專(zhuān)利名稱(chēng)：固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及臨床醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域，是一種固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備 方法，該敏感膜可準(zhǔn)確、快速、定量檢測(cè)出人體腦鈉肽的含量。
背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的提高、生活節(jié)奏加快和心理壓力增大，心衰的發(fā)病率逐年上 升，已成為現(xiàn)代社會(huì)常見(jiàn)病。專(zhuān)家指出，在各種心腦血管意外中，要特別警惕心衰，因?yàn)樾乃?對(duì)心臟的損害不可逆轉(zhuǎn)。要預(yù)防心衰，最好的辦法是早發(fā)現(xiàn)早治療。但從目前來(lái)看，因?yàn)樾?衰無(wú)明顯臨床癥狀，50%的心衰患者未能及時(shí)確診，等發(fā)現(xiàn)患病時(shí)，已經(jīng)非常嚴(yán)重。專(zhuān)家建 議心衰發(fā)病的高危人群(心臟病、高血壓、糖尿病、血脂異常患者以及肥胖者)，最好每年做 一次腦鈉肽(Brain Natriuretic Peptide, BNP)檢查，以便在心衰早期及時(shí)干預(yù)。當(dāng)心功 能不全時(shí)，由于心臟容量負(fù)荷或壓力負(fù)荷增加，會(huì)使血中腦鈉肽濃度增高，因此，腦鈉肽成 為檢測(cè)心衰狀況的敏感指標(biāo)。但腦鈉肽水平的測(cè)定并沒(méi)有得到很好的普及，主要原因是受 檢測(cè)方法的制約。為了適應(yīng)這一需求，無(wú)論是基于實(shí)驗(yàn)室還是基于臨床的很多檢測(cè)方法都 必須加以改進(jìn)、優(yōu)化。目前，我國(guó)對(duì)腦鈉肽的檢測(cè)主要依靠進(jìn)口儀器和試劑，隨之帶來(lái)的檢 測(cè)費(fèi)用也大幅度增加。因此，研制一種靈敏度高、準(zhǔn)確度好、可快速檢測(cè)腦鈉肽濃度的光學(xué) 敏感膜，來(lái)降低腦鈉肽檢測(cè)成本，使腦鈉肽檢測(cè)易于在國(guó)內(nèi)普及，適合我國(guó)國(guó)情。該技術(shù)具 有巨大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜 的制備方法，該方法制備的光學(xué)敏感膜能定量檢測(cè)腦鈉肽的含量，成本低廉、準(zhǔn)確可靠、分 析速度快。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其將載體表面進(jìn)行醛基化處理 后，固定腦鈉肽捕獲抗體，用卵清蛋白將未固定腦鈉肽捕獲抗體的醛基封閉，利用抗原抗體 反應(yīng)，將腦鈉肽抗原分子的C-端區(qū)與腦鈉肽捕獲抗體結(jié)合，用酪蛋白將未結(jié)合腦鈉肽抗原 的腦鈉肽捕獲抗體進(jìn)行封閉，在腦鈉肽抗原分子內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)端結(jié)合標(biāo)記有熒光量子點(diǎn)的腦鈉 肽檢測(cè)抗體；其包括步驟(1)制備熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的腦鈉肽檢測(cè)抗體；(2)將載體表面氨基化；將氨基化的載體進(jìn)行雙功能試劑的交聯(lián)，使其表面形成 活化的醛基；(3)將腦鈉肽捕獲抗體固定在載體上；(4)采用卵清蛋白將載體上未參與反應(yīng)的醛基封閉；(5)在載體上滴加待測(cè)腦鈉肽樣品溶液，37°C水浴10 120分鐘；(6)采用酪蛋白將未與待測(cè)樣品中腦鈉肽抗原結(jié)合的腦鈉肽捕獲抗體進(jìn)行封閉；
