專利名稱：一種對(duì)蝦養(yǎng)殖水體菌群多態(tài)性檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)蝦養(yǎng)殖水體微生物菌群多態(tài)性的分子檢測方法，屬于微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
微生物在許多國民經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)部門中具有重要地位，如生物醫(yī)學(xué)工程(動(dòng)物、人體保健)、生物農(nóng)藥(植物內(nèi)生菌)、輕工業(yè)和環(huán)境保護(hù)、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域都利用微生物進(jìn)行生產(chǎn)活動(dòng)。多數(shù)情況下，這些部門的生產(chǎn)活動(dòng)依賴的是多種微生物所組成的微生物菌群整體功能。長期以來，這些利用微生物生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)活動(dòng)的許多行業(yè)部門，由于受到傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)技術(shù)的限制，無法全面、客觀地認(rèn)識(shí)系統(tǒng)中的群落成員，更無法動(dòng)態(tài)跟蹤系統(tǒng)成員種群數(shù)量變化對(duì)系統(tǒng)功能的影響，生產(chǎn)效率低，而且不穩(wěn)定。
水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)也是與微生物菌群有著密切聯(lián)系，水中微生物的生態(tài)情況直接影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，包括對(duì)魚蝦等疾病防治及其生長發(fā)育的影響。近年，國內(nèi)外在水產(chǎn)養(yǎng)殖中對(duì)水的生態(tài)環(huán)境，特別是微生物生態(tài)環(huán)境和水生動(dòng)物(魚蝦等)體的微生物情況(微生態(tài)環(huán)境)，因致病性細(xì)菌和病毒等引起魚蝦等疾病的流行，而受到重視。但是多側(cè)重于有害微生物研究，特別是病原菌的研究，并且傳統(tǒng)的分離菌種方法有其局限性，只有一部分能被培養(yǎng)，進(jìn)行微生物多樣性分析時(shí)其結(jié)果往往是局限的，不能準(zhǔn)確地反映混合菌群的組成和多樣性，對(duì)于一些培養(yǎng)條件較苛刻或許多不可培養(yǎng)微生物都無法預(yù)知，因此用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所得到的調(diào)查結(jié)果不能準(zhǔn)確反應(yīng)微生物菌群的組成情況，建立和發(fā)展一種不依賴微生物培養(yǎng)的方法進(jìn)行微生物菌群結(jié)構(gòu)研究是必要。
近年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)如分子雜交、PCR、核酸測序等的發(fā)展，微生物學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)生了深刻的變革，靈敏的檢測和精確的細(xì)菌鑒定成為可能。借助分子生物學(xué)方法進(jìn)行特異微生物的快速檢測和鑒定已成為現(xiàn)代微生物診斷和生態(tài)學(xué)研究的重要手段。上世紀(jì)80年代末至90年代以來，分子生物學(xué)技術(shù)開始被廣泛應(yīng)用于微生物菌群結(jié)構(gòu)分析，且發(fā)展迅速，研究熱點(diǎn)主要集中于具有保守序列的16S rRNA上。研究方法包括分子雜交法、PCR法、SSCP法、DGGE法、RFLP和克隆文庫法等，具有很高的靈敏性，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法或其它不依賴培養(yǎng)技術(shù)的方法相比有明顯的優(yōu)越性，推動(dòng)了微生物菌群結(jié)構(gòu)研究的快速發(fā)展。但是，這些基于PCR的方法可能會(huì)在擴(kuò)增反應(yīng)中引入誤差，降低所得到信息的精確度，并且實(shí)際工作中，用單一的分子生態(tài)學(xué)方法并不能完全達(dá)到預(yù)期的目的，并且每一種方法都有自身的不足，常常要結(jié)合運(yùn)用多種分子生態(tài)學(xué)方法，有時(shí)甚至要結(jié)合傳統(tǒng)方法，才能夠?qū)?fù)雜環(huán)境的微生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行全面的分析。
微生物生態(tài)學(xué)和微生態(tài)學(xué)研究結(jié)果，使人們認(rèn)識(shí)到水體中有益微生物對(duì)改善水質(zhì)、防治魚蝦疾病和提高產(chǎn)量有著重要作用。Susan E，Pryde，Anyhony J.Richardson，Colin S.Stewart，and Harry J.Flint.1999.Molecular Anyalysia of the Microbial Diversity Present in the Colonic Wall，Colonic Lumen，and Cecal Lumen of a Pig.Appl.Environ.Microbiol，655372-5377用于微生物菌群結(jié)構(gòu)分析的基因組DNA信息包括16SrDNA(核糖體小亞基基因)，包含了相應(yīng)細(xì)菌種類的系統(tǒng)分類地位信息，以16S rDNA為對(duì)象可以準(zhǔn)確地分析微生物菌群的結(jié)構(gòu)組成。一種常用的就是構(gòu)建基因文庫，通過分析一定數(shù)量的克隆子的序列以及它們的出現(xiàn)頻率，可以在一定程度上了解環(huán)境樣品中的主要菌群及其出現(xiàn)豐度等種群結(jié)構(gòu)信息。但這種方法需要進(jìn)行克隆、測序等水平的工作，耗費(fèi)人力、財(cái)力和時(shí)間都較大，難以用于實(shí)際生產(chǎn)需要。另外，又發(fā)現(xiàn)了常用的依賴16S rDNA-DGGE技術(shù)Muyzer G，de Waal E C，Uitterlinden A G.Profiling of complexmicrobial population by denaturing gradient gel electrophoresia analysis of polymerase chainreaction-amplified genes encoding for 16S rRNA..Applied Environmental Microbiology，1993，59(3)695-700。