專(zhuān)利名稱(chēng)：人tdp-43的單抗包被酶標(biāo)板的制法及elisa檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的生物制劑——抗人TDP-43的單抗，和一種用于人源TDP-43的ELISA檢測(cè)試劑盒，適用于人組織、細(xì)胞培養(yǎng)物或血清中TDP-43的定量檢測(cè)。
背景技術(shù)：
TDP-43 (TAR DNA-binding protein)即TARDNA結(jié)合蛋白，廣泛表達(dá)在人細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合DNA和RNA，調(diào)節(jié)胞內(nèi)核酸的轉(zhuǎn)錄和拼接，也參與細(xì)胞核內(nèi)小RNA的合成、凋亡和細(xì)胞分裂。于1995年被首次發(fā)現(xiàn)之后，TDP-43的不正常表達(dá)在癡呆病人的血清和尸檢中被大量檢出。研究表明TDP-43在胞內(nèi)表達(dá)量、定位情況、蛋白質(zhì)長(zhǎng)度、突變或過(guò)磷酸化、泛素化修飾均會(huì)造成腦組織部分功能的缺失或紊亂(Neumann, M. et al. Ubiquitinated TDP-43 inftontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis [J]. Science, 2006, 314,13(M33.)。
在體內(nèi)，TDP-43表達(dá)量的升高通過(guò)影響神經(jīng)膠質(zhì)的功能而導(dǎo)致的腦神經(jīng)元毒性。阿爾茨海默病(Alzheimer's disease)亦稱(chēng)老年性癡呆，占總癡呆癥的50-70%，阿爾茨海默病人腦部特征為一些關(guān)鍵位點(diǎn)大量祌經(jīng)元和神經(jīng)突觸的缺失，同時(shí)可見(jiàn)|3-淀粉樣肽斑塊和神經(jīng)纖維損傷，而TDP-43的錯(cuò)誤折疊參與了阿爾茨海默病病理發(fā)生。
額顳癡呆癥(Frontotemporal dementia)發(fā)病年齡小于60歲，病例少于阿爾茨海默病，同樣不可被治愈。額顳癡呆癥表現(xiàn)為肌肉和骨骼的惡性病變，含纈酪肽蛋白(valosin-ccmtainingprotein)的病變可導(dǎo)致額顳癡呆，但在FTDU-17型額顳癡呆癥病人的尸檢中發(fā)現(xiàn)，是TDP-43而不是含纈酪肽蛋白的泛素化包含體在患者腦部異常堆積，因此，TDP-43被認(rèn)為是FTDU-17
型額顳癡呆癥的一個(gè)標(biāo)識(shí)分子。
額顳葉變性(frontotemporal lobar degeneration)有2條蛋白質(zhì)病理途徑， 一條為tau途徑，另一條為T(mén)DP-43途徑，后者被認(rèn)為T(mén)DP-43從細(xì)胞核中轉(zhuǎn)移，在神經(jīng)元胞質(zhì)中漸進(jìn)累積所致。
運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病(motor-neuron disease)也稱(chēng)為肌萎縮性脊髓側(cè)索fi更化癥(Amyotrophiclateral sclerosis)或葛雷克氏癥(Lou Gehrig's disease),其癥狀表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元褪化所引起的肌肉漸進(jìn)性衰弱和痙攣狀態(tài)。TDP-43的過(guò)磷酸化、泛素化或者羧基端某個(gè)氨基酸的突變可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病。絕大多數(shù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病為T(mén)DP-43異常所引起，由過(guò)氧化物歧化酶突變所致的病例只占到2%。因此，TDP-43被認(rèn)為是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的一個(gè)主要的標(biāo)志蛋白。
佩里綜合癥(Perry syndrome)表現(xiàn)為體重減輕、情緒低落和肺換氣不足，它的病理學(xué)特征為T(mén)DP-43免疫染色陽(yáng)性，但與在額顳癡呆癥和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病中TDP-43影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元不同的是，TDP-43在佩里綜合癥影響了錐體外系統(tǒng)的皮層區(qū)域和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。
