專利名稱：一種水產(chǎn)品中磺胺類和抗生素類藥物多殘留的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)品組織中殘留物的檢測(cè)方法,尤其涉及一種水產(chǎn)品中磺胺類和抗生素類藥物多殘留的分析方法。
背景技術(shù)：
磺胺類藥物和四環(huán)素類藥物作為廣譜抗菌藥，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛用作添加劑，用于防治腸道感染和促進(jìn)生長(zhǎng)。但如果使用不當(dāng)，會(huì)引起毒性反應(yīng)、二重感染和細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性等問題，對(duì)食品安全、生態(tài)環(huán)境和人體健康造成直接或潛在的危害，因此，獸藥殘留的檢測(cè)研究一直是食品安全領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)水產(chǎn)品中磺胺類藥物、四環(huán)素類藥物多殘留檢測(cè)技術(shù)報(bào)道很多，主要有高效液相色譜法、毛細(xì)管區(qū)域電泳法、氣相色i普法、液相色譜-質(zhì)譜法等，但所采用的方法并未涉及到上述兩大類藥物殘留的同時(shí)檢測(cè)。
現(xiàn)有的檢測(cè)方法只能將上述兩大類藥物分開檢測(cè)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)檢測(cè)磺胺類藥物和四環(huán)素類兩大類藥物在水產(chǎn)品中殘留的方法。
本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的一種水產(chǎn)品中磺胺類和抗生素類藥物多殘留的分析方法，它包括如下步驟
取樣將填料和EDTA鈉鹽加入待檢測(cè)的水產(chǎn)品組織中，混合得混料；
淋洗用淋洗劑淋洗混料；
洗脫用洗脫劑對(duì)淋洗所得混料進(jìn)行洗脫得洗脫液；濃縮溶解將洗脫步驟所得洗脫液濃縮后用溶劑溶解后過濾得濾液；
HPLC測(cè)定以緩沖溶液作為流動(dòng)相將濾液進(jìn)行HPLC測(cè)定。 淋洗主要是洗掉肌肉中脂肪對(duì)殘留藥物的干擾，而肌肉中的獸 藥還留未洗下來；所用的淋洗劑可以是正己烷，也可以是其它淋洗劑 例如3%的曱醇水溶液、1%的甲醇-草酸的混合水溶液等其它溶液， 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)需要選取。作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述的淋 洗劑為正己烷。
所述的洗脫劑是曱醇水溶液、曱醇和乙腈的混合溶液、純曱醇、 純乙腈。
所述的緩沖溶液可以是草酸-曱醇的緩沖溶液、磷S吏-甲醇的緩沖 溶液、醋酸-乙腈的緩沖溶液，本發(fā)明優(yōu)選草酸-曱醇的緩沖溶液。
由于動(dòng)物性水產(chǎn)品中獸藥殘留物水平很低，樣品基質(zhì)復(fù)雜，干 擾物質(zhì)多，要盡可能除去與目標(biāo)物同時(shí)存在的雜質(zhì)，減少色譜干擾峰， 避免檢測(cè)器和色譜柱污染。因此，樣品的分離純化是獸藥殘留分析中 最費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的一個(gè)瓶頸步驟。多類獸藥殘留集成化4企測(cè)技術(shù)和獸藥 提取分離技術(shù)已經(jīng)成為了當(dāng)今的研究熱點(diǎn)，本發(fā)明將帶檢測(cè)組織在固
態(tài)時(shí)分散到基質(zhì)中，然后通過液相萃取的方法獲得各組分，這種方法 應(yīng)用于待測(cè)樣品的檢測(cè)時(shí)，其色譜干擾峰較少。
本發(fā)明選擇EDTA鈉鹽作為絡(luò)合劑，降低了雜質(zhì)，能夠全面獲得 待測(cè)樣品中磺胺類和抗生素類藥物殘留，取得了良好效果。在混合步 驟中需要待測(cè)樣品搗碎與填料和鈉鹽混合均勻以得到較好的效果。
本發(fā)明中填料的作用是(l)獸藥殘留在魚肉組織中分散均勻，更 有利于藥物殘留的洗脫；(2)在研磨的過程中可起到干燥作用，也有 利于獸藥殘留的洗脫。它可以是三氧化二鋁、硅藻土等填料，本發(fā)明 優(yōu)選C18填料。
本發(fā)明所述的草酸-甲醇緩沖液的pH值可以在2.0 4.0間，曱醇 為色譜純。本發(fā)明基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)應(yīng)用于這兩類藥物的同時(shí)檢測(cè)其
節(jié)省時(shí)間、節(jié)約分析成本、減少環(huán)境污染；它能在較短的時(shí)間內(nèi)分析
出這兩大類藥物殘留，有效解決了基質(zhì)中大部分干擾物質(zhì)的影響，方 法簡(jiǎn)便、精密度和準(zhǔn)確度均能達(dá)到殘留分析的要求。尤其是在樣品前
