更接近山參。另外分析表明，山參與近緣種西洋參間的遺傳差異較 大，從RAPD指紋其遺傳距離的分析來看，山參遺傳因素形態(tài)變異上的作用可能小于環(huán) 境因素，這一結(jié)果為"山參"培育提出了理論依據(jù)。從種質(zhì)鑒定的角度來看，由于山參 與園參的關(guān)系是"覆蓋"的關(guān)系，即山參的遺傳多樣性，覆蓋了栽培參的遺傳多樣性， 故很難找到為所有山參所共有而栽培參沒有的RAPD特異分子標(biāo)記，可以說山參與園參 在遺傳上沒有特殊的差別。 例用DNA分子診斷技術(shù)尚存在一些問題。如RAPD方法穩(wěn)定性受模板、擴增 條件等諸多因素的影響，且尚未能構(gòu)建出真正意義上的數(shù)據(jù)庫；RAPD鑒定微小種子類 中藥材時，模板DNA中可能含有兩種以上植物的DNA，有關(guān)兩種模板DNA同時存在對 擴增結(jié)果的影響尚未見報道；DNA分子診斷技術(shù)對不同部位入藥的藥材尚難以區(qū)分；對于成藥、復(fù)方、提取液的DNA標(biāo)記也未見報道。此外，因DNA分子診斷標(biāo)記在中藥鑒 定中成本高，操作實驗條件要求嚴(yán)格等因素，也阻礙了該技術(shù)的推廣。因此，DNA分子 診斷技術(shù)必然要經(jīng)歷一個不斷發(fā)展和完善的過程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種近紅外光譜快速、無損傷鑒別人參種子的方法，具有快速、無 損傷等特點。 本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的
建立模型
(l)樣品 樣品包括人參的吉參l號、黃果人參、大馬芽、二馬芽、長脖、圓膀、圓蘆、 竹蘆、線蘆、草蘆、紫莖、石柱參等品種和類型種子，以及外觀與之極相近的西洋參種 子，總共13個種類樣品。每個種類的種子各分成3份，其中l(wèi)份作為分析樣品，2份作 為驗證樣品。 (2)近紅外光譜的采集 采用漫反射積分球采集樣品的近紅外光譜圖。內(nèi)置鍍金的漫反射體做背景，將 不同種類的樣品直接放入50cm樣品杯中，在12000 4000cm—1間掃描，分辨率為8cm—、 掃描64次。每份樣品測l次，總共得到24張近紅外光譜圖。
(3)數(shù)據(jù)處理 使用BriikerOPUS/CLUST和OPUS/IDENT對得到的近紅外光譜圖進(jìn)行聚類分 析，并建立定性模型。 圖1為人參、西洋參等種子樣品的近紅外光譜圖。人參和西洋參種子中主要 成分為氨基酸類，水分和不同的糖類。從譜圖中可以看出，在6700cm1、 5800cm1、 5100cm—1附近分別有三個較為明顯的吸收峰。而6700cm—1附近的吸收峰正是氨基酸中 N-H鍵伸縮振動的一級倍頻峰，5800cm—1附近的吸收峰為C-H鍵伸縮振動的一級倍頻峰， 5100cm—1為C = O鍵的二級倍頻以及O-H的合頻峰。采用相應(yīng)的化學(xué)計量學(xué)軟件來對樣 品進(jìn)行分析鑒別。
聚類分析結(jié)果 聚類算法采用最常用的Ward' s算法(Cluster Analysis)常用的數(shù)據(jù)前處理方法有 求導(dǎo)法(derivative),包括一階求導(dǎo)(first derivative), 二階求導(dǎo)(second derivative),矢量歸 一法(vector normalization)等，通常是根據(jù)實驗結(jié)果來挑選效果最好的預(yù)處理方法[4]。通 常來講，聚類分析中光譜預(yù)處理方法和光譜段并不一定是唯一的，光譜范圍寬模型的穩(wěn) 定性高。考慮到光譜的漂移和旋轉(zhuǎn)，以及特征類似，經(jīng)過條件優(yōu)化，最終選擇的預(yù)處理 方法為一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化，光譜范圍為8890.5cm-l AOOOcm^
建立鑒定模型 利用OPUS/IDENT來對樣品進(jìn)行分類。首先利用已知樣品建立鑒別模型，二是 把未知樣品的譜圖和鑒別庫中的譜圖進(jìn)行比較，得到分析報告。鑒別庫的建立是定性分 析的關(guān)鍵，其分析質(zhì)量很大程度上依賴于樣品代表性，數(shù)據(jù)前處理的方法，合適的頻率 范圍以及定性分析算法[5]。定性分析基本算法有兩種標(biāo)準(zhǔn)算法和因子法。標(biāo)準(zhǔn)算法是用歐氏距離D來計算光譜距離，公式為,lr[11 w) —6 J ，通過比較歐氏距離來比