但這種分子檢測方法一般只能分析500bp個(gè)堿基對(duì)以下的DNA片段，得到的系統(tǒng)進(jìn)化相關(guān)信息很少，其圖譜一般只有一二十個(gè)條帶，系統(tǒng)中弱勢(shì)菌不能被檢測到，條件要求相對(duì)苛刻，DGGE電泳條件不一樣，即使相同的樣品所得到的圖譜也有差異，到后期切割回收膠建立基因克隆文庫，然后進(jìn)行測序，因此也不是快捷，耗費(fèi)人力、物力，并且當(dāng)微生物種類過多時(shí)，同一條帶可以包含多個(gè)種類的DNA信息，因此，不能做到在較高的分辨率下分析比較微生物菌群結(jié)構(gòu)的差異。目前基于16S rRNA擴(kuò)增的還有RFLP技術(shù)，從環(huán)境樣品中提取總的DNA，用通用引物擴(kuò)增16S rDNA，用各種限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析，由于不同的菌群內(nèi)微生物種類組成不同，其酶切圖譜不同，這樣就可以得到反映微生物菌群結(jié)構(gòu)組成的DNA凝膠電泳圖譜，但這種方法需要多種酶切過程，克隆，比較費(fèi)時(shí)，并且只是一種半定量或定性分析，對(duì)于圖譜相似的菌群，其組成不一定相同。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種改進(jìn)T-RFLP-PCR結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體微生物菌群結(jié)構(gòu)快速的檢測分析方法，使其檢測更加具有快速、準(zhǔn)確、特異性的特點(diǎn)，并且對(duì)定量檢測蝦塘水優(yōu)勢(shì)菌群亞硝酸鹽氧化菌的熒光原位雜交其條件進(jìn)行優(yōu)化。
本發(fā)明將改進(jìn)T-RFLP結(jié)合FISH技術(shù)應(yīng)用到研究蝦養(yǎng)殖水體復(fù)雜環(huán)境樣品中，不經(jīng)純培養(yǎng)直接提取蝦養(yǎng)殖水體樣品中微生物的總的基因組DNA，設(shè)計(jì)特異性T-RFLP-PCR通用引物(序列上游引物5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′、下游引物5′-CCG TCA ATT CCTTTR AGT TT-3′)，其5’端用6-fam熒光標(biāo)記，RCR循環(huán)反應(yīng)，擴(kuò)增得到各種微生物目標(biāo)DNA片段一端就帶有熒光標(biāo)記，用特異性限制性酶HaeIII對(duì)DNA片段消化，不同微生物目標(biāo)DNA片段因其核苷酸序列不同會(huì)導(dǎo)致酶切位點(diǎn)存在差異，產(chǎn)生了不同長度的限制性片段，電泳分離和熒光檢測，只有末端帶有熒光標(biāo)記的片段會(huì)被檢測到。由于核苷酸序列具有多樣性，不同微生物的同一個(gè)基因的核苷酸序列存在差異，在相同酶切后可能得到不同長度的T-RF，反映在T-RFLP檢測中就是不同的熒光信號(hào)，通過生成T-RFLP圖譜的分析，揭示樣品中微生物的種類、數(shù)量和種群大小等，從而解析微生物菌群的結(jié)構(gòu)、功能及其動(dòng)態(tài)變化。但是單獨(dú)依賴T-RFLP技術(shù)，也有其缺陷，基于PCR擴(kuò)增技術(shù)，就會(huì)受到菌群不同菌種DNA的差異性擴(kuò)增、目標(biāo)DNA在菌種間拷貝數(shù)的差異、PCR技術(shù)本身的偏差以及酶切后T-RF的長度分布也會(huì)造成復(fù)雜多樣性的低估等因素影響，而FISH技術(shù)是一種不依賴PCR的分子分析技術(shù)可以很好彌補(bǔ)以上的單一依賴PCR的分子檢測技術(shù)的不足，結(jié)合了分子生物學(xué)的精確性和顯微鏡的可視性信息，可以在自然或人工的微生物環(huán)境中監(jiān)測和鑒定不同微生物個(gè)體，同時(shí)對(duì)微生物菌落進(jìn)行評(píng)價(jià)。因此運(yùn)用T-RFLP結(jié)合FISH技術(shù)，很好結(jié)合各自的優(yōu)點(diǎn)和避免相互不足，定性和定量分析蝦養(yǎng)殖水體隨著時(shí)間變化微生物生態(tài)多樣性以及優(yōu)勢(shì)菌群組成結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。
本發(fā)明對(duì)T-RFLP結(jié)合FISH分析技術(shù)條件進(jìn)行了優(yōu)化，主要對(duì)樣品總DNA提取，對(duì)T-RFLP-PCR設(shè)計(jì)了特異性引物并確定了循環(huán)反應(yīng)體系與反應(yīng)參數(shù)，優(yōu)化HaeIII酶切體系，對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群FISH條件優(yōu)化。
為了獲得高質(zhì)量的總DNA，重復(fù)CTAB抽提和氯仿/異戊醇抽提，直到看不見界面為止，以出去多糖和其他污染的大分子，純化DNA，用1％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。
對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群FISH條件優(yōu)化，主要是對(duì)樣品的自發(fā)熒光進(jìn)行了消弱，非特異性性雜交進(jìn)行了消除，確定了合適的雜交時(shí)間與洗脫液濃度。
為了消除樣品自身熒光的干擾，獲得最佳效果，樣品優(yōu)勢(shì)菌亞硝酸鹽氧化菌用4％多聚甲醛固定后又46℃加熱固定，用0.2mol/L HCI進(jìn)行處理，PH6.5，菌懸液稀釋倍數(shù)104，使其菌體分散程度更好，之后再進(jìn)行雜交。
對(duì)于非特異性雜交的排除，采用了HEX標(biāo)記探針來解決。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，可以很好的消除假陽性，在490nm激發(fā)光下發(fā)出橙紅色熒光。因此，樣品雜交后，并同時(shí)進(jìn)行熒光鏡檢。
FISH檢測的準(zhǔn)確性和可靠性主要依賴于寡核苷酸探針的特異性，因此實(shí)驗(yàn)中對(duì)于與靶序列相似具有錯(cuò)配堿基的探針，加入了競爭性探針，使得靶序列很快就可以被檢測。亞酸鹽氧化菌16SrRNA設(shè)計(jì)的通用探針NIT3，其5’端用HEX熒光標(biāo)記，序列為5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’；其競爭性探針CNIT3序列為5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。CNIT探針與NIT探針同時(shí)使用，以確保NIT探針的特異性。
