專利名稱：一種基于金納米殼的抗氧化劑清除H₂O₂能力的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米生物分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于金納米殼的抗氧化劑 清除H202能力的測定方法。
背景技術(shù)：
機(jī)體代謝過程中活性氧物種(ROS )不斷地通過非酶促反應(yīng)和酶促反應(yīng)產(chǎn)生， 在正常生理情況下，ROS的生成與清除處于動態(tài)平衡，可維持有利無害的極低 水平。由于內(nèi)源性或外源性刺激使機(jī)體代謝異常而產(chǎn)生大量ROS,或機(jī)體抗氧 化物質(zhì)不足，使促氧化劑/抗氧化劑間平衡失常，則使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)， 可氧化損傷生物分子，并進(jìn)一步引起細(xì)胞死亡和組織損傷，與很多疾病過程相關(guān)。 由此可見，抗氧化劑對于ROS的清除能力是將其維持在一個較低水平，不會對
人體產(chǎn)生健康威脅的重要考察指標(biāo)。H202是一種重要的活性氧物種，它在人體
生理條件下可通過多種過氧化物酶體產(chǎn)生，如葡萄糖氧化酶、D-氨基酸氧化酶 等。此外，超氧自由基在超氧化物岐化酶的催化作用下也可產(chǎn)生H202。 H202和 超氧陰離子自由基(02-) —起可導(dǎo)致細(xì)胞損傷，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成其他ROS，如 羥自由基(OH)等。H202作為活性氧物種的重要組成部分，抗氧化劑對其清除 能力的大小是評價蔬菜、水果及保健品等對人體健康和保健功效的重要指標(biāo)，同 時也是蔬菜、水果及保健品在生產(chǎn)和保存過程中質(zhì)量評價的重要指標(biāo)。目前，現(xiàn) 有的評價抗氧化劑清除11202能力的方法主要包括以下幾種(l)利用&02本身 在230 nm處的紫外吸收現(xiàn)象，當(dāng)存在抗氧化劑時，其吸收峰強(qiáng)度明顯減弱。但 由于待測樣品在該波長處也有可能存在吸收峰，就降低了該檢測方法的準(zhǔn)確性。 (2) 11202可以在，束才艮過氧化物酶的作用下將7-幾基-6-曱氧基香豆素氧化成一 種非熒光產(chǎn)物，當(dāng)存在H202清除劑時，7-羥基-6-曱氧基香豆素的氧化被抑制， 并且這種清除能力可以通過熒光光度計來檢測。另一種廣泛使用的熒光光度法基 于homovanillic acid (HVA)在H202和辣根過氧化物酶的作用下形成一種穩(wěn)定的 具有熒光效應(yīng)的聯(lián)苯二聚體，而H202清除劑的存在會阻礙HVA的氧化。這類基 于過氧化物酶的方法對于抗氧化劑是直接與&02反應(yīng)還是與11202和酶反應(yīng)的 中間產(chǎn)物相作用不能做出明確的判定。此外，某些抗氧化劑，如抗壞血酸、櫟精 二水合物、硫醇等本身即是過氧化物酶的底物，那么對于其清除11202的能力也 會產(chǎn)生錯誤的評價。(3)—種非酶的過氧草酸脂類化學(xué)發(fā)光檢測法。該方法利用H202和咪峻催化的芳香草酸脂的氧化形成一種高能量的中間產(chǎn)物dioxetanedione, 它再將能量傳遞給熒光團(tuán)9，10-diphenylanthracene，該熒光團(tuán)/人激發(fā)態(tài)回到基態(tài) 的過程即以光的形式釋放出能量。當(dāng)反應(yīng)體系中存在清除11202的化合物時，該 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)將會被抑制，可通過熒光計來定量檢測。該反應(yīng)是在非極性環(huán)境中 進(jìn)行的，因此該方法通常被用來檢測親脂性抗氧化劑清除11202的能力。該方法 的主要缺陷在于被用作熒光團(tuán)的9,10-diphenylanthracene是一種致癌物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便且檢測靈敏度高的基于金納米殼的抗氧 化劑清除H202能力的測定方法。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
本發(fā)明所述的測定抗氧化劑清除H202能力的方法，即利用在&02介導(dǎo)金納 米殼形成體系中加入抗氧化劑后光譜性質(zhì)的變化來測定抗氧化劑清除11202的能 力。