處理過程中添加了EDTA鈉鹽后提高了四環(huán)類物的洗脫效率；在樣品
分析時(shí)，流動(dòng)相中用草酸的緩沖溶液，而不是常用的醋酸或磷酸的緩
沖溶液，有利于四環(huán)素類藥物的穩(wěn)定，防止它們分解。
為了更好絡(luò)合待測(cè)樣品中的各種待測(cè)物，作為本發(fā)明的優(yōu)選， 所述的EDTA鈉鹽的重量為水產(chǎn)品組織的0.4~0.6倍，更為優(yōu)選的是 0.5倍。
作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述淋洗劑、洗脫劑的用量分別為水產(chǎn)品 組織重量的6 9倍之間。淋洗劑、洗脫劑的用量可相同也可不同。更 為優(yōu)選的是所述的淋洗劑為正己烷，它與二次淋洗液的用量相同且為 水產(chǎn)品組織重量的8倍。
作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述濃縮溶解步驟具體為將洗脫液在30 ~ 40。C轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，再用空氣流吹干，然后加入重量為水產(chǎn)品組織的 1 ~ 2倍的40% (體積比)曱醇水溶液溶解殘?jiān)^濾。
作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述的過濾所采用的濾膜為0.40~0.50(xm 濾膜。
作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述緩沖溶液的pH值為2.0-4.0。更為優(yōu) 選的是，所述緩沖溶液為草酸-曱醇的緩沖溶液。
作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述的HPLC測(cè)定采用梯度洗脫的方式， 具體是0~5min80:20(V/V,體積比)，6 ~ 20 min 75:25 (V/V,體積 比)，21 ~30min80:20(V/V,體積比)。0 ~ 5min 80:20(V/V,體積比) 即分析測(cè)試時(shí)間在0~5分鐘內(nèi)，草酸的緩沖溶液體積百分比為80%, 色譜純甲醇的體積比為20%。作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述的HPLC測(cè)定的測(cè)定波長(zhǎng)為265nm; 流動(dòng)相流速為0.70 ~ 0.9 mL/min，更為優(yōu)選的是0.8 mL/min;柱溫為 23~27°C,更為優(yōu)選的是25'C;進(jìn)樣量為18 ~ 22|iL,更為優(yōu)選的是 20jiL。
作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述一 次洗脫和二次洗脫的流速為1 min 40 ~ 70滴，更為優(yōu)選的是lmin 60滴。
綜上所述，本明具有以下有益效果
1. 本發(fā)明方法能同時(shí)檢測(cè)待測(cè)樣品中磺胺類和四環(huán)素類藥物的
殘留；
2. 本發(fā)明方法，所用的溶劑少，減少了有毒廢棄物的污染，對(duì)環(huán)
境友好，符合目前環(huán)保理念的待測(cè)樣品中獸藥殘留分析方法的要求。
3. 本分析方法操作簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、成本低。
具體實(shí)施例方式
本具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的解釋，其并不是對(duì)本發(fā)明的 限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀完本說明書后可以根據(jù)需要對(duì)本實(shí)施 例做出沒有創(chuàng)造性貢獻(xiàn)的修改，但只要在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi) 都受到專利法的保護(hù)。
發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將帶檢測(cè)的待測(cè)樣品樣品和C18填料 研磨混合、裝柱、淋洗、洗脫、富集、凈化、HPLC測(cè)定。待測(cè)化 合物采用C18柱分離，以3%草酸緩沖溶液-曱醇的混合溶液為流動(dòng) 相，梯度洗脫，流速為0.80mL/min, 二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè) 波長(zhǎng)265nm。結(jié)果表明加標(biāo)濃度為O.lOppm、 0.20ppm和0.50ppm 時(shí)，石黃胺類藥物平均加標(biāo)回收率73.8~93.8%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在 2.8~9.2%之間；四環(huán)素類藥物平均加標(biāo)回收率79.1~91.1%,相對(duì)標(biāo) 準(zhǔn)偏差在3.5~8.7%。與文獻(xiàn)中的分析方法相比，這種檢測(cè)方法操作 簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、成本低。