較譜圖的匹配度，a(k)和b(k)是譜圖a、 b的縱坐標(biāo)的值，即光譜強度。因子法是先將譜 圖表示為因子譜的線性組合，a = 丁13*6+123*&+133*&+……，g為因子譜，各因子譜彼此 正交，T為每一個因子譜的系數(shù)，其數(shù)值表征相應(yīng)因子譜對所表征圖譜的供獻(xiàn)。然后用
因子T(也稱得分)來計算光譜距離，公式為D=#(r ,-r盧「。然后計算諸品種
訓(xùn)練集中每一樣品光譜到該品種平均光譜的距離(Hit值)，并根據(jù)此計算每一品種的閾值 (DT) : DT = Maximum(Hit)+X*SDev，其中Maximum(Hit)為測定的樣品光譜中到該樣品 平均光譜的最大距離；SDev為Hit值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；X為系數(shù)，使用上述公式來比較譜圖 的匹配度。模型的結(jié)果一方面看所有的建模光譜是否都被唯一鑒定，另一方面還要看不
同庫之間的選擇性， 一般用S值表示S = ，& +7;) 其中D為兩組庫平均光譜的距離，
^和T2兩組庫的閾值。如果S < 1，說明庫之間有交叉；S = 1表示剛好區(qū)分開；S > l表示庫已經(jīng)分開。顯然S越大說明模型預(yù)測的準(zhǔn)確率會越高。根據(jù)實驗效果，選取合 適的算法。 一般情況下在譜圖極為相似使用因子法，效果會優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)法。經(jīng)分析，選擇 譜圖預(yù)處理方法為一階導(dǎo)數(shù)+矢量歸一化，光譜范圍為4358.5cm—1 8913.7cm—、 一般根 據(jù)經(jīng)驗X選擇為0.2500，算法為因子法。分析結(jié)果為13張參考光譜能夠被唯一鑒定，譜 圖按照給定的種類被被分成3類，S值均大于1。
表l為定性模型的結(jié)果。
表1定性模型結(jié)果
庫1庫2s值閾值1閾值2
西洋參紅果3 15().180. 27
黃果紅果3.450, 140. 27
黃果西洋參4, 550， 140. 18 (4)驗證 將驗證樣品分別放入樣品杯中掃描，得近紅外光譜圖，譜圖通過所建模型進(jìn)行 鑒定，得出樣品種子結(jié)論。 本發(fā)明采用近紅外分子光譜技術(shù)，可對人參種子進(jìn)行了鑒別分析并具有以下優(yōu) 點 l.很多物質(zhì)在近紅外區(qū)域的吸收系數(shù)小，使分析過程變得簡單作為分子振動 能級躍遷產(chǎn)生的吸收光譜，近紅外區(qū)域的倍頻或合頻吸收系數(shù)很小， 一般較紅外基頻吸 收低1 3個數(shù)量級，所以樣品無需稀釋即可直接測定，便于生產(chǎn)過程的實時測定。
2.適用于漫反射技術(shù) 近紅外區(qū)內(nèi)光散射效應(yīng)大，且穿透深度大，使得近紅外光譜技術(shù)可以用于漫反 射技術(shù)對樣品直接測定。 3.近紅外光可以在玻璃或石英介質(zhì)中穿透近紅外區(qū)的波長短，不被玻璃或石 英介質(zhì)所吸收。因而可以透過容器直接對樣品進(jìn)行測定。更重要的是使一般玻璃光纖或石英光纖可以用于近紅外光譜技術(shù)，進(jìn)而使傳統(tǒng)的近紅外光譜技術(shù)擴展到了工業(yè)生產(chǎn)過 程分析及有毒有害情況下的在線檢測。 4.操作費用低樣品不需要預(yù)處理，操作費用低，儀器的高度自動化同時降低 了對操作者的技能要求。 5.可以用于樣品的定性，也可以得到精度很高的定量結(jié)果采用多元校正方法 及一組已知的同類樣品所建立的定量模型，可以快速得到相對誤差小于0.5%的測定結(jié) 果；定性分析采用識別分析程序，先取得一組已知樣品的吸光度分布模型，再測得待定 性樣品在不同波長下的吸光度分布，用聚類原理確定樣品是否屬于已有的模型，即這一 類已知的樣品。 6.不破壞樣品，不使用試劑，故不污染環(huán)境近紅外光譜分析只是取得樣品的 光譜信號，有時可以在原容器內(nèi)直接測量，因而不需要其他試劑，測試過程不會產(chǎn)生任 何污染。 7.測試速度快近紅外光譜的信息必須由計算機進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析， 一般一個樣品取得光譜數(shù)據(jù)后可以立刻得到定性或定量分析結(jié)果，整個過程可以在不到 2min內(nèi)完。