本發(fā)明所述的測定抗氧化劑清除H202能力的方法，即
1. 氨基化Si02膠體微球，再吸附金納米顆粒(GNPs)形成Si02/GNPs復(fù)合物顆粒。
2. 選擇反應(yīng)體系終濃度為200 nM的H202和不同濃度的抗氧化劑混合反應(yīng)，再 加入Si02/GNPs復(fù)合物顆粒和氯金酸，Si02/GNPs復(fù)合物顆粒濃度為6.7x10—11 m，氯金酸濃度為3.3x1()4m,混合攪拌。
3. 利用加入抗氧化劑前后混合液中Si02/GNPs復(fù)合物顆粒光譜性質(zhì)的變化來計 算抗氧化劑清除H202的能力。
本發(fā)明具體采用如下技術(shù)方案來解決所提出的技術(shù)問題 一種基于金納米殼的抗氧化劑清除H202能力的測定方法，步驟為 1.將金納米顆粒與氨基化的Si02膠體溶液混合、攪拌，所加的金納米顆粒的量 應(yīng)使金納米顆粒在氨基化的Si02小球表面的覆蓋率理論計算值不少于30%, 金納米顆粒通過靜電吸附作用吸附于氨基化的Si02膠體顆粒表面，得 Si02/GNPs復(fù)合物顆粒水溶液，在對Si02/GNPs復(fù)合物顆粒水溶液進(jìn)行離心 處理后，除去上層未被吸附的金納米顆粒，再在除去未被吸附的金納米顆粒 后的SiCVGNPs復(fù)合物顆粒水溶液中加純水稀釋，并使沉淀分散于純水中得 到純化的SiCVGNPs復(fù)合物顆粒，Si02/GNPs復(fù)合物顆粒在稀釋后的 SiCVGNPs復(fù)合物顆粒水溶液中的濃度為2xl01Q個/ml^2xl012個/mL;2. 在0.01 M的磷酸鹽緩沖溶液中加入碳酸鉀作為反應(yīng)體系的穩(wěn)定劑和質(zhì)量體 積比濃度為1%的氯金酸溶液，磷酸鹽緩沖溶液、碳酸鉀及氯金酸溶液的體積 mL、質(zhì)量mg、體積mL比為20~500:5~125:0.3~7.5,攪拌均勻，于4。C陳化 至少24h，得到碳酸鉀做穩(wěn)定劑的氯金酸溶液；
3. 在O.Ol M的磷酸鹽緩沖溶液中加入待檢測的抗氧化劑與H202,(待檢測的抗 氧化劑在反應(yīng)體系中的摩爾濃度為3 pM~1200 nM, H202在反應(yīng)體系中的摩 爾濃度為50 pM~500 pM),磷酸鹽緩沖溶液、待檢測的抗氧化劑及H202的 體積比為0.6~15:0.02~0.5:0.04~1,混合并反應(yīng)1~5 min后，再向其中加入 Si02/GNPs復(fù)合物顆粒水溶液和步驟2所得的碳酸鉀做穩(wěn)定劑的氯金酸溶液， 此時Si02/GNPs復(fù)合物顆粒在反應(yīng)體系中的終摩爾濃度為1.34xl0"1 M~13.4xlO-11M,氯金酸的終摩爾濃度為0.66x104m 6.6x10^M,反應(yīng)2~20 min,剩余的H202將氯金酸還原成金納米顆粒并沉積在Si02/GNPs復(fù)合物顆 粒表面，形成包覆不完整的金納米殼；將上述反應(yīng)形成的包覆不完整的金納 米殼在紫外分光光度計下進(jìn)行表征，記錄包覆不完整的金納米殼水溶液的最 大吸收波長，記為W,;將不加抗氧化劑時由相同濃度H202制備得到的金納 米殼水溶液的最大吸收波長記為W;將不加抗氧化劑和11202時相同濃度 Si02/GNPs復(fù)合物顆粒水溶液的最大吸收波長記為WQ，通過公式
『—『、孺％,計算得該濃度的抗氧化劑對H202的清除率百分?jǐn)?shù)；
4. 根據(jù)步驟3計算所得的抗氧化劑對H202的清除率數(shù)值大小，通過增加和/或 減小抗氧化劑的濃度，得到不少于4個不同濃度的抗氧化劑，分別重復(fù)步驟 3,計算得不同濃度下抗氧化劑對H202的清除率，以所得到的抗氧化劑對H202
的清除率中最小值為下限、最大值為上限，構(gòu)成抗氧化劑對H202的清除率范
圍，如果抗氧化劑對11202的清除率范圍不能覆蓋抗氧化劑的ICso值，即抗 氧化劑清除50% H202所需要的濃度，則重復(fù)步驟4,直到IC5o值落入抗氧化 劑對H202的清除率范圍；
5. 根據(jù)步驟3-步驟4得到的抗氧化劑對H202的清除率數(shù)據(jù)，采用ORIGIN繪 圖軟件，繪制出H202的清除率與相應(yīng)的抗氧化劑濃度的關(guān)系曲線，并從圖中 讀出清除率為50%時抗氧化劑的濃度為c，單位為M， c即為所選抗氧化劑
的ICso值，將C取倒數(shù)，即1/C為抗氧化劑清除H202能力的大小，單位為M"。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點
1. 本發(fā)明在紫外-可見分光光度計的操作下即可完成，操作簡便，不需要復(fù)雜的 儀器設(shè)備。