本發(fā)明的目的具體通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 一種檢測蝦養(yǎng)殖水體微生物菌群多態(tài)性的方法，包括如下步驟和工藝條件 (1)蝦養(yǎng)殖水體樣品中混合微生物總基因組DNA的提??； (2)設(shè)計(jì)特異性T-RFLP-PCR通用引物，進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)；所述特異性T-RFLP-PCR通用引物的上游引物為5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物為5′-CCG TCA ATT CCT TTRAGT TT-3′，5’端用6-fam熒光標(biāo)記；PCR反應(yīng)體系是23mM MgCl2 2.0-2.5uL，2.5mM的dNTP1-2uL；退火溫度為57-58℃； (3)產(chǎn)物純化，用特異性限制性內(nèi)切酶HaeIII酶切DNA；酶切體系DNA≤1ug；產(chǎn)物純化是指PCR產(chǎn)物經(jīng)DyNA quant200濃度測定后，取5ugPCR產(chǎn)物經(jīng)MO BIO UItraClean PCRClean-up DNA Purification kit純化； (4)微生物菌群多態(tài)性結(jié)構(gòu)分析；HaeIII酶切DNA片段與具熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)DNA參照物混合后，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)銀染后熒光掃描檢測，帶有熒光標(biāo)記的片斷被檢測，轉(zhuǎn)化為T-RFLP熒光圖譜中的各個(gè)峰，每一個(gè)峰作為一個(gè)OUT(末端熒光標(biāo)記片段或操作分類單元)來進(jìn)行物種豐度(S＝T-RFLP圖譜中顯著峰的總數(shù)，粗略認(rèn)為一個(gè)峰對(duì)應(yīng)一個(gè)不同的物種)、多樣性指數(shù)(Shannon-Weiner指數(shù)H＝-∑PilnPi和Simpson指數(shù)D＝1-∑Pi2，其中，Pi表示某個(gè)峰的峰高占總高峰的比例)和物種均度(E＝H′/Hmax，其中，Hmax＝ln S)分析；然后對(duì)DNA的T-RFLP的指紋圖譜條帶切膠回收測序，序列通過RDP數(shù)據(jù)庫CHECK-CHIMERA軟件分析鑒定是否是形成嵌合片段，并在RDP數(shù)據(jù)庫中Classification進(jìn)行比對(duì)確定分類，將鑒定的序列利用NCBA的Blast軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列進(jìn)行相似性比對(duì)，選取同源性大于97％，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；所述1％瓊脂糖凝膠是指1g瓊脂糖溶于100ml蒸餾水； (5)優(yōu)勢(shì)菌熒光原位雜交技術(shù)定量檢測； a對(duì)實(shí)驗(yàn)所需玻片進(jìn)行處理 對(duì)玻片進(jìn)行清洗，硅化處理，以及明膠涂片制備； b樣品采集及處理 取原始菌液，加入等量新鮮配制培養(yǎng)基，通入空氣，活化1-2天，用去離子水稀釋至10-4，隨后離心，棄上清液，加入PBS，充分搖勻分散，調(diào)節(jié)pH至6.0-6.5，調(diào)節(jié)pH的目的是使聚集在一起的硝化細(xì)菌能更好的分散；再將玻片放置到烘箱內(nèi)熱固定，時(shí)間為1-3h；再用4％多聚甲醛室溫下固定10-20min，沖洗風(fēng)干；最后將固定后的樣品用乙醇脫水3-5min；所述1％瓊脂糖凝膠是指1g瓊脂糖溶于100ml蒸餾水； c雜交 將探針NIT3及探針CNIT3用HEX標(biāo)記，將標(biāo)記好的探針與雜交緩沖液混合于密閉雜交盒中；雜交溫度控制在46℃，雜交時(shí)間為2-3h，雜交后用洗脫液清晰探針，洗脫液中NaCl濃度為60mmol/L；按組分在雜交緩沖液的濃度計(jì)，所述雜交緩沖液由0.01％SDS、40％去離子甲酰胺、120mmol·L-1Tris-HC和900mmol·L-1NaCl組成，pH＝7.2； d熒光顯微鏡觀察 玻片在熒光顯微鏡下觀察，在490nm激光下所引起的橙紅色熒光反應(yīng)來定量蝦養(yǎng)殖水體優(yōu)勢(shì)菌群亞硝酸鹽氧化菌，目鏡放大倍數(shù)為10，物鏡放大倍數(shù)Mob為20； 為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，所述步驟(1)的蝦養(yǎng)殖水體樣品中混合微生物總基因組DNA的提取包括如下步驟 a用真空抽濾裝置將水樣過濾，濾液轉(zhuǎn)移到100ml的離心管，10000-13000rpm離心5-10min，吸去上清液，用無菌水重懸沉淀，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管； b加入567μl TE，用吸管反復(fù)吹打使之重懸，.加入30-40μl 10％SDS和3-5μl 20mg/ml蛋白酶K，混勻，37℃溫浴1h； c加100μl 5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80-100μl的5％CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃保溫10-15min，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，4℃于4000-6000rpm下離心10-15min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中； d加入0.6倍體積的異丙醇，沉淀DNA，1ml 70％(100ml95％冷乙醇加36ml蒸餾水稀釋)冷乙醇中洗滌，空氣干燥10-15min，100μl TE緩沖液重懸DNA沉淀。
所述步驟(3)用特異限制性內(nèi)切酶HaeIII酶切DNA是指酶切體系含HaeIII 1ul，10xMBuffer 2ul，DNA≤1ug，滅菌水up to 20ul，37℃水域酶切2-3h，識(shí)別序列GG|CC(G鳥嘌呤，C胞嘧啶)。
所述步驟(5)探針NIT3是Nitrobacterα-proteobacteria的通用探針，序列為5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’，在5’-端用HEX標(biāo)記；所述探針CNIT3序列為5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。