(7)在載體上加入(1)步制備的熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的腦鈉肽檢測(cè)抗體，37°C水浴5 60分鐘，形成固相抗體_抗原_熒光量子點(diǎn)標(biāo)記檢測(cè)抗體的復(fù)合物；(8)用PBST洗滌，去掉多余的未參與反應(yīng)的熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的腦鈉肽檢測(cè)抗體溶 液；(9)沖洗，晾干，制成成品。所述的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其所述步驟(2)中，載體表面 醛基化處理，所用試劑為氨基硅烷和戊二醛；先用氨基硅烷進(jìn)行氨基化反應(yīng)，然后用戊二醛 進(jìn)行醛基化反應(yīng)，在載體表面形成活化的醛基，與腦鈉肽捕獲抗體的氨基進(jìn)行縮合反應(yīng)，形 成共價(jià)鍵。所述的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其所述步驟(3)，是將可以識(shí)別 腦鈉肽分子C-端區(qū)的腦鈉肽捕獲抗體滴加于醛基化的載體表面，在37°C水浴中放置30 120分鐘，然后用洗液和緩沖液沖洗，晾干。所述的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其所述步驟(4)，是在固定腦 鈉肽捕獲抗體的光學(xué)敏感膜上滴加 10%的卵清蛋白封閉液，封閉沒(méi)反應(yīng)的醛基，在 37°C水浴中放置60分鐘后，用蒸餾水沖洗，晾干。所述的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其所述步驟(6)，是加入酪蛋白 溶液封閉60分鐘，雙蒸水清洗，晾干。所述的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其所述載體，為玻璃片、金屬 片、PC板材、有機(jī)高分子薄膜其中之一。所述的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其特征在于，所述腦鈉肽捕獲 抗體，為單克隆抗體，該抗體可以識(shí)別腦鈉肽分子的C-端區(qū)；標(biāo)記有熒光量子點(diǎn)的腦鈉肽 檢測(cè)抗體，可以識(shí)別腦鈉肽分子內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)，即腦鈉肽捕獲抗體與腦鈉肽檢測(cè)抗體能識(shí)別腦 鈉肽抗原的不同表位形成雙抗體夾心復(fù)合物，通過(guò)光源激發(fā)熒光量子點(diǎn)發(fā)光來(lái)檢測(cè)腦鈉肽含量。所述的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其所述熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的腦鈉 肽檢測(cè)抗體，其中使用的熒光量子點(diǎn)是〔(^6丄(15、21^、11^、11^8及其核殼結(jié)構(gòu)中的一種或 幾種。用本發(fā)明方法制備的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腦鈉肽進(jìn)行快速 檢測(cè)，對(duì)心衰的早期診斷具有重要意義。


圖1是本發(fā)明方法制備的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜示意圖；圖2是本發(fā)明的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法流程示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明一種固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，所制備的光學(xué)敏感膜載體 表面固定有能識(shí)別腦鈉肽分子C-端區(qū)的腦鈉肽捕獲抗體。載體為固相載體，可以是金屬 片、PC板材、有機(jī)高分子薄膜或玻璃片，優(yōu)選玻璃片，它具有價(jià)格便宜、來(lái)源方便等優(yōu)點(diǎn)，而 且采用發(fā)光檢測(cè)的方法，玻璃片作為固定載體無(wú)論是透射光還是反射光均適合。
