專利名稱：利用飛秒激光使微生物失活的系統(tǒng)和方法
利用飛秒激光使微生物失活的系統(tǒng)和方法關于聯(lián)邦政府資助研究的聲明作為通過國家科學基金會給予的基金號DMR-0305147和由美國國防部保健科學 軍醫(yī)大學三軍放射生物學研究所給予的基金號RAB2CF的條款所提供的，美國政府擁有對 本發(fā)明的已付費的許可，并擁有在受限情況下要求專利所有人在合理的條件下許可他人的 權利。相關申請的交叉參考本申請要求于2007年6月1日遞交的序列號60/932，668，發(fā)明名稱為“利用可見 飛秒激光來減少微生物活性的系統(tǒng)和方法”的美國臨時專利申請的優(yōu)先權，其全部內容在 此引入作為參考。
背景技術：
本發(fā)明涉及使微生物失活或降低微生物活性的領域，具體而言，涉及使用產(chǎn)生可 見或近紅外飛秒激光的沖擊受激拉曼散射以引起這種失活或減少。用于使病毒失活或改變病毒和其它微生物活性的現(xiàn)有方法并不完全有效，且又會 引起抗性和臨床副作用問題。微生物可經(jīng)歷遺傳基因突變，導致它們變得對抗生素、抗菌 劑、抗病毒藥物、清潔產(chǎn)品、人類免疫系統(tǒng)、紫外線(UV)處理、照射和其它意在使它們失活 的藥劑有抗性。此外，目前使用的抗微生物劑的副作用也限制了它們在臨床環(huán)境中的應用。避免抗性問題的一種方法是微波/超聲吸收。該技術旨在將微生物內的振動模式 激發(fā)到如此高的振幅，以致于引起它們的失活/解體。由于微生物的突變對其結構蛋白、脂 類和碳水化合物包括衣殼、外殼蛋白、細胞壁、細胞膜和膜結合蛋白的振動頻率沒有影響， 因此微生物無法通過突變來避開破壞。從而，該方法避免了微生物抗性株的產(chǎn)生或進化，并 能有效地用于使野生型和突變的微生物失活。對于通過微波/超聲吸收激發(fā)而言，主要障礙在于水也會吸收這些通常為 30GHz-300GHz的振動頻率(參見以下參考文獻1和2)。由于在活性微生物存在的地方通 常也存在水，因此大量的會誘發(fā)微生物振動能量的微波/超聲激發(fā)能量都被水所替代吸收 了。因而這樣的方法對于大多數(shù)應用并不可行。因此需要用于誘導微生物內振動的更有效 的方法來完全實現(xiàn)這一目的。先前用激光來減少微生物活性的方法使用了破壞微生物的蛋白質結構的UV激 光。其它方法涉及使用不同波長的激光。然而，除了殺死微生物以外，這些技術需要大量的 動力，并且破壞期望的物質例如人細胞、血小板和蛋白。為了減少發(fā)明詳述內容的復雜性和長度，同時為了在某些技術領域完整地建立現(xiàn) 有技術水平，申請人在此明確地引入所有下列材料作為參考，所述材料確定于如下每個編 號段落。1. Ford LH，球形病毒顆粒振動頻率的評估，Phys. Rev. E67， 051924-1-051924-3(2003) ·2. Tsen KT, Dykeman EC, Sankey OF, Lin N-T, Tsen S-ff D, KiangJG 通過拉曼光
3譜觀察水中噬菌體M 13的低頻振動模式.Virology J，3 :79-1-79_11 (2006).3. Cerf R.等，在病毒衣殼中結構波動的超聲波吸收的證明，PNAS (USA)，76 1780-1782(1979).4. Michaels B等，煙草花葉病毒的超聲波吸收及其蛋白質聚集體，J MoI Biol 181 103-110(1985).5. Yan YX等，沖擊受激散射與物質相互作用的飛秒激光脈沖的一般重要性，以及 光譜應用，J Chem Phys,83 5391-5399(1985).6. Tsen KT，寬帶隙纖鋅礦GaN中的超速動力學，半導體中的超速物理過程，KT Tsen 編，67 109-149 Semiconductors and Semimetals, Academic Press, New York, (2001).7. Tsen KT，在納米結構半導體中的電子速度過沖、彈道電子傳遞和非平衡聲 動 態(tài)，Ultrafast Physical Processes in Semiconductors, KTTsen 編，67 191-259, Springer-Verlag, New York(2001).8. Tsen KT，半導體納米結構中電場誘導電子和孔瞬時輸送以及光學聲不穩(wěn)定的 光學石if究· Ultrafast Dynamical Processes inSemiconductors,KT Tsen編，92 193-258, Topics in Applied Physics, Spinger-Verlag, Heidelberg(2004).9. Tsen KT，氮化物系半導體中載體動態(tài)和非平衡光學聲子的光學研究，半導體和 納米結構的非平衡動態(tài)，180-213，KT Tsen 編· CRCPress，New York(2005).10. Nelson KA 等，可調諧超聲波的光學產(chǎn)生，J Appl Phys 531144-1149(1982).ll.Miller RJD等，激光產(chǎn)生的超聲波測量弱吸收、光彈性常數(shù)聲衰減的動態(tài)全 息途徑，Chem Phys 72 371-379(1982).12. Nelson ΚΑ,受激布里淵散射和連貫橫波的光學激發(fā)，J ApplPhys 53 6060-6063(1982).13. Tsen KT等，軸向扭轉模式水中觀察的噬菌體Μ13的低頻振動模式的拉曼散射 研究，Nanotechnology 17，5474-5479 (2006) ·14. Robinson MM等，皮秒沖擊受激布里淵散射相干橫向聲波的光學激發(fā)并應用 于結構相變的時域調查.Chem Phys Lett 112491-496(1984).15. De Silvestri S等，通過20-300K在α -茈晶體中沖擊受激拉曼散射光學聲子 去相位的飛秒時間分辨測量，Chem Phys Lett 116146-152(1985).16. Tsen KT等，通過拉曼光譜學觀察水中噬菌體M13的低頻振動模式，Virology J 3 79-1-79-11(2006).17. Tsen KT等，探討拉曼散射——水中噬菌體M13的低頻振動模式，J Biomedical Optics 12 024009-1-024009-6(2007).18. Tsen KT等，用低功率可見飛秒激光通過相干激發(fā)滅活病毒，Virology J. 4， (50) 1-5(2007).19. Liu JL等，摻硼的多層Ge量子點中的子能帶間吸收，Appl.Phys Lett, 74 185-187(1999).20. Liu JL等，調制摻雜的Ge量子點中次能級間過渡的觀察，Appl Phys Lett, 75 1745-1747(1999).