相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所改進(jìn)的T-RFLP-PCR結(jié)合熒光原位雜交技術(shù)應(yīng)用到研究微生物生態(tài)系統(tǒng)中微生物菌群多態(tài)性，具有簡便、快速、靈敏、全面的特點(diǎn)，可以有效地定性和定量分析蝦養(yǎng)殖水體隨著時(shí)間變化微生物生態(tài)多樣性以及優(yōu)勢(shì)菌群組成結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。



圖1為實(shí)施例1(4月1號(hào))取樣微生物菌群T-RFLP熒光圖譜； 圖2-5為實(shí)施例2蝦養(yǎng)殖苗場水體四次(4月1號(hào)，4月16號(hào)，5月1號(hào)，5月16號(hào))取樣微生物菌群T-RFLP熒光圖譜； 圖6-7為實(shí)施例3蝦養(yǎng)殖苗場水體不同深度(40cm和150cm)取樣微生物菌群T-RFLP熒光圖譜。

具體實(shí)施例方式 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，需要說明的是，這些實(shí)施例并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
實(shí)施例1 養(yǎng)殖業(yè)是我國沿海地區(qū)的重要支柱產(chǎn)業(yè)，對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)在其中重要的地位，我國的對(duì)蝦養(yǎng)殖面積達(dá)240萬畝。然而由于病害頻繁發(fā)生，近年我國的對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量低于低谷，越來越多的學(xué)者認(rèn)為，蝦病的根本原因是養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的惡化，污染的環(huán)境與養(yǎng)殖生物之間的惡性循環(huán)導(dǎo)致了病害的持續(xù)爆發(fā)。但是傳統(tǒng)的分離菌種方法只有一部分能被培養(yǎng)，進(jìn)行微生物多樣性分析時(shí)，不能準(zhǔn)確地反映混合菌群的組成和多樣性。本實(shí)驗(yàn)以廣東省中山市東升鎮(zhèn)的蝦養(yǎng)殖苗場為研究對(duì)象，用T-RFLP結(jié)合FISH技術(shù)直接動(dòng)態(tài)檢測微生物菌群變化，對(duì)蝦養(yǎng)殖水體菌群多態(tài)性檢測的步驟和工藝條件如下 取1號(hào)池的水樣，1號(hào)池6米×10米，水深約2米。3月中旬投放南美白對(duì)蝦苗15萬尾，養(yǎng)殖期間管理同正常生產(chǎn)，4月1號(hào)采樣一次，多點(diǎn)采集表層30cm以內(nèi)的水樣2000ml，帶回實(shí)驗(yàn)室真空過濾，濾液-20℃保存。
(1)蝦養(yǎng)殖苗場水體樣品中微生物總DNA的提取 a.濾液轉(zhuǎn)移到100ml的離心管，10000rpm離心5min，吸去上清液，用無菌水重懸沉淀，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管； b.加入567μl TE，用吸管反復(fù)吹打使之重懸，加入30μl 10％SDS和3μl 20mg/ml蛋白酶K，混勻，37℃溫浴1h； c.加100μl 5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80μl的5％CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃保溫10min，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，4℃于4000rpm下離心15min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中； d.加入0.6倍體積的異丙醇，沉淀DNA，1ml 70％(100ml95％冷乙醇加36ml蒸餾水稀釋)冷乙醇中洗滌，空氣干燥15min，100μl TE緩沖液重懸DNA沉淀。
(2)特異性T-RFLP-PCR通用引物，PCR循環(huán)反應(yīng) a.T-RFLP-PCR反應(yīng)體系為25uL，含模板80ng，Taq DNA聚合酶1uL，23mM MgCl 2.5uL，2.5mM的dNTP 1.5uL； b.反應(yīng)參數(shù)94℃變性5min；94℃變性30s，58℃變性30s，72℃變性2min，28次循環(huán)；72℃延伸10min； (3)產(chǎn)物純化，用特異性限制性內(nèi)切酶HaeIII酶切DNA a.PCR產(chǎn)物經(jīng)DyNA quant200濃度測定后，取5ugPCR產(chǎn)物經(jīng)MO BIO UItraClean PCRClean-up DNA Purification kit純化； b.HaeIII酶切DNA，其酶切體系含HaeIII 1ul，10xM Buffer 2ul，DNA0.5ug，滅菌水upto 20ul，37℃水域酶切3h； (4)微生物菌群多態(tài)性結(jié)構(gòu)分析 a.HaeIII酶切DNA片段與具熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)DNA參照物混合后，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)銀染后熒光掃描檢測，帶有熒光標(biāo)記的片斷被檢測，轉(zhuǎn)化為T-RFLP熒光圖譜中的各個(gè)“峰”。每一個(gè)峰作為一個(gè)OUT來進(jìn)行分析物種豐度(richness)、多樣性指數(shù)、物種均度(evenness)； b.DNA的T-RFLP的指紋圖譜條帶切膠回收測序，序列在RDP(ribosomal database project)數(shù)據(jù)庫CHECK-CHIMERA軟件分析鑒定是否是形成嵌合片段，并在RDP數(shù)據(jù)庫中Classification進(jìn)行比對(duì)確定分類，然后將鑒定的序列利用NCBA(National Center forBiotechnology Information)的Blast軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列進(jìn)行相似性比對(duì)，選取同源性大于97％，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹； (5)優(yōu)勢(shì)菌FISH定量檢測 A玻片處理 a玻片清洗熱肥皂水刷洗，自來水沖洗多次，96％酒精浸泡，灼燒，然后在1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸中浸泡24h，自來水沖洗多次，去離子水洗3次； b硅化處理玻片和蓋玻片在1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸中煮沸10min，去離子水洗3次，50℃烘干，錫紙包好4℃保存?zhèn)溆谩２Ｆ?jīng)過硅化處理后具有束水性，能有效防止細(xì)胞丟失； B樣品的采集及預(yù)處理 a取原始菌液500ml，放置半小時(shí)使其沉淀，倒掉上層液體，加入等量新鮮配制培養(yǎng)基，通入空氣，活化1d； b取菌液用去離子水稀釋，取5ml稀釋后樣品至10-4，4000r/min條件下離心，棄上清液，加入5mlPBS，充分搖勻分散。