下述實(shí)施例是本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)過程。實(shí)施例一
稱取l.Og加標(biāo)濃度為0.10ppm混合均勻的魚肉置于玻璃研缽 中，并加入l.Og甲醇處理過的C18填料和0.5gEDTA鈉鹽，用玻 璃扦研磨5 min左右，使魚肉和填料混合均勻。取下端帶有濾膜墊 片的10mL注射器，將樣品裝柱，上面墊濾紙輕輕壓緊。用10mL 正已烷洗滌l次(流速為lmin60滴)，真空抽干(棄去淋洗液)；再用 10mL乙腈洗脫(流速為1 min 60滴)，真空抽干。洗脫液在35。C轉(zhuǎn) 蒸發(fā)至近干，再用空氣流吹干，然后加入2mL 40% (體積比)甲醇水 溶液溶解殘?jiān)?，過0.45pm濾膜后，進(jìn)行HPLC測(cè)定。以草酸-曱醇 的緩沖溶液為流動(dòng)相，pH約為3.0;梯度洗脫0 ~ 5min 80:20(V/V, 體積比)，6-20min75:25 (V/V,體積比)，21 ~ 30 min80:20(V/V, 體積比)；測(cè)定波長(zhǎng)265nm;流動(dòng)相流速為0.80 mL/min;柱溫為25 °C;進(jìn)樣量為20(iL?；前粪奏?、磺胺曱基嘧啶、磺胺二基嘧啶、磺 胺曱基異噁唑、土霉素和四環(huán)素的加標(biāo)回收率分別為85.1%、 89.6%、 73.8%、 91.6%、 79.1%和82.5%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.1 9.2% 之間。
實(shí)施例二
稱取l.Og加標(biāo)濃度為0.20ppm混合均勻的蟲下肉置于玻璃研缽 中，并加入l.Og曱醇處理過的C18填料和0.5gEDTA鈉鹽，用玻 璃抖研磨5min左右，使蟲下肉和填料混合均勻。取下端帶有濾膜墊 片的10mL注射器，將樣品裝柱，上面墊濾紙輕輕壓緊。用10mL 正已烷洗滌l次(流速為lmin60滴)，真空抽干(棄去淋洗液)；再用 5mL曱醇和5mL乙腈洗脫(流速為1 min 60滴)，真空抽干。洗脫 液在35 °C轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，再用空氣流吹干，然后加入2mL 40% (體 積比)曱醇水溶液溶解殘?jiān)?，過0.45pm濾膜后，進(jìn)行HPLC測(cè)定。 以草酸-甲醇的緩沖溶液為流動(dòng)相，pH約為3.0;梯度洗脫0 ~ 5min80:20(V/V,體積比)，6 — 20 min 75:25 (V/V,體積比)，21~30 min80:20(V/V,體積比)；測(cè)定波長(zhǎng)265nm;流動(dòng)相流速為0.80 mL/min;柱溫為25°C;進(jìn)樣量為20^L。石黃胺嘧。定、磺胺曱基嘧咬、 磺胺二基嘧啶、磺胺甲基異噁唑、土霉素和四環(huán)素的加標(biāo)回收率分 別為81.8%、 92.6%、 76.9%、 82.6%、 81.2%和91.1%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn) 偏差在2.8 8.7%之間。 實(shí)施例三
稱取l.Og加標(biāo)濃度為0.50ppm混合均勻的蟹肉置于玻璃研缽 中，并加入l.Og甲醇處理過的C18填料和0.5gEDTA鈉鹽，用玻 璃杵研磨5min左右，使蟹肉和填料混合均勻。取下端帶有濾膜墊 片的10mL注射器，將樣品裝柱，上面墊濾紙輕輕壓緊。用10mL 正已烷洗滌l次(流速為lmin60滴)，真空抽干(棄去淋洗液)；再用 10mL草酸和乙腈的混合溶液洗脫(流速為lmin60滴)，真空抽干。 洗脫液在35 °C轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，再用空氣流吹干，然后加入2mL 40% (體積比)曱醇水溶液溶解殘?jiān)?，過0.45jim濾膜后，進(jìn)行HPLC測(cè)定。 以草酸-甲醇的緩沖溶液為流動(dòng)相，pH約為3.0;梯度洗脫0 ~ 5min 80:20(V/V，體積比)，6-20 min 75:25 (V/V，體積比)，21-30 min80:20(V/V，體積比)；測(cè)定波長(zhǎng)265nm;流動(dòng)相流速為0.80 mL/min;柱溫為25°C;進(jìn)樣量為20(iL。石黃胺嘧啶、磺胺曱基嘧啶、 磺胺二基嘧啶、磺胺曱基異噁唑、土霉素和四環(huán)素的加標(biāo)回收率分 別為93.1%、 92.6%、 86.4%、 93.8%、 85.6%和80.7%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn) 偏差在3.2~6.5%之間。