此外，亦有研究發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤折疊的TDP-43參與了在帕金森病(Parkinson's disease)、朊蛋白病(prion diseases)等神經(jīng)性病理過(guò)程。鑒于TDP-43為神經(jīng)病理學(xué)的一個(gè)標(biāo)記分子(Sleegers, K. and Broeckhoven， C.V. Rogue gene in thefamily [J].Nature, 2009, 458:415-417.)，該蛋白質(zhì)異常表達(dá)的及時(shí)發(fā)現(xiàn)將有利于相關(guān)病癥的早發(fā)現(xiàn)早治療，減輕病人自身和家庭的負(fù)擔(dān)，從而提高人類(lèi)的生活質(zhì)量。多數(shù)癡呆癥平約發(fā)病年齡早于50歲，60歲以上人口中老年癡呆癥患病比例約為5%，而80歲以上患病比例約為15%，這意味加強(qiáng)TDP-43的檢測(cè)具有巨大的現(xiàn)實(shí)需求和實(shí)踐意義(Selkoe, D. J. Alzheimer's diseaseis a synaptic failure [J]. Science, 2002, 298, 789—791.)。
目前，國(guó)際上幾大ELISA試劑盒生產(chǎn)商只是單一地生產(chǎn)TDP-43蛋白或抗體，而尚未有生產(chǎn)整套TDP-43 ELISA試劑盒的報(bào)道，對(duì)TDP-43的研究通常使用TDP-43過(guò)表達(dá)或錯(cuò)義突變的模式物，如神經(jīng)細(xì)胞、雞胚或小鼠，而缺乏TDP-43在人的血液、組織或細(xì)胞中定量的研究。同時(shí)，國(guó)內(nèi)廠家推出的少數(shù)幾個(gè)產(chǎn)品處于初創(chuàng)階段，甚至連個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和內(nèi)參都無(wú)法提供，測(cè)量所得結(jié)果自然令人生疑。問(wèn)題的原因一方面可能是廠家質(zhì)量意識(shí)淡漠，另一方面，其捕獲抗體和檢測(cè)抗體的純度和活性在技術(shù)上可能也難以達(dá)到試劑盒的相應(yīng)要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種新的用于人血清、組織或細(xì)胞中人源TDP-43定量檢測(cè)的ELISA試齊U盒。
本發(fā)明技術(shù)方案如下
1、抗人TDP-43的特異性單抗包被反應(yīng)板的制備，通過(guò)以下步驟
(1) 36KD TDP-43蛋白片段的獲得
① 36KDTDP-43蛋白片段的原核表達(dá)以BC001487DNA(購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC)為模板，用一對(duì)特異性的正反引物，PCR擴(kuò)增TDP-43 DNA片段
(88nt-870nt)，將所得片段克隆于載體pET28a (購(gòu)自德國(guó)Merck公司)，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)(購(gòu)自Merck)感受態(tài)大腸桿菌，根據(jù)卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆。提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA進(jìn)行鑒定，得到與目的片段分子量相一致的片段，初步判定為陽(yáng)性。以PCR陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明TDP-43 cDNA片段正確克隆至pET28a，為一個(gè)具有783bp的完整開(kāi)放式閱讀框，與GenBank中人源TDP-43基因100%同源，推算其表達(dá)的蛋白質(zhì)分子量為36KD， PI為5.0。
② 36KD TDP-43蛋白片段的鑒定轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21經(jīng)誘導(dǎo)后將菌體收集，超聲波裂解，菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯染色顯示，在36KD附近新增一條帶，經(jīng)Western blotting鑒定，能與TDP-43的抗體發(fā)生強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明該36KD的TDP-43蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性。
③ 36KD的TDP-43蛋白片段的制備與純化經(jīng)大量培養(yǎng)、誘導(dǎo)、表達(dá)，使用N產(chǎn)親和層析柱(購(gòu)自Pharmacia)純化帶有6XHis標(biāo)記的TDP-43蛋白，得到大量36KDTDP-43蛋白片段。