2. 實驗操作過程中不涉及酶反應(yīng)，實驗原理明確，也不涉及有毒有害致癌物質(zhì)等，對于環(huán)境和人體不會產(chǎn)生任何危害作用。
3. 實驗成本低，所需試劑均為實驗室常見試劑，納米材料的制備方便，單個反 應(yīng)只需幾分鐘即可完成，操:作時間短。
4. 本發(fā)明中將金納米殼的等離激元共振吸收峰波長用于檢測信號，與以往將吸
光度作為檢測信號的光學(xué)測定方法相比，峰波長從可見光區(qū)遷移至近紅外區(qū)
域，遷移量大，檢測更加靈敏，從說明書附圖的圖4單寧酸檢測實例中可以 看出，從a g的光諳變化中，吸收峰的峰波長遷移了大約220nm，而吸光度 的遷移值只有0.523。
5. 由于峰波長的變化對應(yīng)于溶液顏色的明顯變化，而之前以吸光度作為檢測信 號的方法中，溶液顏色變化不明顯，故該方法還可用于定性的可視化檢測中。
6. 本發(fā)明對于水溶性和脂溶性抗氧化劑均適用，檢測范圍廣泛。


圖1是實驗過程原理示意圖。
圖2是抗氧化劑清除H202能力計算原理圖。
圖3是6種抗氧化劑對11202的清除率與濃度關(guān)系曲線圖。
圖4是反應(yīng)體系中加入不同濃度單寧酸后的紫外-可見光謙圖(a: SiCVGNPs,
b-g:單寧酸濃度依次減小從200 pM~0 )。 圖5是(a) Si02/GNPs復(fù)合物顆粒的TEM圖及(b) - (d)是反應(yīng)體系中加入不
同濃度單寧酸后Si(VGNPs復(fù)合物顆粒生長狀態(tài)的TEM圖，(b) 200 pM，
(c) 25岸，(d) 0 一。 圖6是實驗步驟示意圖。
具體實施方式
實施例1
一種基于金納米殼的抗氧化劑清除H202能力的測定方法，步驟為 1.將金納米顆粒與氨基化的Si02膠體溶液混合、攪拌，所加的金納米顆粒的量 應(yīng)使金納米顆粒在氨基化的Si02小球表面的覆蓋率理論計算值不少于30%, 例如本實施例分別選擇30%、 50%、 70%、 90%,金納米顆粒通過靜電吸 附作用吸附于氨基化的Si02膠體顆粒表面，得SiCVGNPs復(fù)合物顆粒水溶 液，在對SiCVGNPs復(fù)合物顆粒水溶液進(jìn)行離心處理后，除去上層未被吸附 的金納米顆粒，再在除去未被吸附的金納米顆粒后的SiCVGNPs復(fù)合物顆粒 水溶液中加純7K稀釋，并使沉淀a于純水中得到純化的SiCVGNPs復(fù)合物 顆粒，SiCVGNPs復(fù)合物顆粒在稀釋后的SiCVGNPs復(fù)合物顆粒水溶液中的 濃度為2xl01Q個/mL 2xl012個/mL，例如，本實施例分別稀釋到2xl01Q個/mL、 lxlO"個/mL 、 5xlO"個/mL 、 2xl(^個/mL;
2. 在0.01 M的磷酸鹽緩沖溶液中加入碳酸鉀作為反應(yīng)體系的穩(wěn)定劑和質(zhì)量體 積比濃度為1%的氯金酸溶液，磷酸鹽緩沖溶液、碳酸鉀及氯金酸溶液的體 積mL、質(zhì)量mg、體積mL比為20~500:5~125:0.3~7.5,例如，本實施例分 別選擇20:5:0.3， 100:25:1.5, 200:75:5, 500:125:7.5,攪拌均勻，于4。C陳化 至少24h,例如，本實施例分別選擇24h、 36h、 48h, 60h，得到碳酸鉀做穩(wěn) 定劑的氯金酸溶液；
3. 在0.01M的磷酸鹽緩沖溶液中加入待檢測的抗氧化劑與H202,(待檢測的抗 氧化劑在反應(yīng)體系中的摩爾濃度為3nM 1200pM,例如，本實施例分別選擇 3pM 、 200pM 、 500pM 、 1200pM ， H202在反應(yīng)體系中的摩爾濃度為 50pM 500nM, 例如，本實施例分別選擇50^M、 100pM、 200nM、 500pM), 磷酸鹽緩沖溶液、待檢測的抗氧化劑及H202的體積比為 0.6~15:0.02~0.5:0.04~1,傷j(口，本實施存j分別選擇0.6:0.02:0.04， 1:0.1:0.06, 3:0.2:0.1, 15:0.5:1,混合并反應(yīng)1 5min后，例如，本實施例分別選擇1 min, 2min， 3 min， 5 min,再向其中加入Si02/GNPs復(fù)合物顆粒水溶液和步驟2 所得的碳酸鉀做穩(wěn)定劑的氯金酸溶液，此時SiCVGNPs復(fù)合物顆粒在反應(yīng)體 系中的終摩爾濃度為1.34x10—11 M 13.4x10—11 M，例如，本實施例分別選擇 1.34xl(T"M, 5xlO"M， 10xl(T"M， 13.4xl(T"M，氯金酸的終摩爾濃度為 0.66x104m 6.6x10^M，例如，本實施例分別選擇0.66xl0"4M， 2xlO^M， 4xlO-4M， 6.6xlO^M，反應(yīng)2~20 min,侈':i口,本實施侈'j分另!]選捧2 min, 5 min， 10 min, 20 min,剩余的11202將氯金酸還原成金納米顆粒并沉積在Si02/GNPs 復(fù)合物顆粒表面，形成包覆不完整的金納米殼；將上述反應(yīng)形成的包覆不完 整的金納米殼在紫外分光光度計下進(jìn)行表征，記錄包覆不完整的金納米殼水 溶液的最大吸收波長，記為W,;將不加抗氧化劑時由相同濃度11202制備得 到的金納米殼水溶液的最大吸收波長記為W;將不加抗氧化劑和&02時相 同濃度SiCVGNPs復(fù)合物顆粒水溶液的最大吸收波長記為WQ，通過公式