近紅外光譜技術(shù)的另一個特點是通過1張光譜可以計算出樣品的多種組成或 性質(zhì)數(shù)據(jù)。 本發(fā)明的積極效果在于利用近紅外分子光譜技術(shù)，采用系統(tǒng)聚類法，對人參 種子進(jìn)行了鑒別分析.結(jié)果表明近紅外光譜技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對人參種子的準(zhǔn)確鑒別，樣品根 據(jù)不同的種類被正確歸類.與繁瑣復(fù)雜的傳統(tǒng)方法相比，近紅外光譜技術(shù)的分析效率更 高。采用近紅外光譜技術(shù)鑒別人參種子，對種子活力沒有影響。由于采用原樣品直接掃 描，不用做前處理，提高了鑒別效率。


圖1為不同人參種子的近紅外漫反射光譜圖。
具體實施例方式
為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發(fā)明的闡釋
而非對本發(fā)明的任何形式的限制。
實施例1 : 取"吉參1號"人參種子直接放入德國Briiker公司MPA型近紅外光譜儀的50cm 樣品杯中，在12000 4000cm—^司掃描，分辨率為8cm—、得近紅外光譜圖。譜圖通過所 建模型進(jìn)行鑒定，得出樣品為"吉參l號"人參種子的結(jié)論。
實施例2 :取"黃果人參"的種子直接放入德國Briiker公司MPA型近紅外光譜儀的50cm 樣品杯中，在12000 4000cm—^司掃描，分辨率為8cm—、得近紅外光譜圖。譜圖通過所 建模型進(jìn)行鑒定，得出樣品為"黃果"人參種子的結(jié)論。
實施例3 : 取"大馬芽"人參種子直接放入德國Briiker公司MPA型近紅外光譜儀的50cm 樣品杯中，在12000 4000cm—^司掃描，分辨率為8cm—、得近紅外光譜圖。譜圖通過所建模型進(jìn)行鑒定，得出樣品為"大馬芽"人參種子的結(jié)論。
實施例4 : 取"西洋參"種子直接放入德國Briiker公司MPA型近紅外光譜儀的50cm樣品 杯中，在12000 4000cm—V司掃描，分辨率為8cm—、得近紅外光譜圖。譜圖通過所建模 型進(jìn)行鑒定，得出樣品為"西洋參"種子的結(jié)論。
權(quán)利要求
一種近紅外光譜快速、無損傷鑒別人參種子的方法，其特征在于包括以下步驟(1)樣品選擇選擇人參的吉參1號、黃果人參、大馬芽、二馬芽、長脖、圓膀、圓蘆、竹蘆、線蘆、草蘆、紫莖、石柱參品種和類型種子，以及外觀與之極相近的西洋參種子，總共13個種類樣品；每個種類的種子各分成3份，其中1份作為分析樣品，2份作為驗證樣品；(2)近紅外光譜的采集采用漫反射積分球采集樣品的近紅外光譜圖；內(nèi)置鍍金的漫反射體做背景，將不同種類的樣品直接放入50cm樣品杯中，在12000～4000cm-1間掃描，分辨率為8cm-1，掃描64次，每份樣品測1次，得近紅外光譜圖；(3)數(shù)據(jù)處理使用BrükerOPUS/CLUST和OPUS/IDENT對得到的近紅外光譜圖進(jìn)行聚類分析，并建立定性模型；利用OPUS/IDENT來對樣品進(jìn)行分類；分析結(jié)果為參考光譜能夠被唯一鑒定，譜圖按照給定的種類被分成3類，S值應(yīng)大于1；(4)驗證將驗證樣品分別放入樣品杯中掃描，通過對該模型進(jìn)行鑒定，判斷鑒別結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開一種近紅外光譜快速、無損傷鑒別人參種子的方法，利用近紅外分子光譜技術(shù)，采用系統(tǒng)聚類法，對人參種子進(jìn)行了鑒別分析.結(jié)果表明近紅外光譜技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對人參種子的準(zhǔn)確鑒別，樣品根據(jù)不同的種類被正確歸類.與繁瑣復(fù)雜的傳統(tǒng)方法相比，近紅外光譜技術(shù)的分析效率更高。采用近紅外光譜技術(shù)鑒別人參種子，對種子活力沒有影響。由于采用原樣品直接掃描，不需做前處理，提高了鑒別效率。
文檔編號G01N21/31GK101692043SQ20091021772
公開日2010年4月7日 申請日期2009年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月13日
發(fā)明者王英平, 趙明忠, 趙景輝, 韓春麗, 齊俊生 申請人:趙景輝