(2) 制備抗TDP-43的單抗
①TDP-43蛋白的動(dòng)物免疫將36KD的TDP-43蛋白片段與福氏佐劑混合并經(jīng)充分乳化后，皮下注射，免疫鼠齡在8 12周的BALB/c健康小鼠(購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心)3至4只，每次免疫間隔為2周，直至血清效價(jià)高于40000:1。
② 雜交瘤細(xì)胞的制備在末次免疫后4天，分離鼠脾細(xì)胞，在PEG存在條件下選擇與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞株(購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC)以4:1的比例融合，飼養(yǎng)細(xì)胞來(lái)自小鼠腹腔細(xì)胞。融合后的細(xì)胞以含HAT的培養(yǎng)基篩選，經(jīng)有限稀釋后選出高抗體分泌孔，將孔內(nèi)細(xì)胞克隆，進(jìn)行抗原特異的ELISA測(cè)定，挑選高分泌性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存。
③ 單抗制備將分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行小鼠腹腔接種，待產(chǎn)生明顯腹水后收集腹水，用葡萄球菌A蛋白交聯(lián)的親和層析柱(購(gòu)自Pharmacia公司)純化單抗?？贵w存于含55%甘油、0.1%BHA禾t] 0.01%硫柳汞的0.01mol/l、 pH7.4的PBS之中。
(3) 以所得單抗包被反應(yīng)板單抗用pH9.6的碳酸鹽緩沖溶液稀釋成適當(dāng)濃度，包被96孔板，每孔100nl，置于4。C濕盒16-24小時(shí)，PBST洗滌3次，每次30秒，然后拍干，除盡孔內(nèi)液體。
(4) 封閉用含8。/。小牛血清的pH7.4的PBS封閉，每孔200pl， 37°C， 2小時(shí)孵育后，PBST洗滌3次，干燥后密封；該板即為抗TDP-43的單抗包被的酶標(biāo)反應(yīng)板，可用于TDP-43的定量檢測(cè)。
2、 TDP-43標(biāo)準(zhǔn)品(全長(zhǎng)的TDP-43蛋白溶液)的制備
(1) 全長(zhǎng)的TDP-43蛋白的原核表達(dá)以BC095435 DNA(購(gòu)自ATCC)為模板，用一對(duì)特異性的正反引物，PCR擴(kuò)增TDP-43 (87nt-1331nt)目的基因，將所得基因克隆于載體pET28a，轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)感受態(tài)大腸桿菌，根據(jù)卡那霉素抗性篩選陽(yáng)性克隆。提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA進(jìn)行鑒定，得到與目的片段分子量相一致的片段，初步判定為陽(yáng)性。以PCR陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明全長(zhǎng)的TDP-43蛋白質(zhì)的cDNA正確克隆至pET28a，為一個(gè)具有1245bp的完整開(kāi)放式閱讀框，與GenBank中TDP-43基因100%同源，推算其分子量為56KD， PI為6.5。
(2) 全長(zhǎng)的TDP-43蛋白的鑒定轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21經(jīng)誘導(dǎo)后將菌體收集，超聲波裂解，菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯染色顯示，在56KD附近新增一條帶，經(jīng)Western blotting鑒定，能與TDP-43的抗體發(fā)生強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明全長(zhǎng)的TDP-43蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性。
(3) 全長(zhǎng)的TDP-43蛋白的制備與純化經(jīng)大量培養(yǎng)、誘導(dǎo)、表達(dá)，使用N產(chǎn)親和層析柱純化，得到大量全長(zhǎng)的TDP-43蛋白。
(4) TDP-43標(biāo)準(zhǔn)品制備將全長(zhǎng)的TDP-43蛋白保存于含55%甘油、0.1%81^和0.01%硫柳汞的0.01mol/l、 pH7.4的PBS之中，并使TDP-43蛋白的終濃度為lmg/ml