『一『1 x700%,計算得該濃度的抗氧化劑對H202的清除率百分?jǐn)?shù)；
4. 根據(jù)步驟3計算所得的抗氧化劑對H202的清除率數(shù)值大小，通過增加和/或 減小抗氧化劑的濃度，得到不少于4個不同濃度的抗氧化劑，分別重復(fù)步驟 3,計算得不同濃度下抗氧化劑對11202的清除率，以所得到的抗氧化劑對
&02的清除率中最小值為下限、最大值為上限，構(gòu)成抗氧化劑對H202的清
除率范圍，介于0-100%之間，如果抗氧化劑對11202的清除率范圍不能覆蓋 抗氧化劑的IC5Q值，則重復(fù)步驟4,直到IC5Q值落入抗氧化劑對H202的清 除率范圍；
5. 根據(jù)步驟3-步驟4得到的抗氧化劑對H202的清除率凄t據(jù)，采用ORIGIN繪
8圖軟件，繪制出H202的清除率與相應(yīng)的抗氧化劑濃度的關(guān)系曲線，并從圖 中讀出清除率為50%時抗氧化劑的濃度為c,單位為M, c即為所選抗氧化 劑的ICso值，將c取倒數(shù)，即1/C為抗氧化劑清除H202能力的大小，單位為 M人
實施例2
1. 金納米顆粒(GNPs)的制備 利用還原氯金酸的方法制#納米顆粒。將1 g氯金酸溶于100 mL純水中， 得1%氯金酸水溶液，4。C冷藏。取200 mL預(yù)冷的純水，加入3 mL濃度為 1%的氯金酸水溶液和1 mL濃度為0.2 M的碳酸鉀水溶液，攪拌混勻，再向 其中迅速加入9 mL濃度為0.5 mg/mL的硼氫化鈉水溶液，混合溶液由深褐色 變?yōu)榫萍t色，即得粒徑在5 nm左右的金納米顆粒。再攪拌10 min,將制備得 到的金納米顆粒水溶液置于4'C冷藏保存。
2. Si02膠體的氨基化
取40 mL濃度為0.013 g/mL的Si02醇溶膠，向其中加入60 pL的氨基丙 基三乙氧基硅烷(APTES),于70。C下攪拌反應(yīng)3h,反應(yīng)結(jié)束后，將上述溶 液置于離心管中，以10000 rpm離心20 min，取底部Si02溶質(zhì)，加無水乙醇 超聲分散，以上步驟重復(fù)3次，以除去多余的APTES。
3. SiCVGNPs復(fù)合物顆粒的制備
取500 pL氨基化的Si02醇溶膠，加入20 mL無水乙醇稀釋，將稀釋后的Si02 醇溶膠逐滴加入200 mL金納米顆粒中，約30 min滴完，不斷攪拌，帶負(fù)電荷 的金納米顆粒通過靜電作用吸附于帶正電荷的Si02小球表面，形成 Si02/GNPs復(fù)合物顆粒，繼續(xù)攪拌1 h后，將上述混合液置于離心管中，以 3000 rpm離心20 min，取底部Si02/GNPs復(fù)合物顆粒，加純水超聲^t,以 上步驟重復(fù)3次，得純化的Si02/GNPs復(fù)合物顆粒水溶液。
4. K2C03/HAuCl4混合溶液的配制
取100 mL濃度為0.01 M的磷酸鹽緩沖溶液，向其中加入25 mg K2C03,攪 拌10min,再向其中加入1.5mL濃度為1%的氯金酸溶液，攪拌20min后置 于4°C陳化至少24 h后使用。
5. 阿魏酸清除H202能力的測定
取3 mL濃度為0.01 M的磷酸鹽緩沖溶液，向其中加入0.1 mLH202和0.2 mL 阿魏酸，11202在反應(yīng)體系中的終濃度為200 [iM，阿魏酸在反應(yīng)體系中的終 濃度為3 nM,攪拌2 min，再分別向其中加入0.5 mL Si02/GNPs復(fù)合物顆粒 水溶液和3 mLK2C03/HAuCl4混合溶液，反應(yīng)5 min，剩余的11202將氯金酸 還原成金納米顆粒并沉積在Si02/GNPs復(fù)合物顆粒表面，形成包覆不完整的
9金納米殼。反應(yīng)后溶液用紫外-可見分光光度計進(jìn)行表征，最大吸收波長記為 Wj。參比實驗將0.2 mL的阿魏酸替換為0.2 mL濃度為0.01 M的磷酸鹽緩沖
溶液，其余不變，由相同濃度H202制備得到的金納米殼水溶液的最大吸收波