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載體表面的羥基經(jīng)硅烷處理使其氨基化，然后再用雙功能試劑戊二醛處理，這樣 就得到了醛基化載體，腦鈉肽捕獲抗體的氨基可與載體表面的醛基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，從而達(dá) 到固定腦鈉肽捕獲抗體的目的。本發(fā)明方法制備的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的載體表面經(jīng)過(guò)醛基化處理，腦 鈉肽捕獲抗體是通過(guò)雙功能交聯(lián)劑以共價(jià)鍵穩(wěn)定地固定于載體表面，可以進(jìn)行各種生化反應(yīng)。本發(fā)明的一種固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，包括選擇載體、處理表 面、固定捕獲抗體、封閉和捕獲抗原、加入熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)抗體形成雙抗體夾心復(fù)合 物等步驟組成。如圖1所示，為固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜，其中，載玻片1、腦鈉肽捕獲 抗體2、腦鈉肽抗原3、腦鈉肽抗原分子的C-端區(qū)4、腦鈉肽抗原分子內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)端5、標(biāo)記有 熒光量子點(diǎn)的腦鈉肽檢測(cè)抗體7、熒光量子點(diǎn)6、酪蛋白封閉劑8、醛基9、卵清蛋白10。固 定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜，由表面經(jīng)過(guò)醛基化試劑處理的載體(載玻片)、腦鈉肽捕獲抗 體、腦鈉肽抗原、以及標(biāo)記有熒光量子點(diǎn)的腦鈉肽檢測(cè)抗體四部分構(gòu)成。本發(fā)明的一種固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，包括如下步驟1.制備熒光量子點(diǎn)與腦鈉肽檢測(cè)抗體的偶聯(lián)物，該檢測(cè)抗體能識(shí)別腦鈉肽分子內(nèi) 環(huán)結(jié)構(gòu)。2.選擇載體，載體可以是生物載玻片或普通玻璃或PC板材或有機(jī)高分子薄膜中 的一種。如圖2所示3.表面處理用硅烷作為表面活性劑，使玻璃片表面氨基化，氨基可以和雙功能 試劑戊二醛結(jié)合，戊二醛與捕獲抗體偶聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)腦鈉肽捕獲抗體的固定。4.固定抗體將可以識(shí)別腦鈉肽分子C-端區(qū)的腦鈉肽捕獲抗體滴加于醛基化的 載體表面，在37°C水浴中放置30 120分鐘，然后用洗液和緩沖液沖洗，晾干。5.封閉在固定腦鈉肽捕獲抗體的光學(xué)敏感膜上滴加 10%的卵清蛋白封閉 液，封閉沒(méi)反應(yīng)的醛基，在37°C水浴中放置60分鐘后，用蒸餾水沖洗，晾干。6.以微量加樣器加入待測(cè)腦鈉肽樣品溶液，于37°C孵育10分鐘 120分鐘，用 PBST洗滌5次。7.加入酪蛋白溶液封閉60分鐘，雙蒸水清洗，晾干。8.以微量加樣器加入熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的腦鈉肽抗體，放入37°C水浴中溫浴5 60 分鐘制備成固定腦鈉肽的光學(xué)敏感膜，對(duì)該光學(xué)敏感膜進(jìn)行沖洗，晾干待用。實(shí)施例1)熒光量子點(diǎn)與腦鈉肽抗體偶聯(lián)物的制備用移液器移取20 μ 1 (2nmol/L)親和素標(biāo)記的硒化鎘(CdSe)熒光量子點(diǎn)置于2ml 離心管中，加入 100 μ 1 Tris-HCl 緩沖液(內(nèi)含 Immo 1/LEDTA、Imol/L NaCl,ρΗ = 7. 4)，將 10 μ 1生物素標(biāo)記腦鈉肽抗體溶于80 μ ITris-HCl緩沖液中，此時(shí)抗體濃度為0. 15mg/mL。 將上述生物素標(biāo)記的抗體溶液加入親和素修飾的熒光量子點(diǎn)溶液中，置37°C、150rpm/min 搖床中反應(yīng)30分鐘。加入Iml PBST緩沖液(含0.05%Tween-20及0. 1%BSA)，離心去掉 未參與反應(yīng)的腦鈉肽抗體溶液。加入PBS緩沖液配制成濃度為2. 5mg/mL熒光量子點(diǎn)標(biāo)記 腦鈉肽抗體溶液。