3、 TDP-43陽(yáng)性對(duì)照樣品的制備將全長(zhǎng)的TDP-43蛋白溶于含50。/。甘油、10%人血清、0.5%BSA、 0.1%BHA和0.01%硫柳汞的0.01mol/l、 pH7.4的PBS之中，并使TDP-43蛋白的終濃度為5ug/ml。4、 TDP-43的多抗的制備
(1) 動(dòng)物免疫取純化好的全長(zhǎng)的TDP-43蛋白與福氏佐劑混合并經(jīng)充分乳化后，脊柱兩側(cè)、對(duì)稱(chēng)多點(diǎn)皮下注射，免疫3-4月齡、體重在1.7Kg以上的健康日本大耳白兔
(購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心)3至4只，每次免疫間隔為2周，免疫l月后再次免疫后第8天耳靜脈取血測(cè)血清效價(jià)，直至血清效價(jià)高于40000:1。
(2) 血清獲取兔中耳動(dòng)脈取血，每次40ml，靜置30分鐘后離心，3000rpm、 5分鐘，上清即為血清。
(3) 多抗的純化用全長(zhǎng)的TDP-43蛋白交聯(lián)的親和層析柱(購(gòu)自Pharmacia)純化，.得到TDP-43的多抗，保存于含55%甘油、0.1%BHA和0.01%硫柳汞的O.OlmolA、pH7.4的PBS之中，多抗的終濃度為lmg/ml。
5、 酶標(biāo)二抗購(gòu)自美國(guó)R&D systems,為辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase, HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG。
6、 本試劑盒對(duì)TDP-43的ELISA檢測(cè)步驟包括
(1) 待測(cè)樣品、標(biāo)準(zhǔn)樣、陽(yáng)性對(duì)照依次加入微孔中，進(jìn)行孵育，TDP-43將與固相載體表面的捕獲抗體——預(yù)先包被在孔內(nèi)的抗體相結(jié)合。
(2) 經(jīng)過(guò)洗漆，將特異性的抗TDP-43的多抗加入孔內(nèi)，在第二次孵育中，多抗扮演檢測(cè)抗體，并與第一次孵育中被捕獲的TDP-43結(jié)合。
(3) 洗去多余的多抗,加入酶標(biāo)二抗，在第三次孵育中，酶標(biāo)二抗與上一步中的多抗——檢測(cè)抗體相結(jié)合，形成一個(gè)4組分的夾心形狀的結(jié)合物。
(4) 洗去未結(jié)合的酶標(biāo)二抗，加入酶的底物3，3',5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine, TMB)，孔內(nèi)液體在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，加入終止液，轉(zhuǎn)化成黃色。顏色的深淺和樣品中TDP-43的含量呈正相關(guān)。
(5) 用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(O.D.值)，計(jì)算樣品中TDP-43濃度。這種新的TDP-43 ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述試劑盒由上述特異性的TDP-43
的單抗包被的酶標(biāo)板、TDP-43蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、TDP-43的陽(yáng)性對(duì)照樣品、TDP-43的多抗、辣根
過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗構(gòu)成，具體組分為(1)酶標(biāo)板由TDP-43的單抗包被；(2)樣品
稀釋液含8%小牛血清和1。/?？谷薎gG的pH7.4的0.01mol/lPBS; (3)洗滌液；(4) TDP-43蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；(5) TDP-43的陽(yáng)性對(duì)照樣品；(6) TDP-43的多抗；(7)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗；(8)顯色液TMB-H202系統(tǒng)；(9)終止液2mol/l H2S04溶液。
TDP-43結(jié)合DNA和RNA，調(diào)節(jié)胞內(nèi)核酸的轉(zhuǎn)錄和拼接，也參與細(xì)胞核內(nèi)小RNA的合成、凋亡和細(xì)胞分裂，其識(shí)別核酸的2個(gè)功能區(qū)位于蛋白質(zhì)的第105個(gè)至257個(gè)之間，因此，我們選擇性克隆了其N(xiāo)端的262個(gè)氨基酸片段，該片段包括了其抗原性、核酸識(shí)別的功能區(qū)。再采用原核表達(dá)的該蛋白制備特異性的單抗，進(jìn)而采取夾心EUSA，簡(jiǎn)潔有效地檢出人血清、組織和細(xì)胞培養(yǎng)物中TDP-43的濃度。本試劑盒所有指標(biāo)符合美國(guó)R&D systems ELISA試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)的嚴(yán)格要求。目前，國(guó)外幾大ELISA試劑盒生產(chǎn)商尚未有TDP-43的ELISA試劑盒的報(bào)道，而國(guó)內(nèi)廠家的產(chǎn)品處于初創(chuàng)階段，基本沒(méi)有TDP-43的陽(yáng)性?xún)?nèi)參，所得到的測(cè)量結(jié)論值得商榷。本試劑盒采用20個(gè)陰性樣品的平均值加上2倍標(biāo)準(zhǔn)方差作為最低檢出線，為