長記為W。對照實驗將0.1 mL的H202和0.2 mL的阿魏酸替換為0.3 mL濃 度為0.01 M的磷酸鹽緩沖溶液，其余不變，記錄相同濃度Si02/GNPs復(fù)合物
顆粒水溶液的最大吸收波長為WQ。利用公式^-x7W%，計算得3 nM
的阿魏酸對H202的清除率百分?jǐn)?shù)為14.3%。
增加阿魏酸的濃度， -使其在反應(yīng)體系中的終濃度分別為5 pM, 10 [iM， 50 pM, 100 ^M。其余4喿作步驟同上，計算得5nM, 10pM， 50nM， 100pM的阿魏 酸對11202的清除率百分?jǐn)?shù)分別為27.4%, 65.9%, 83.4%， 90.1%。 6.根據(jù)上述實驗得到的不同濃度阿魏酸對H202的清除率數(shù)據(jù)，采用ORIGIN繪 圖軟件，繪制出H202的清除率與相應(yīng)的阿魏酸濃度的關(guān)系曲線，并從圖中讀 出清除率為50%時阿魏酸的濃度為8 ^M,即阿魏酸的ICso值為8 pM,將IC50 值取倒數(shù)，得12.5x1 O^hM-1,即為阿魏酸清除11202能力的大小。
實施例3
1. 同實施例2步驟1。
2. 同實施例2步驟2。
3. 同實施例2步驟3。
4. 同實施例2步驟4。
5. 酒石酸清除H202能力的測定
選擇酒石酸在反應(yīng)體系中的終濃度為1200 pM，其余實驗操作步驟同實施例 2步驟5，計算得1200 pM的酒石酸對H202的清除率百分?jǐn)?shù)為92.5%。減小 酒石酸的濃度，使其在反應(yīng)體系中的終濃度分別為800 400 ^M, 200 ^M， 50(xM。重復(fù)以上操作步驟，計算得800nM, 400 200 ^M, 50pM的酒 石酸對11202的清除率百分?jǐn)?shù)分別為90.1%, 62.9%, 36.7%， 9.1%。
6. 根據(jù)上述實驗得到的不同濃度酒石酸對H202的清除率數(shù)據(jù)，采用ORIGIN繪
圖軟件，繪制出H202的清除率與相應(yīng)的酒石酸濃度的關(guān)系曲線，并從圖中讀
出清除率為50%時酒石酸的濃度為273 ^M，即酒石酸的ICso為273 nM,將 IC50值取倒數(shù)，得0.36 x 10-2 pM",即為酒石酸清除H202能力的大小。
實施例4
1. 同實施例2步驟1。
2. 同實施例2步驟2。
3. 同實施例2步驟3。
104. 同實施例2步驟4。5. 檸檬酸清除H202能力的測定選擇檸檬酸在反應(yīng)體系中的終濃度為100 ^M，其余實驗才喿作步驟同實施例2 步驟5,計算得100 ^M的檸檬酸對H202的清除率百分?jǐn)?shù)為48.7%。增加、 減'J、檸檬酸的濃度，4吏其在反應(yīng)體系中的終濃度分別為400 ， 150 ， 20 pM， 5pM。重復(fù)以上操作步驟，計算得400pM, 15020 nM, 5 pM的 檸檬酸對H2(D2的清除率百分?jǐn)?shù)分別為92.7%， 76.1%， 22.2%, 3.4%。6. 根據(jù)上述實驗得到的不同濃度檸檬酸對H202的清除率數(shù)據(jù)，采用ORIGIN繪 圖軟件，繪制出H202的清除率與相應(yīng)的檸檬酸濃度的關(guān)系曲線，并從圖中讀 出清除率為50%時檸檬酸的濃度為106 即檸檬酸的IC5o為106 ^M，將 ICso值取倒數(shù)，得0.94xlO- M—1，即為檸檬酸清除H202能力的大小。實施例51. 同實施例2步驟1。2. 同實施例2步驟2。3. 同實施例2步驟3。4. 同實施例2步驟4。5. 水楊酸清除H202能力的測定 選擇水楊酸在反應(yīng)體系中的終濃度為10 [iM,其余實驗操作步驟同實施例2 步驟5,計算得10 jiM的水楊酸對H202的清除率百分?jǐn)?shù)為1.2%。增加7jc楊 酸的濃度，使其在反應(yīng)體系中的終濃度分別為20 ^M, 50 ^M, 100 ^M, 200 ^M。重復(fù)以上才喿作步驟，計算得20pM， 50 [iM， 100 200 pM的水楊 酸對H2(D2的清除率百分?jǐn)?shù)分別為3.2%, 7.6%, 12.3%， 21.8%。 7JC楊酸對11202的清除率范圍沒有覆蓋ICso值，繼續(xù)增加水楊酸的濃度，使 其在反應(yīng)體系中的終濃度分別為400 ^M, 600 ^M, 800 ^M,重復(fù)以上實驗 操作步驟，計算得400pM, 600 ^M， 800pM的水楊酸對H2O2的清除率百分 數(shù)分別為45.3%， 68.7%, 90.5%。6. 