取10μl分散后的菌液涂至玻片上，調(diào)節(jié)pH至6.5； c熱固定將玻片放置到50℃烘箱內(nèi)熱固定2h； d多聚甲醛固定熱固定后，4％(4g多聚甲醛溶于100ml蒸餾水)多聚甲醛(pareforaldehyde，PFA)室溫下固定15min，用PBS室溫沖洗，自然風(fēng)干； e脫水將固定后的樣品，在96％的乙醇中室溫下脫水4min，自然風(fēng)干； C雜交反應(yīng) NIT3是Nitrobacterα-proteobacteria的通用探針，序列為5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’，探針在5’-端用HEX標(biāo)記，競爭性探針CNIT3序列為5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。NIT3和CNIT3探針各0.5μL與9.6μL的雜交液在雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng).。反應(yīng)時(shí)間為2h，雜交溫度46℃； D探針的清洗 雜交盒中取出載玻片放入50ml 48℃雜交洗脫液，洗脫液中NaCl濃度控制為60mmol/L； E鏡檢 玻片在熒光顯微鏡下觀察，在490nm激光下所引起的橙紅色熒光反應(yīng)來定量蝦養(yǎng)殖水體優(yōu)勢(shì)菌群亞硝酸鹽氧化菌，目鏡放大倍數(shù)為10，物鏡放大倍數(shù)Mob為20； 結(jié)果顯示水樣的genescan圖上出現(xiàn)了十幾個(gè)峰，每個(gè)略微突出的部分都可以被認(rèn)為是一種T-RF，表明水樣中至少有十幾種類群的菌，分布在電泳進(jìn)行到15min-30min的范圍內(nèi)，其中在19min-25min出現(xiàn)的峰E、F、I、J占的面積最大，它們的面積之和超過了所有峰總面積的80％，為細(xì)菌菌群中的優(yōu)勢(shì)菌，其中尤以峰1面積最大，表明該T-RF代表的菌在菌落中的數(shù)量最多，優(yōu)勢(shì)條帶切膠回收測序，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析，沒有找到任何相似性高的已知序列，這些片段可能來源于我們還沒有了解的未知菌，這樣對(duì)于蝦養(yǎng)殖水體微生物的認(rèn)識(shí)會(huì)更加全面，而傳統(tǒng)的分離富集培養(yǎng)方法只能培養(yǎng)可培養(yǎng)微生物，微生物的種類、數(shù)量和功能都無法反映蝦養(yǎng)殖水體的真實(shí)情況。
實(shí)施例2 用實(shí)施例1蝦養(yǎng)殖水體環(huán)境進(jìn)行不同時(shí)點(diǎn)的菌群檢測分析，4月至5月每兩周采樣一次(4月1號(hào)，4月16號(hào)，5月1號(hào)，5月16號(hào))。多點(diǎn)采集表層30cm以內(nèi)的水樣4×2000ml，帶回實(shí)驗(yàn)室真空過濾，濾液-20℃保存，對(duì)蝦養(yǎng)殖水體菌群多態(tài)性檢測的步驟和工藝條件如下 (1)蝦養(yǎng)殖苗場水體樣品中微生物總DNA的提取 a.濾液轉(zhuǎn)移到100ml的離心管，13000rpm離心10min，吸去上清液，用無菌水重懸沉淀，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管； b.加入567μl TE，用吸管反復(fù)吹打使之重懸，.加入40μl 10％SDS和5μl 20mg/ml蛋白酶K，混勻，37℃溫浴1h； c.加100μl 5mol/L NaCl，充分混勻，再加入90μl的5％CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃保溫10min，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，4℃于5000rpm下離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中； d.加入0.6倍體積的異丙醇，沉淀DNA，1ml 70％(100ml95％冷乙醇加36ml蒸餾水稀釋)冷乙醇中洗滌，空氣干燥10min，100μl TE緩沖液重懸DNA沉淀； (2)特異性T-RFLP-PCR通用引物，PCR循環(huán)反應(yīng) a.T-RFLP-PCR反應(yīng)體系為25uL，含模板80ng，Taq DNA聚合酶1uL，23mM MgCl 2.0uL，2.5mM的dNTP 1uL； b.反應(yīng)參數(shù)94℃變性3min；94℃變性30s，57℃變性30s，72℃變性2min，28次循環(huán)；72℃延伸10min； (3)產(chǎn)物純化，用特異性限制性內(nèi)切酶HaeIII酶切DNA a.PCR產(chǎn)物經(jīng)DyNA quant200濃度測定后，取5ugPCR產(chǎn)物經(jīng)MO BIO UItraClean PCRClean-up DNA Purification kit純化； b.HaeIII酶切DNA，其酶切體系含HaeIII 1ul，10xM Buffer 2ul，DNA1ug，滅菌水up to20ul，37℃水域酶切2h； (4)微生物菌群多態(tài)性結(jié)構(gòu)分析 a.HaeIII酶切DNA片段與具熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)DNA參照物混合后，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)銀染后熒光掃描檢測，帶有熒光標(biāo)記的片斷被檢測，轉(zhuǎn)化為T-RFLP熒光圖譜中的各個(gè)“峰”。