0. 1ng/ml，國(guó)內(nèi)其它公司的TDP-43 ELISA檢測(cè)試劑盒的最低檢出線通常高于0.5mg/ml，本發(fā)
明提高了檢出精度。
本發(fā)明選取包含了全部的2個(gè)核酸識(shí)別功能區(qū)的TDP-43片段，并將其作為抗原免疫小 鼠得到特異性的高純度單抗。以此單抗作為捕獲TDP-43的抗體，保證了檢測(cè)結(jié)果的特異性， 最大程度避免了假陽(yáng)性。隨后以特異性多抗作為檢測(cè)抗體，進(jìn)一步排除了假陽(yáng)性；加入酶標(biāo) 二抗，形成一個(gè)4組分的夾心形狀的結(jié)合物，最后加入底物顯色液，將以上得到的正確信號(hào) 有效放大，對(duì)比同步平行進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)參實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步排除實(shí)驗(yàn)中的試劑或操作誤差， 最終得到可信賴(lài)的結(jié)論。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果
1、 應(yīng)用范圍廣泛適用于人血清、組織和細(xì)胞培養(yǎng)物；
2、 檢測(cè)速度快僅約3小時(shí)；
3、 使用便捷不需要復(fù)雜儀器；
4、 步驟簡(jiǎn)單；
5、 所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠通過(guò)多步特異性的抗原、抗體的親和反應(yīng)，層層有效地降低了非 特異性反應(yīng)；而且除提供標(biāo)準(zhǔn)品外，還提供陽(yáng)性對(duì)照，確保所得數(shù)據(jù)排除了眾多試劑、 溫度等因子的干擾。
具體實(shí)施例方式
1、 試劑
(1) 包被液(0.02mol/l，pH9.6的碳M^^M，緩沖液)Na2C03 0.6g，NaHCO3 1.16g， Na2N30.2g，加雙蒸水至1000ml，調(diào)pH至9.6。
(2) 標(biāo)本稀釋液(含8%小牛血清和1%抗人IgG的pH7.4的0.01mol/l PBS): NaCl 8.0g， NaH2P04'2H20 0.3g， Na2HP04'12H20 2.9g， KC1 0.2g，硫柳汞O.lg，加雙蒸水至lOOOml， 調(diào)pH至7.4。
(3) 封閉液(8。/。小牛血清/PBS溶液)小牛血清80ml， 0.0lmol/1 pH7.4 PBS 920ml。
(4) 洗滌液(pH7.4PBST): NaC18.0g， NaH2P04'2H20 0.3g， Na2HP04'12H20 2.9g， Tween 20 0.5g，硫柳汞0.1g，加雙蒸水至1000ml，調(diào)pH至7.4。
(5) 酶標(biāo)二抗(HRP標(biāo)記的羊抗兔多抗)購(gòu)自美國(guó)R&D systems,使用時(shí)用標(biāo)本稀釋液 作1:10000稀釋。
(6) TDP-43蛋白標(biāo)準(zhǔn)品全長(zhǎng)415個(gè)氨基酸的TDP-43蛋白的0.01mo1/1 PBS溶液，pH7.4， 含55%甘油、0.P/。BHA和0.01%硫柳汞，TDP-43終濃度為lmg/ml，使用時(shí)用標(biāo)本稀 釋液稀釋至128、 32 、 8、 2、 0.5、 Ong/ml六個(gè)梯度。
(7) TDP-43的陽(yáng)性對(duì)照樣品全長(zhǎng)的TDP-43蛋白的0.01mol/l、pH7.4的PBS溶液，含50% 甘油、10%人血清、0.5%BSA、 0.1%BHA和0.01%硫柳汞，TDP-43的終濃度為5 P g/ml， 使用時(shí)用標(biāo)本稀釋液作1:100稀釋。(8) 抗TDP-43的多抗多抗的PBS溶液，含55%甘油、0.1%BHA禾n 0.01%硫柳汞的 0.01mol/l、 pH7.4，多抗的終濃度為lmg/ml，使用時(shí)用標(biāo)本稀釋液作1:10000稀釋。
(9) 底物顯色液(TMB-H202系統(tǒng))
① 底物液A G',3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺tetramethyl benzidine, TMB): TMB200毫克，無(wú)水 乙醇100ml，加雙蒸水至9卯ml;