根據(jù)上述實驗得到的不同濃度水楊酸對H202的清除率數(shù)據(jù)，采用ORIGIN繪圖軟件，繪制出H202的清除率與相應(yīng)的水楊酸濃度的關(guān)系曲線，并從圖中讀出清除率為50%時水楊酸的濃度為470 ^M,即水楊酸的ICso為470 將 IC5o值取倒數(shù)，得0.21xl(^pM—1,即為水楊酸清除11202能力的大小。實施例61. 同實施例2步驟1。2. 同實施例2步驟2。113. 同實施例2步驟3。4. 同實施例2步驟4。5. 單寧酸清除H202能力的測定選擇單寧酸在反應(yīng)體系中的終濃度為200 ^M,其余實驗操作步驟同實施例2 步驟5,計算得200 jiM的單寧酸對H202的清除率百分?jǐn)?shù)為88.1%。減小單 寧酸的濃度，使其在反應(yīng)體系中的終濃度分別為100 ^M, 50[iM， 25 10pM。重復(fù)以上操作步驟，計算得100pM， 70pM, 50^M， 25 的單寧 酸對11202的清除率百分?jǐn)?shù)分別為87.5%， 86.2%, 85.2%, 79.1%。 單寧酸對11202的清除率范圍沒有覆蓋ICso值，繼續(xù)減小單寧酸的濃度，使 其在反應(yīng)體系中的終濃度分別為10pM， 5pM， 3pM,重復(fù)以上實驗操作步 驟，計算得10 jiM， 5 ^M, 3 的單寧S臾對11202的清除率百分?jǐn)?shù)分別為 64.7%, 53.3%, 38.6%。6. 根據(jù)上述實驗得到的不同濃度單寧酸對H202的清除率數(shù)據(jù)，采用ORIGIN繪 圖軟件，繪制出11202的清除率與相應(yīng)的單寧酸濃度的關(guān)系曲線，并從圖中讀 出清除率為50%時單寧酸的濃度為7 nM，即單寧酸的1<350為7 ^M,將IC50 值取倒數(shù)，得14.28 xl(^^M—1,即為單寧酸清除H202能力的大小。驗證例1. 金納米顆粒(GNPs)的制備利用還原氯金酸的方法制備金納米顆粒。將1 g氯金酸溶于100 mL純水中， 得1%氯金酸水溶液，4。C冷藏。取200 mL預(yù)冷的純水，加入3 mL濃度為 1%的氯金酸水溶液和1 mL濃度為0.2 M的石友酸鉀水溶液，攪拌混勻，再向 其中迅速加入9 mL濃度為0.5 mg/mL的硼氫化鈉水溶液，混合溶液由深褐色 變?yōu)榫萍t色，即得粒徑在5 nm左右的金納米顆粒。再攪拌10 min，將制備得 到的金納米顆粒水溶液置于4。C冷藏保存。2. Si。2膠體的氨基化取40 mL濃度為0.013 g/mL的Si02醇溶膠，向其中加入60 pL的氨基丙 基三乙氧基硅烷(APTES),于70。C下攪拌反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后，將上述溶 液置于離心管中，以10000 rpm離心20 min,取底部Si02溶質(zhì)，加無水乙醇 超聲^t,以上步驟重復(fù)3次，以除去多余的APTES。3. Si02/GNPs復(fù)合物顆粒的制備取500 [iL氨基化的Si02醇溶膠，加入20 mL無水乙醇稀釋，將稀釋后的Si02 醇溶膠逐滴加入200 mL金納米顆粒中，約30 min滴完，不斷攪拌，帶負(fù)電荷 的金納米顆粒通過靜電作用吸附于帶正電荷的Si02小球表面，形成 Si02/GNPs復(fù)合物顆粒，繼續(xù)攪拌1 h后，將上述混合液置于離心管中，以123000 rpm離心20 min,取底部Si02/GNPs復(fù)合物顆粒，加純水超聲分散，以 上步驟重復(fù)3次，得純化的Si02/GNPs復(fù)合物顆粒水溶液。4. K2CCVHAuCl4混合溶液的配制取100 mL濃度為0.01 M的磷酸鹽緩沖溶液，向其中加入25 mg K2C03,攪 拌10 min,再向其中加入1.5 mL濃度為1%的氯金酸溶液，攪拌20 min后置 于4°C陳化至少24 h后使用。5. 阿魏酸清除H202能力的測定取3 mL濃度為0.01 M的磷酸鹽緩沖溶液，向其中加入0.1 mLH202和0.2 mL阿魏酸，11202在反應(yīng)體系中的終濃度為200 pM,阿魏酸在反應(yīng)體系中的終濃度依次為3 [iM， 5 pM， lOjiM， 50 pM, 100 pM，擅j半2 min，再分別向其中加入0.5 mL Si02/GNPs復(fù)合物顆粒水溶液和3 mL K2C03/HAuCl4混合溶液，反應(yīng)5 min，剩余的11202將氯金酸還原成金納米顆粒并沉積在Si02/GNPs復(fù)合物顆粒表面，形成包覆不完整的金納米殼。反應(yīng)后溶液用紫外-可見分光光度計進(jìn)行表征，最大吸收波長記為Wi。參比實驗將0.2 mL的阿魏酸替換為0.2 mL濃度為0.01 M的磷酸鹽緩沖溶液，其余不變，由相同濃度11202制備得到的金納米殼水溶液的最大吸收波長記為W。