每一個(gè)峰可以作為一個(gè)OUT來進(jìn)行分析物種豐度(richness)、多樣性指數(shù)、物種均度(evenness)； b.DNA的T-RFLP的指紋圖譜條帶切膠回收測序，序列在RDP(ribosomal database project)數(shù)據(jù)庫CHECK-CHIMERA軟件分析鑒定是否是形成嵌合片段，并在RDP數(shù)據(jù)庫中Classification進(jìn)行比對(duì)確定分類，然后將鑒定的序列利用NCBA(National Center forBiotechnology Information)的Blast軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列進(jìn)行相似性比對(duì)，選取同源性大于97％，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹； (5)優(yōu)勢(shì)菌FISH定量檢測 A.玻片處理 a.玻片清洗 熱肥皂水刷洗，自來水沖洗多次，96％酒精浸泡，灼燒，然后在1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸中浸泡24h，自來水沖洗多次，去離子水洗3次； b.硅化處理 玻片和蓋玻片在1％鹽酸中煮沸10min，去離子水洗3次，50℃烘干，錫紙包好4℃保存?zhèn)溆?。玻片?jīng)過硅化處理后具有束水性，能有效防止細(xì)胞丟失； B.樣品的采集及預(yù)處理 a.取原始菌液500ml，放置半小時(shí)使其沉淀，倒掉上層液體，加入等量新鮮配制培養(yǎng)基，通入空氣，活化1d； b.取菌液用去離子水稀釋，取5ml稀釋后樣品至10-4，4000r/min條件下離心，棄上清液，加入5mlPBS，充分搖勻分散。取10μl分散后的菌液涂至玻片上，調(diào)節(jié)pH至6.0； c.熱固定 將玻片放置到50℃烘箱內(nèi)熱固定1h； d.多聚甲醛固定 熱固定后，4％(4g多聚甲醛溶于100ml蒸餾水)多聚甲醛(pareforaldehyde，PFA)室溫下固定10min，用PBS室溫沖洗，自然風(fēng)干； e.脫水將固定后的樣品，在96％的乙醇中室溫下脫水5min，自然風(fēng)干； C.雜交反應(yīng) NIT3是Nitrobacterα-proteobacteria的通用探針，序列為5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’，探針在5’-端用HEX標(biāo)記，競爭性探針CNIT3序列為5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。NIT3和CNIT3探針各0.5μL與9.6μL的雜交液在雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng).。反應(yīng)時(shí)間為2.5h，雜交溫度46℃； D.探針的清洗 雜交盒中取出載玻片放入50ml 48℃雜交洗脫液，洗脫液中NaCl濃度控制為60mmol/L； E.鏡檢 玻片在熒光顯微鏡下觀察，在490nm激光下所引起的橙紅色熒光反應(yīng)來定量蝦養(yǎng)殖水體優(yōu)勢(shì)菌群亞硝酸鹽氧化菌，目鏡放大倍數(shù)為10，物鏡放大倍數(shù)Mob為20。
結(jié)果顯示T-RFLP結(jié)合FISH技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測蝦養(yǎng)殖水體隨著時(shí)間變化，微生物的種類、數(shù)量和種群大小等變化，并且將T-RFLP熒光條帶對(duì)應(yīng)的DNA切膠回收重新擴(kuò)增，熒光圖譜具有很好的再現(xiàn)性和重復(fù)性，對(duì)比各個(gè)圖譜發(fā)現(xiàn)，峰I、II、III、IV在每個(gè)圖上都有，特別是峰II、III、IV的面積之和占有了所有峰總面積的80％，構(gòu)成該菌群結(jié)構(gòu)的主要種群(如表1)。
表1四種T-RF代表的菌數(shù)量
從表1中可以看出，每段片段代表的菌的絕對(duì)數(shù)量也處在動(dòng)態(tài)變化中。就某一片段來看，片段I代表的菌在4月1號(hào)達(dá)最大值，而片段II、III和IV代表的菌在5月1號(hào)達(dá)最大值。片段II、IV代表的菌絕對(duì)數(shù)量變化幅度達(dá)到一個(gè)數(shù)量級(jí)，而片段I、III代表的菌的絕對(duì)數(shù)量則在同一個(gè)數(shù)量級(jí)上輕微波動(dòng)。
實(shí)施例3 用實(shí)施例1蝦養(yǎng)殖水體環(huán)境，T-RFLP結(jié)合FISH技術(shù)直接檢測蝦塘水體微生物菌群垂直(深度40cm和150cm)分布變化，2009年6月5號(hào)分別在表層(40cm)和深層(150cm)隨機(jī)多點(diǎn)取樣一次2×2000ml，帶回實(shí)驗(yàn)室真空過濾，濾液-20℃保存，對(duì)蝦養(yǎng)殖水體菌群多態(tài)性檢測的步驟和工藝條件如下 (1)蝦養(yǎng)殖苗場水體樣品中微生物總DNA的提取； a.濾液轉(zhuǎn)移到100ml的離心管，12000rpm離心8min，吸去上清液，用無菌水重懸沉淀，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管； b.加入567μl TE，用吸管反復(fù)吹打使之重懸，.加入35μl 10％SDS和4μl的20mg/ml蛋白酶K，混勻，37℃溫浴1h； c.加100μl 5mol/LNaCl，充分混勻，再加入100μl的5％CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃保溫10min，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，4℃于6000rpm下離心15min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中； d.加入0.6倍體積的異丙醇，沉淀DNA，1ml 70％(100ml95％冷乙醇加36ml蒸餾水稀釋)冷乙醇中洗滌，空氣干燥15min，100μl TE緩沖液重懸DNA沉淀； (2)特異性T-RFLP-PCR通用引物，PCR循環(huán)反應(yīng) a.T-RFLP-PCR反應(yīng)體系為25uL，含模板80ng，Taq DNA聚合酶1uL，23mM MgCl 2.0uL，2.5mM的dNTP 1uL； b.反應(yīng)參數(shù)94℃變性5min；94℃變性30s，57℃變性30s，72℃變性2min，28次循環(huán)；72℃延伸10min； (3)產(chǎn)物純化，用特異性限制性內(nèi)切酶HaeIII酶切DNA； a.PCR產(chǎn)物經(jīng)DyNA quant200濃度測定后，取5ugPCR產(chǎn)物經(jīng)MO BIO UItraClean PCRClean-up DNA Purification kit純化； b.HaeIII酶切DNA，其酶切體系含HaeIII 1ul，10xM Buffer 2ul，DNA0.8ug，滅菌水upto 20ul，37℃水域酶切3h； (4)微生物菌群多態(tài)性結(jié)構(gòu)分析 a HaeIII酶切DNA片段與具熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)DNA參照物混合后，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)銀染后熒光掃描檢測，帶有熒光標(biāo)記的片斷被檢測，轉(zhuǎn)化為T-RFLP熒光圖譜中的各個(gè)“峰”。