權(quán)利要求
1、一種水產(chǎn)品中磺胺類和抗生素類藥物多殘留的分析方法，它包括如下步驟取樣將填料和EDTA鈉鹽加入待檢測(cè)的水產(chǎn)品組織中，混合得混料；淋洗用淋洗劑淋洗混料；洗脫用洗脫劑對(duì)淋洗所得混料進(jìn)行洗脫得洗脫液；濃縮溶解將洗脫步驟所得洗脫液濃縮后用溶劑溶解后過濾得濾液；HPLC測(cè)定以緩沖溶液作為流動(dòng)相將濾液進(jìn)行HPLC測(cè)定。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種食品中磺胺類和抗生素類藥物多 殘留的分析方法，其特征在于所述的EDTA鈉鹽的重量為水產(chǎn)品組 織的0.4 0.6。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種食品中磺胺類和抗生素類藥物多 殘留的分析方法，其特征在于所述淋洗劑、洗脫劑的用量分別為水 產(chǎn)品組織重量的6~9倍之間。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種食品中磺胺類和抗生素類藥物多 殘留的分析方法，其特征在于所述濃縮溶解步驟具體為將洗脫液 在30 4(TC轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，再用空氣流吹干，然后加入重量為水產(chǎn) 品組織的1 ~ 2倍的40% (體積比)曱醇水溶液溶解殘?jiān)^濾。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種食品中磺胺類和抗生素類藥物多 殘留的分析方法，其特征在于所述的過濾所采用的濾膜為0.40-0.50pm濾膜。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種食品中磺胺類和抗生素類藥物多 殘留的分析方法，其特征在于所述緩沖溶液的pH值為2.0~4.0。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種食品中磺胺類和抗生素類藥物多 殘留的分析方法，其特征在于所述的HPLC測(cè)定采用梯度洗脫的方式，具體是0~5min 80:20, 6 ~ 20 min 75:25, 21 ~ 30 min80:20,所 述的緩沖溶液為草酸-曱醇的緩沖溶液。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種食品中磺胺類和抗生素類藥物多 殘留的分析方法，其特征在于所述的HPLC測(cè)定的測(cè)定波長(zhǎng)為 265nm;流動(dòng)相流速為0.70 ~ 0.9 m^/min;柱溫為23 ~ 27°C;進(jìn)樣量 為18~22|iL。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種食品中磺胺類和抗生素類藥物多 殘留的分析方法，其特征在于所述淋洗和洗脫的流速為1 min 40 ~ 70滴。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種食品中磺胺類和抗生素類藥物 多殘留的分析方法，其特征在于所述的緩沖溶液為草酸-甲醇的緩 沖溶液，其pH值為3.0，所述的HPLC測(cè)定中流動(dòng)相流速為0.80 mL/min，柱溫為25°C ，進(jìn)樣量為20jliL;所述淋洗和洗脫的流速為1 min 60滴。
全文摘要
本發(fā)明涉及水產(chǎn)品組織中殘留物的檢測(cè)方法，尤其涉及一種水產(chǎn)品中磺胺類和抗生素類藥物多殘留的分析方法。它包括如下步驟將填料和EDTA鈉鹽加入待檢測(cè)的水產(chǎn)品組織中，混合得混料；用淋洗劑淋洗混料；用洗脫劑對(duì)淋洗所得混料進(jìn)行洗脫得洗脫液；將洗脫步驟所得洗脫液濃縮后用溶劑溶解后過濾得濾液；HPLC測(cè)定以緩沖溶液作為流動(dòng)相將濾液進(jìn)行HPLC測(cè)定。本發(fā)明方法能同時(shí)檢測(cè)待測(cè)樣品中磺胺類和四環(huán)素類藥物的殘留。
文檔編號(hào)G01N30/00GK101639466SQ20091010161
公開日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2009年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月15日
發(fā)明者健 叢, 俞志根, 賴克強(qiáng), 陸勤豐 申請(qǐng)人:賴克強(qiáng);俞志根;陸勤豐;叢 健