② 底物液B (11202尿素)Na2HP04'12H20 36.8g，檸檬酸9.3g， 1%過(guò)氧化氫尿素4.8ml， 加雙蒸水至1000ml，調(diào)pH至5.2。
③ 加入酶標(biāo)孔前10分鐘將底物液A和底物液B兩者1:1混合，作為底物顯色液。
(10) 終止液(2mol/lH2S04溶液)燒杯內(nèi)預(yù)先加入600ml雙蒸水，將濃硫酸100ml緩慢滴 力口，不斷攪拌，冷卻至室溫后定容至900ml。
2、 主要儀器
(1) 酶標(biāo)儀BIO-RAD Model 680。
(2) ELISA反應(yīng)板美國(guó)Coming Incorporated costar R 96 Well EIA/RIA plate。
(3) 水浴鍋購(gòu)自美國(guó)Napco公司，Model 203。
3、 方法
(1) 酶標(biāo)二抗最適滴度的選擇
① 將100ng/ml兔IgG包被反應(yīng)板，洗滌；
② 將酶標(biāo)二抗用標(biāo)本稀釋液作一系列稀釋?zhuān)尤肟變?nèi)，37°C，孵育40分鐘后，PBST洗 滌3次；
③ 加入底物顯色，20分鐘后加入終止液；
讀取吸光值，取吸光值為1.0時(shí)的酶標(biāo)二抗稀釋度——1:10000作為酶標(biāo)二抗的最佳 稀釋度。
(2) 棋盤(pán)法選擇單抗的最佳包被滴度
① 用包被液將單抗作一系列稀釋后，4"C包被反應(yīng)板16-24小時(shí)，PBST洗滌3次，除盡 孔內(nèi)液體；
② 加入標(biāo)準(zhǔn)樣和TDP-43陽(yáng)性對(duì)照、陰性參考血清溶液，孵育，洗滌；
③ 加入多抗溶液，孵育，洗滌； 加入酶標(biāo)二抗，孵育，洗漆；
◎加入底物顯色，20分鐘后加入終止液；
⑥讀取吸光值，選取TDP-43陽(yáng)性對(duì)照樣吸光值為0.8至1.0，陰性對(duì)照的吸光值小于0.1 的單抗包被稀釋度——1:10000作為最佳稀釋度。
(3) 單抗包被反應(yīng)板的制備方法
① 以碳酸鹽緩沖液稀釋單抗，包被％孔板，每孔lO(Hd，置于4'C濕盒16-24小時(shí)，PBST 洗滌3次，每次30秒，然后拍干，除盡孔內(nèi)液體；
② 用含8%小牛血清的pH7.4的PBS封閉，每孔200^1， 37°C， 2小時(shí)，PBST洗滌3次， 干燥后密封；該板即為抗TDP-43的單抗包被的酶標(biāo)板，可用于TDP-43的特異性檢(4) 試劑盒的構(gòu)成
所述試劑盒由特異性單抗包被反應(yīng)板制得的酶標(biāo)板、標(biāo)本稀釋液、洗滌液、酶標(biāo)二抗、 TDP-43標(biāo)準(zhǔn)品、TDP-43陽(yáng)性對(duì)照樣品、多抗、底物、終止液組成，具體組分為
① 酶標(biāo)板TDP-43的單抗包被的酶標(biāo)板；
② 標(biāo)本稀釋液含8%小牛血清和1%抗人IgG的pH7.4的0.0lmo1/1 PBS;
③ 洗滌液pH7.4PBST;
酶標(biāo)二抗HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG;
◎ TDP-43標(biāo)準(zhǔn)品全長(zhǎng)TDP-43蛋白的PBS溶液，TDP-43終濃度為lmg/ml;
⑥ TDP-43陽(yáng)性對(duì)照樣品全長(zhǎng)TDP-43蛋白的PBS溶液，TDP-43終濃度為5Pg/ml;
⑦ 多抗多抗的PBS溶液，抗體終濃度為lmg/ml;
⑧ 底物顯色液TMB-H202系統(tǒng)；
⑨ 終止液2mol/lH2S04溶液。
(5) 利用上述試劑盒檢測(cè)組織或細(xì)胞培養(yǎng)物、血清中TDP-43濃度的方法
① 將待測(cè)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照樣品進(jìn)行處理用標(biāo)本稀釋液將血清樣品進(jìn)行1:10、 細(xì)胞或組織裂解液1:5、陽(yáng)性對(duì)照1:100稀釋?zhuān)粯?biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)本稀釋液稀釋成128、 32、 8、 2、 0.5、 Ong/ml六個(gè)梯度；
② 將待測(cè)樣品、標(biāo)準(zhǔn)樣、陽(yáng)性對(duì)照依次加入酶標(biāo)孔中，每孔100pl， 37'C孵育1小時(shí)， PBST洗滌3次，每次洗滌均拍干孔內(nèi)液體；
③ 將抗TDP-43的多抗加入酶標(biāo)孔內(nèi)，每孔100td， 37'C孵育1小時(shí)，PBST洗滌3次； 加入酶標(biāo)二抗，每孔100pl， 37"孵育40分鐘，PBST洗滌3次，每次洗滌均拍千孔
內(nèi)液體；