每一個(gè)峰可以作為一個(gè)OUT來進(jìn)行分析物種豐度(richness)、多樣性指數(shù)、物種均度(evenness)； b DNA的T-RFLP的指紋圖譜條帶切膠回收測序，序列在RDP(ribosomal database project)數(shù)據(jù)庫CHECK-CHIMERA軟件分析鑒定是否是形成嵌合片段，并在RDP數(shù)據(jù)庫中Classification進(jìn)行比對(duì)確定分類，然后將鑒定的序列利用NCBA(National Center forBiotechnology Information)的Blast軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列進(jìn)行相似性比對(duì)，選取同源性大于97％，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹； (5)優(yōu)勢(shì)菌FISH定量檢測 A玻片處理 a玻片清洗熱肥皂水刷洗，自來水沖洗多次，96％酒精浸泡，灼燒，然后在1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸中浸泡24h，自來水沖洗多次，去離子水洗3次； b硅化處理玻片和蓋玻片在1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸中煮沸10min，去離子水洗3次，50℃烘干，錫紙包好4℃保存?zhèn)溆?。玻片?jīng)過硅化處理后具有束水性，能有效防止細(xì)胞丟失； B樣品的采集及預(yù)處理 a取原始菌液500ml，放置半小時(shí)使其沉淀，倒掉上層液體，加入等量新鮮配制培養(yǎng)基，通入空氣，活化1d； b取菌液用去離子水稀釋，取5ml稀釋后樣品至10-4，4000r/min條件下離心，棄上清液，加入5mlPBS，充分搖勻分散。取10μl分散后的菌液涂至玻片上，調(diào)節(jié)pH至6.3； c熱固定將玻片放置到50℃烘箱內(nèi)熱固定2h； d多聚甲醛固定熱固定后，4％(4g多聚甲醛溶于100ml蒸餾水)多聚甲醛(pareforaldehyde，PFA)室溫下固定15min，用PBS室溫沖洗，自然風(fēng)干； e脫水將固定后的樣品，在96％的乙醇中室溫下脫水3min，自然風(fēng)干； C.雜交反應(yīng) NIT3是Nitrobacterα-proteobacteria的通用探針，序列為5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3，，探針在5’-端用HEX標(biāo)記，競爭性探針CNIT3序列為5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。NIT3和CNIT3探針各0.5μL與9.6μL的雜交液在雜交盒內(nèi)進(jìn)行雜交反應(yīng).。反應(yīng)時(shí)間為3h，雜交溫度46℃； D探針的清洗 雜交盒中取出載玻片放入50ml 48℃雜交洗脫液，洗脫液中NaCl濃度控制為60mmol/L； E鏡檢 玻片在熒光顯微鏡下觀察，在490nm激光下所引起的橙紅色熒光反應(yīng)來定量蝦養(yǎng)殖水體優(yōu)勢(shì)菌群亞硝酸鹽氧化菌，目鏡放大倍數(shù)為10，物鏡放大倍數(shù)Mob為20。
結(jié)果顯示T-RFLP圖譜6菌群多樣性計(jì)算物種豐度(richness)S＝4，Shannon-Weiner指數(shù)H＝1.26，物種均度(evenness)E＝0.07；T-RFLP圖譜7菌群多樣性計(jì)算物種豐度(richness)S＝9.05，Shannon-Weiner指數(shù)H＝3.36，物種均度(evenness)E＝0.47，不同深度的微生物有很大變化，這可能與養(yǎng)殖水體人工小生態(tài)系統(tǒng)，承載負(fù)荷的能力差，生物量多，生物種類少，環(huán)境因子易發(fā)生變化，容易引起細(xì)菌數(shù)量大幅波動(dòng)，其中500bp大小的條帶含5種序列片斷，組成情況33％，25％，4％，28％和10％；其中800bp大小的條帶含有9種序列片斷，組成情況64％，23％，3％，3％，2％，1％，1％，1％和1％；其中1000bp大小的條帶含有4種序列片斷，組成情況是84.2％，10.2％，4.6％和0.9％，并計(jì)算了圖譜6與圖譜7中Sorenson配對(duì)比較相似性系數(shù)(pairwise similarity coefficient Cs)最低相似性為86％和83％，說明圖譜中的菌群具有很好的連續(xù)性和變化性。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說明T-RFLP結(jié)合FISH方法，可用于監(jiān)測蝦養(yǎng)殖水體復(fù)雜微生物菌群的結(jié)構(gòu)特征及優(yōu)勢(shì)亞硝酸鹽氧化菌群的動(dòng)態(tài)變化。
權(quán)利要求
1.一種檢測蝦養(yǎng)殖水體微生物菌群多態(tài)性的方法，其特征在于包括如下步驟和工藝條件
(1)蝦養(yǎng)殖水體樣品中混合微生物總基因組DNA的提?。?br> (2)設(shè)計(jì)特異性T-RFLP-PCR通用引物，進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)所述特異性T-RFLP-PCR通用引物的上游引物為5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物為5′-CCG TCA ATT CCT TTRAGT TT-3′，5’端用6-fam熒光標(biāo)記；PCR反應(yīng)體系是23mM MgCl2 2.0-2.5uL，2.5mM的dNTP1-2uL；退火溫度為57-58℃；
(3)產(chǎn)物純化，用特異性限制性內(nèi)切酶HaeIII酶切DNA酶切體系DNA≤1ug；產(chǎn)物純化是指PCR產(chǎn)物經(jīng)DyNA quant200濃度測定后，取5ugPCR產(chǎn)物經(jīng)MO BIO UItraClean PCRClean-up DNA Purification kit純化；