2)腦鈉肽捕獲抗體固定在醛基修飾的玻璃基片如圖1所示，將載玻片1先后用強(qiáng)堿和濃硫酸浸洗；雙蒸水沖洗，晾干。配制5% 氨基硅烷的乙醇溶液，將載玻片浸入上述溶液中作用60分鐘，取出洗滌后晾干。將上述氨 基化處理的載玻片浸入4%的戊二醛PBS (0. 2mol/L,pH = 8. 0)溶液中60分鐘，PBS溶液清 洗晾干。用0. 01mol/L，pH= 7. 4的PBS緩沖液稀釋腦鈉肽單克隆抗體為5μ g/mL，在醛基9 修飾的載玻片上點(diǎn)加20 μ 1上述腦鈉肽捕獲抗體溶液，37°C溫育60min，然后用生理鹽水洗 3次，將腦鈉肽捕獲抗體2固定在載玻片上，加入350 μ 1封閉液(0. 02mol/L,pH = 7. 4PBS， 10%卵清蛋白封閉液，0.5% NaN3),室溫封閉lh，冷凍干燥，密封于鋁箔袋中，4°C保存?zhèn)溆谩?)待測(cè)抗原的固定用0. 的Proclin-300為防腐劑的新生牛血清作為稀釋液，系列稀釋腦鈉肽陽(yáng) 性血清，并用國(guó)家參考品校定濃度。將10 μ 1的腦鈉肽陽(yáng)性血清3滴加到上述固定有腦鈉肽 捕獲抗體的載玻片上，然后置于37°C水浴箱中溫育2h，取出載玻片，用PBST溶液(0. Olmol/ L,0. 05% Tween20)輕輕沖洗5次，加入60 μ 1，1 %的酪蛋白封閉劑8封閉lmin，雙蒸水清
洗，晾干。4)熒光量子點(diǎn)標(biāo)記檢測(cè)抗體與抗原的結(jié)合20 μ 1熒光量子點(diǎn)標(biāo)記檢測(cè)抗體7溶液加入到固定有腦鈉肽抗原的載玻片上，置 于37°C水浴箱中溫育30分鐘，形成載玻片-待測(cè)抗原_熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)抗體的復(fù)合 物。用200 μ 1的PBST緩沖液(含0. 5% Tween-20 ；0. 1 0. 5% BSA)清洗5次，去掉多余 的熒光量子點(diǎn)6或熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的抗體溶液。在激發(fā)光照射下，用光學(xué)傳感器測(cè)量熒光量子點(diǎn)的發(fā)射光強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腦鈉肽 樣品溶液濃度的定量檢測(cè)。以上實(shí)施例只是為了起到說(shuō)明的目的，并非對(duì)本發(fā)明的限制，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ) 上，可以對(duì)本發(fā)明作許多改進(jìn)和改變，所作改進(jìn)和改變，及選用其它功能材料等方法均應(yīng)在 本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其特征在于，將載體表面進(jìn)行醛基化處理后，固定腦鈉肽捕獲抗體，用卵清蛋白將未固定腦鈉肽捕獲抗體的醛基封閉，利用抗原抗體反應(yīng)，將腦鈉肽抗原分子的C 端區(qū)與腦鈉肽捕獲抗體結(jié)合，用酪蛋白將未結(jié)合腦鈉肽抗原的腦鈉肽捕獲抗體進(jìn)行封閉，在腦鈉肽抗原分子內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)端結(jié)合標(biāo)記有熒光量子點(diǎn)的腦鈉肽檢測(cè)抗體；其包括步驟(1)制備熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的腦鈉肽檢測(cè)抗體；(2)將載體表面氨基化；將氨基化的載體進(jìn)行雙功能試劑的交聯(lián)，使其表面形成活化的醛基；(3)將腦鈉肽捕獲抗體固定在載體上；(4)采用卵清蛋白將載體上未參與反應(yīng)的醛基封閉；(5)在載體上滴加待測(cè)腦鈉肽樣品溶液，37℃水浴10～120分鐘；(6)采用酪蛋白將未與待測(cè)樣品中腦鈉肽抗原結(jié)合的腦鈉肽捕獲抗體進(jìn)行封閉；(7)在載體上加入(1)步制備的熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的腦鈉肽檢測(cè)抗體，37℃水浴5～60分鐘，形成固相抗體 抗原 熒光量子點(diǎn)標(biāo)記檢測(cè)抗體的復(fù)合物；(8)用PBST洗滌，去掉多余的未參與反應(yīng)的熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的腦鈉肽檢測(cè)抗體溶液；(9)沖洗，晾干，制成成品。
2.如權(quán)利要求1所述的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其特征在于，所述 步驟(2)中，載體表面醛基化處理，所用試劑為氨基硅烷和戊二醛；先用氨基硅烷進(jìn)行氨基 化反應(yīng)，然后用戊二醛進(jìn)行醛基化反應(yīng)，在載體表面形成活化的醛基，與腦鈉肽捕獲抗體的 氨基進(jìn)行縮合反應(yīng)，形成共價(jià)鍵。