對照實驗將0.1 mL的H202和0.2 mL的阿魏酸替換為0.3 mL濃度為0.01 M的磷酸鹽緩沖溶液，其余不變，記錄相同濃度Si(VGNPs復(fù)合物顆粒水溶液的最大吸收波長為Wo。利用 『一『i公式-？x7W %,計算得3jiM, 5 pM， 10 [iM, 50 ^M， 100 濃度的阿魏酸對H202的清除率百分?jǐn)?shù)。將各阿魏酸濃度所對應(yīng)的清除率百分?jǐn)?shù)利用ORIGIN繪圖軟件繪制曲線，如 說明書附圖的圖3中阿魏酸數(shù)據(jù)曲線圖所示。其相應(yīng)的可檢測濃度范圍，IC50 值和H202清除能力值如表1中阿魏酸數(shù)據(jù)所示。阿魏酸的IC5Q值和H202清 除能力值分別為8pM和12.5xl(T2jiM—、現(xiàn)有一種采用過氧草酸脂類化學(xué)發(fā)光法來檢測抗氧化劑清除H202能力的方 法，該方法檢測原理在于H202能夠在熒光團(tuán)的作用下將一種芳香草酸脂類化 合物氧化形成芳香草酸脂/熒光團(tuán)復(fù)合物，在這個過程中將一個電子轉(zhuǎn)移給一種 高能中間產(chǎn)物，然后，這個電子又被轉(zhuǎn)移給熒光團(tuán)使它處于一種高能激發(fā)態(tài)，從 而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，發(fā)光強(qiáng)度可通過熒光強(qiáng)度檢測，當(dāng)反應(yīng)體系中含有抗氧化 劑時， 一部分H202被清除，發(fā)光強(qiáng)度被抑制。利用該方法檢測出來的阿魏酸清 除50%11202所需要的濃度，即ICso值為10.37 pM, 11202清除能力值為9.7x10—2 pM-1。與我們的檢測方法相比較，首先兩種^r測方法的^r測原理是不一樣的，現(xiàn) 有方法是基于化學(xué)激發(fā)發(fā)光，而我們的方法是基于納米材料的光學(xué)吸收特性；其 次，具體操作步驟和反應(yīng)條件也是完全不一樣的，兩種方法得出來的數(shù)據(jù)不可能13完全一致。因此，雖然最終數(shù)據(jù)結(jié)果有差異，但是仍然在實驗允許的變化范圍之 內(nèi)。說明我們的方法是正確的，有效的。待測樣品可檢測濃度范圍ic5011202清除能力值(闊(岸)(x10-2 |iM-1 )水楊酸100~8004700.21酒石酸50~12002730.36L-蘋果酸5~4001620.62檸檬酸5~4001060.94阿魏酸3~畫812.5單寧酸5~200714.28表1 6種抗氧化劑可檢測濃度范圍，IC5G值和H202清除能力值對比實-驗1. 本實驗方法由于我們將金納米顆粒的生長置于Si02小球的表面，形成了一 種納米級的核殼結(jié)構(gòu)，在金納米顆粒的生長過程中，除了吸光度的變化，波 長也在幾百納米范圍內(nèi)遷移，我們首次采用波長的變化^L為光學(xué)檢測信號， 當(dāng)15202在反應(yīng)體系中的終濃度在0-200 pM之間變化時，波長遷移了約220 nm，即每變化1 的11202濃度，波長變化約1.1 nm, —般紫外-可見分光 光度計的參數(shù)設(shè)置中，波長的分辨率最小可達(dá)到0.1 nm,也就是說若釆用波長做為檢測信號，是完全可以分辨出每1 |XM的H2(D2濃度所引起的波長變化值的。2. 現(xiàn)有方法將制備好的金納米顆粒做為種子在溶液中繼續(xù)生長，也采用H202 做為反應(yīng)體系的還原劑，現(xiàn)有方法將金納米顆粒生長過程中吸光度的變化做 為光學(xué)檢測信號，實驗操作中當(dāng)H202在反應(yīng)體系中的終濃度在0-600 nM之 間變化時，吸光度變化了約0.55，即每變化1 ^M的H202濃度，吸光度變化 值約為0.00092, —般紫外-可見分光光度計的參數(shù)設(shè)置中，吸光度的分辨率 最小可達(dá)到0.001，也就是說若采用吸光度做為檢測信號，是無法分辨出每l的H202濃度所SI起的吸光度變化值的。1權(quán)利要求