(4)微生物菌群多態(tài)性結(jié)構(gòu)分析HaeIII酶切DNA片段與具熒光標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)DNA參照物混合后，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離，銀染后熒光掃描檢測，帶有熒光標(biāo)記的片斷被檢測，轉(zhuǎn)化為T-RFLP熒光圖譜中的各個(gè)峰，每一個(gè)峰作為一個(gè)末端熒光標(biāo)記片段或操作分類單元來進(jìn)行物種豐度、多樣性指數(shù)和物種均度分析，然后對(duì)DNA的T-RFLP的指紋圖譜條帶切膠回收測序，序列通過RDP數(shù)據(jù)庫CHECK-CHIMERA軟件分析鑒定是否是形成嵌合片段，并在RDP數(shù)據(jù)庫中Classification進(jìn)行比對(duì)確定分類，將鑒定的序列利用NCBA的Blast軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列進(jìn)行相似性比對(duì)，選取同源性大于97％，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；所述1％瓊脂糖凝膠是指1g瓊脂糖溶于100ml蒸餾水；
(5)優(yōu)勢(shì)菌熒光原位雜交技術(shù)定量檢測
a對(duì)實(shí)驗(yàn)所需玻片進(jìn)行處理
對(duì)玻片進(jìn)行清洗，硅化處理，以及明膠涂片制備；
b樣品采集及處理
取原始菌液，加入等量新鮮配制培養(yǎng)基，通入空氣，活化1-2天，用去離子水稀釋至10-4，隨后離心，棄上清液，加入PBS，充分搖勻分散，調(diào)節(jié)pH至6.0-6.5，調(diào)節(jié)pH的目的是使聚集在一起的硝化細(xì)菌能更好的分散；再將玻片放置到烘箱內(nèi)熱固定，時(shí)間為1-3h，再用4％多聚甲醛室溫下固定10-20min，沖洗風(fēng)干，最后將固定后的樣品用乙醇脫水3-5min；所述4％多聚甲醛為4g多聚甲醛溶于100ml蒸餾水；
c雜交
將探針NIT3及探針CNIT3用HEX標(biāo)記，將標(biāo)記好的探針與雜交緩沖液(0.01％SDS，40％去離子甲酰胺(DAF)，Tris-HCl(pH＝7.2)20mmol·L-1，NaCl 900mmol·L-1，pH＝7.2)混合于密閉雜交盒中，雜交溫度控制在46℃，雜交時(shí)間為2-3h，雜交后用洗脫液清晰探針，洗脫液中NaCl濃度為60mmol/L；按組分在雜交緩沖液的濃度計(jì)，所述雜交緩沖液由0.01％SDS、40％去離子甲酰胺、120mmol·L-1Tris-HC和900mmol·L-1 NaCl組成，pH＝7.2；
d.熒光顯微鏡觀察
玻片在熒光顯微鏡下觀察，在490nm激光下所引起的橙紅色熒光反應(yīng)來定量蝦養(yǎng)殖水體優(yōu)勢(shì)菌群亞硝酸鹽氧化菌，目鏡放大倍數(shù)為10，物鏡放大倍數(shù)Mob為20；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測蝦養(yǎng)殖水體微生物菌群多態(tài)性的方法，其特征在于所述步驟(1)的蝦養(yǎng)殖水體樣品中混合微生物總基因組DNA的提取包括如下步驟
a用真空抽濾裝置將水樣過濾，濾液轉(zhuǎn)移到100ml的離心管，10000-13000rpm離心5-10min，吸去上清液，用無菌水重懸沉淀，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管；
b加入567μl TE，用吸管反復(fù)吹打使之重懸，加入30-40μl 10％SDS和3-5μl 20mg/ml蛋白酶K，混勻，37℃溫浴1h；
c加100μl 5mol/L NaCl，充分混勻，再加入80-100μl的5％CTAB/NaCl溶液，混合并置65℃保溫10-15min，加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，4℃于4000-6000rpm下離心10-15min，將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；
d加入0.6倍體積的異丙醇，沉淀DNA，1ml 70％冷乙醇中洗滌，空氣干燥10-15min，100μl TE緩沖液重懸DNA沉淀；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測蝦養(yǎng)殖水體微生物菌群多態(tài)性的方法，其特征在于所述步驟(3)用特異限制性內(nèi)切酶HaeIII酶切DNA是指酶切體系含HaeIII 1ul，10x M Buffer 2ul，DNA≤1ug，滅菌水up to 20ul，37℃水域酶切2-3h，識(shí)別序列GG|CC(G鳥嘌呤，C胞嘧啶)；
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測蝦養(yǎng)殖水體微生物菌群多態(tài)性的方法，其特征在于所述步驟(5)探針NIT3是Nitrobacter α-proteobacteria的通用探針，序列為5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’，在5’-端用HEX標(biāo)記；所述探針CNIT3序列為5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對(duì)蝦養(yǎng)殖水體菌群多態(tài)性檢測的方法，該方法包括以下步驟(1)蝦養(yǎng)殖水體樣品中混合微生物總基因組DNA的提取；(2)設(shè)計(jì)特異性T-RFLP-PCR通用引物，PCR循環(huán)反應(yīng)；(3)產(chǎn)物純化，用特異限制性內(nèi)切酶HaeIII酶切DNA；(4)1％瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，熒光掃描；(5)微生物菌群多態(tài)性結(jié)構(gòu)分析；(6)菌群優(yōu)勢(shì)菌熒光原位雜交技術(shù)定量檢測。本發(fā)明改進(jìn)T-RFLP-PCR結(jié)合FISH檢測技術(shù)，并且用熒光標(biāo)記特異性引物，與現(xiàn)代技術(shù)相比有重復(fù)性高、靈敏、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定等特點(diǎn)，可以定性和定量分析蝦養(yǎng)殖水體隨著時(shí)間變化微生物生態(tài)多樣性以及優(yōu)勢(shì)菌群組成結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101724690SQ20091004228
公開日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月31日
發(fā)明者林煒鐵, 高利海, 張星, 朱雅楠, 羅劍飛 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)