加入酶的底物，每孔100pl，室溫孵育20分鐘后加入終止液，每孔5(Vl; 用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，制作不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值為Y軸、以其 濃度的對(duì)數(shù)為X軸制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
⑦計(jì)算結(jié)果如果陽(yáng)性對(duì)照樣品的測(cè)定值和標(biāo)示值(5yg/ml)相比較，其變異系數(shù)小于 15%，說(shuō)明測(cè)定過(guò)程可靠，可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所測(cè)樣品中TDP-43濃度。
權(quán)利要求
1、人TDP-43的單抗包被酶標(biāo)板的制法，通過(guò)下列步驟制備而成(1)以BC001487DNA為模板，擴(kuò)增TDP-43基因片段，與載體PET28a連接，轉(zhuǎn)化BL21，表達(dá)大量36KD TDP-43蛋白片段；(2)將36KD TDP-43蛋白免疫小白鼠，取其脾細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，選擇陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞于鼠腹水中培養(yǎng)，純化蛋白得到抗TDP-43的單抗；(3)將所得單抗用pH9.6的碳酸鹽緩沖溶液稀釋后包被96孔板，100μl/孔，4℃16-24小時(shí)，PBST洗滌3次，每次30秒，然后除盡孔內(nèi)液體；(4)用含8％小牛血清的pH7.4的PBS封閉，每孔200μl，37℃，2小時(shí)，PBST洗滌3次，干燥后密封；該板即為抗TDP-43的單抗包被的酶標(biāo)板，可用于TDP-43的特異性檢測(cè)。
2、 應(yīng)用權(quán)利要求1所述的人TDP-43的單抗包被酶標(biāo)板的ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征為由權(quán)利要求1所述的抗TDP-43的單抗包被的酶標(biāo)板、TDP-43標(biāo)準(zhǔn)品、TDP-43的陽(yáng)性對(duì)照樣品、抗TDP-43的多抗、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液構(gòu)成，具體組分為(1)酶標(biāo)板由TDP-43的單抗包被；(2)樣品稀釋液含8%小牛血清和1%抗人IgG的pH7.4的0.01mol/lPBS; (3)洗滌液pH7.4PBST; (4)酶標(biāo)二抗購(gòu)自美國(guó)R&D systems的辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase, HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG; (5) TDP-43標(biāo)準(zhǔn)品全長(zhǎng)TDP-43的PBS溶液，TDP-43終濃度為lmg/ml; (6) TDP-43陽(yáng)性對(duì)照樣品全長(zhǎng)TDP-43的PBS溶液，TDP-43終濃度為5 u g/ml; (7)抗TDP-43的多抗多抗的PBS溶液，多抗的終濃度為lmg/ml; (8)顯色液TMB-H2(V系統(tǒng)；(9)終止液2mol/lH2S04溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的人TDP-43的單抗包被酶標(biāo)板的制法及ELISA檢測(cè)試劑盒，其關(guān)鍵技術(shù)之處主要在于，用基因工程方法制備特異性的鼠抗人單抗，并將此抗體純化后包被的酶標(biāo)板作為試劑盒的重要組成，然后與TDP-43的多抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗、TDP-43標(biāo)準(zhǔn)品、TDP-43陽(yáng)性對(duì)照、樣品稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液組裝為人源TDP-43的ELISA檢測(cè)試劑盒；建立了敏感快捷的ELISA抗體捕獲人血清或細(xì)胞、組織培養(yǎng)物中TDP-43濃度的測(cè)定方法，具有高特異性，高穩(wěn)定性。試劑盒主要供一般性實(shí)驗(yàn)室或神經(jīng)病理學(xué)臨床研究使用。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101634656SQ20091006367
公開(kāi)日2010年1月27日 申請(qǐng)日期2009年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者萍 蘭, 彭進(jìn)洪 申請(qǐng)人:武漢三鷹生物技術(shù)有限公司