1.一種基于金納米殼的抗氧化劑清除H2O2能力的測定方法，其特征在于，步驟為1)將金納米顆粒與氨基化的SiO2膠體溶液混合、攪拌，所加的金納米顆粒的量應(yīng)使金納米顆粒在氨基化的SiO2小球表面的覆蓋率理論計算值不少于30％，金納米顆粒通過靜電吸附作用吸附于氨基化的SiO2膠體顆粒表面，得SiO2/GNPs復(fù)合物顆粒水溶液，在對SiO2/GNPs復(fù)合物顆粒水溶液進(jìn)行離心處理后，除去上層未被吸附的金納米顆粒，再在除去未被吸附的金納米顆粒后的SiO2/GNPs復(fù)合物顆粒水溶液中加純水稀釋，并使沉淀分散于純水中得到純化的SiO2/GNPs復(fù)合物顆粒，SiO2/GNPs復(fù)合物顆粒在稀釋后的SiO2/GNPs復(fù)合物顆粒水溶液中的濃度為2×1010個/mL～2×1012個/mL；2)在0.01M的磷酸鹽緩沖溶液中加入碳酸鉀作為反應(yīng)體系的穩(wěn)定劑和質(zhì)量體積比濃度為1％的氯金酸溶液，磷酸鹽緩沖溶液、碳酸鉀及氯金酸溶液的體積mL、質(zhì)量mg、體積mL比為20～500∶5～125∶0.3～7.5，攪拌均勻，于4℃陳化至少24h，得到碳酸鉀做穩(wěn)定劑的氯金酸溶液；3)在0.01M的磷酸鹽緩沖溶液中加入待檢測的抗氧化劑與H2O2，(待檢測的抗氧化劑在反應(yīng)體系中的終摩爾濃度為3μM～1200μM，H2O2在反應(yīng)體系中的終摩爾濃度為50μM～500μM)，磷酸鹽緩沖溶液、待檢測的抗氧化劑及H2O2的體積比為0.6～15∶0.02～0.5∶0.04～1，混合并反應(yīng)1～5min后，再向其中加入SiO2/GNPs復(fù)合物顆粒水溶液和步驟2)所得的碳酸鉀做穩(wěn)定劑的氯金酸溶液，此時SiO2/GNPs復(fù)合物顆粒在反應(yīng)體系中的終摩爾濃度為1.34×10-11M～13.4×10-11M，氯金酸的終摩爾濃度為0.66×10-4M～6.6×10-4M，反應(yīng)2～20min，剩余的H2O2將氯金酸還原成金納米顆粒并沉積在SiO2/GNPs復(fù)合物顆粒表面，形成包覆不完整的金納米殼；將上述反應(yīng)形成的包覆不完整的金納米殼在紫外分光光度計下進(jìn)行表征，記錄包覆不完整的金納米殼水溶液的最大吸收波長，記為W1；將不加抗氧化劑時由相同濃度H2O2制備得到的金納米殼水溶液的最大吸收波長記為W；將不加抗氧化劑和H2O2時相同濃度SiO2/GNPs復(fù)合物顆粒水溶液的最大吸收波長記為W0，通過公式 id="icf0001" file="A2009100362040002C1.tif" wi="28" he="9" top= "214" left = "35" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>計算得該濃度的抗氧化劑對H2O2的清除率百分?jǐn)?shù)；4)根據(jù)步驟3)計算所得的抗氧化劑對H2O2的清除率數(shù)值大小，通過增加和/或減小抗氧化劑的濃度，得到不少于4個不同濃度的抗氧化劑，分別重復(fù)步驟3)，計算得不同濃度下抗氧化劑對H2O2的清除率，以所得到的抗氧化劑對H2O2的清除率中最小值為下限、最大值為上限，構(gòu)成抗氧化劑對H2O2的清除率范圍，如果抗氧化劑對H2O2的清除率范圍不能覆蓋抗氧化劑的IC50值，則重復(fù)步驟4)，直到IC50值落入抗氧化劑對H2O2的清除率范圍；5)根據(jù)步驟3)-步驟4)得到的抗氧化劑對H2O2的清除率數(shù)據(jù)，采用ORIGIN繪圖軟件，繪制出H2O2的清除率與相應(yīng)的抗氧化劑濃度的關(guān)系曲線，并從圖中讀出清除率為50％時抗氧化劑的濃度為c，單位為M，c即為所選抗氧化劑的IC50值，將c取倒數(shù)，即1/c為抗氧化劑清除H2O2能力的大小，單位為M-1。
全文摘要
一種基于金納米殼的抗氧化劑清除H₂O₂能力的測定方法，將金納米顆粒(GNPs)與氨基化的SiO₂膠體溶液混合經(jīng)靜電吸附作用得SiO₂/GNPs復(fù)合物顆粒，H₂O₂能夠?qū)⒙冉鹚徇€原成金納米顆粒并沉積在SiO₂/GNPs復(fù)合物顆粒表面，形成完整的金納米殼，若先將不同濃度的抗氧化劑與H₂O₂混合反應(yīng)，那么剩余的H₂O₂還原氯金酸后只能形成包覆不完整的金納米殼，通過紫外-可見分光光度計對SiO₂/GNPs復(fù)合物顆粒和包覆程度不一的金納米殼進(jìn)行表征，比較它們的最大吸收波長，可得不同濃度抗氧化劑對H₂O₂的清除率，繪制H₂O₂清除率與相應(yīng)抗氧化劑濃度的關(guān)系曲線，讀出清除率為50％時的濃度，取倒數(shù)即為清除H₂O₂能力的大小。本發(fā)明基于SiO₂/GNPs復(fù)合物顆粒長大過程中光學(xué)性質(zhì)的變化，操作簡便且檢測靈敏度高。
文檔編號G01N21/77GK101661003SQ20091003620
公開日2010年3月3日 申請日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月25日
發(fā)明者慧 李, 健 董, 錢衛(wèi)平, 馬小媛 申請人:東南大學(xué)