3.如權(quán)利要求1所述的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其特征在于，所述 步驟(3)，是將可以識(shí)別腦鈉肽分子C-端區(qū)的腦鈉肽捕獲抗體滴加于醛基化的載體表面， 在37°C水浴中放置30 120分鐘，然后用洗液和緩沖液沖洗，晾干。
4.如權(quán)利要求1所述的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其特征在于，所述 步驟(4)，是在固定腦鈉肽捕獲抗體的光學(xué)敏感膜上滴加 10%的卵清蛋白封閉液，封 閉沒(méi)反應(yīng)的醛基，在37°C水浴中放置60分鐘后，用蒸餾水沖洗，晾干。
5.如權(quán)利要求1所述的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其特征在于，所述 步驟(6)，是加入酪蛋白溶液封閉60分鐘，雙蒸水清洗，晾干。
6.如權(quán)利要求1所述的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其特征在于，所述 載體，為玻璃片、金屬片、PC板材、有機(jī)高分子薄膜其中之一。
7.如權(quán)利要求1所述的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其特征在于，所述 腦鈉肽捕獲抗體，為單克隆抗體，該抗體可以識(shí)別腦鈉肽分子的C-端區(qū)；標(biāo)記有熒光量子 點(diǎn)的腦鈉肽檢測(cè)抗體，可以識(shí)別腦鈉肽分子內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)，即腦鈉肽捕獲抗體與腦鈉肽檢測(cè)抗 體能識(shí)別腦鈉肽抗原的不同表位形成雙抗體夾心復(fù)合物，通過(guò)光源激發(fā)熒光量子點(diǎn)發(fā)光來(lái) 檢測(cè)腦鈉肽含量。
8.如權(quán)利要求1或7所述的固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，其特征在于，所 述熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的腦鈉肽檢測(cè)抗體，其中使用的熒光量子點(diǎn)是CdSe、CdS、ZnS、InP, InAs 及其核殼結(jié)構(gòu)中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種固定人體腦鈉肽的光學(xué)敏感膜的制備方法，涉及臨床醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)，該光學(xué)敏感膜可用于腦鈉肽臨床檢測(cè)，包括選擇載體、表面處理、固定捕獲抗體、封閉和捕獲抗原、加入熒光量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)抗體形成雙抗體夾心復(fù)合物等制備步驟，其中載體表面經(jīng)過(guò)醛基化試劑處理，腦鈉肽捕獲抗體分子通過(guò)雙功能交聯(lián)劑以共價(jià)鍵固定于載體表面。該方法制備的敏感膜，由表面經(jīng)過(guò)處理的載體、腦鈉肽捕獲抗體、腦鈉肽抗原、以及標(biāo)記有熒光量子點(diǎn)的腦鈉肽檢測(cè)抗體四部分組成，可用于定量檢測(cè)人體腦鈉肽含量。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，成品使用方便，適合臨床上對(duì)痕量腦鈉肽的定量檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101923090SQ20091008713
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2009年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月10日
發(fā)明者劉儒平, 劉軍濤, 劉春秀, 王蜜霞, 羅金平, 蔡新霞 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院電子學(xué)研究所