21. Kamins TI 等，在 Si 上自組裝 Ge 島的平版定位，Appl. PhysLett 71 1201-1203(1997).22. Balandin A等，用于量子計算的量子點記錄的實際認識的問題，J Electronics Materials 29 549-553(2000).23. Shenton W等，由煙草花葉病毒的模板礦化的無機-有機納米管復合物，Adv Mater 11 253-256(1999).24. Flynn CE等，用于物質的生長、機構和裝配的作為載體的病毒，Acta Materialia 51 5867-5880(2003).25. Mao C等，用于磁性和半導體特性納米線的定向合成的病毒工具盒，Science 303 213-217(2004).26. Knez M等，煙草花葉病毒上金屬簇的空間選擇性成核現(xiàn)象，Adv Funct Mater 14 116-124(2004).27. Tuma R ·，__白勺JiMjfei普，in Handbook of VibrationalSpectroscopy, Chalmers JM 等編· John Wiley & Sons，Chichester (2002).28. Eisenstark A，噬菌體技術，in Methods in Virology Volume 1449—524， Maramorosch 等編· Academic Press, New York (1967).29. Tsen KT等，超薄GaAs-AIAs多層量子阱結構中電子-光學的聲子相互作用， Phys Rev Lett 67 2557-2560(1991).30. Marvin DA等，關于X射線纖維衍射改良的分子結構和fd (f 1M13)細絲 狀噬菌體以及在細菌膜噬菌體裝配的固態(tài)NMR數(shù)據(jù)支持特定模型，J MoI Biol 355 294-309(2006).3 1. Balandin A 等，納米模板病毒的振動模式，Journal ofBiomedical Nanotechnology 1 90-95(2005)·32. Graff KF，彈性固體的波動，Ohio State University Press, NewYork (1991).33. Landau LD 等，彈性理論，第 3 版，Pergamon Press London (1986).34. Tachibana M等，溶菌酶單晶的聲速和動態(tài)彈性常數(shù)，ChemPhys Lett 332 259-264(2000).35. Yu PY等，半導體理論——物理和材料特性，第2版，362-371， Springer-Verlag, Berlin (1999).36. Go S等，半導體中的鍵電荷、鍵極化和聲子光譜，Phys RevLett 34 580-583(1975).37. Moss B，牛痘病毒、研究工具和牛痘，Science 1662-1667(1991).38. Boumsell MEG等，用于免疫治療宮頸癌的重組牛痘病毒表達的人類乳突病毒 蛋白的結構和特性，Vaccine 14 1485-1494(1996).39. Messing J等，細絲狀大腸桿菌噬菌體M13作為克隆載體在生物體外M13復 制形式中Iac調控區(qū)的HindII片段的插入，PNASUSA 74 3642-3646(1977).40. Merril CR 等，長循環(huán)噬菌體作為抗菌劑，Microbiology 933188-3192(1996).41. Knez M 等，3nm 鎳與鈷納米線的生物模板，Nano Lett 31079-1082(2003).42. Liu WL等，雜交病毒無機納米管的裝配與特性，Appl. PhysLett 86253108(2005).43. Fonoberov等，用于納米電子自組裝病毒的低頻振動模式，Phys Status Solidi B Rapid Res Notes 12 R67-R69(2004).44. Fonoberov等，用于納米電子應用的雜交病毒無機納米管中的聲子限制效應， Nano Lett 5 1920-1923(2005).45. Snoke等，用于C6tl拉曼光譜的鍵極化模型，Solid StateCommun，87 121-126(1993).46. Dong J等，在合金鍺晶籠化合物中劇烈振動聲子模式的化學趨勢，J Appl Phys 87 7726-7734(2000).47. Guha 等，用于富勒烯的經(jīng)驗鍵極化模型，Phys Rev B 5313106-13114(1996).48. Shen YR，非線性光學的原理，Wiley, New York (1984).49. Austen DH,等編，超速現(xiàn)象 IV, Springer, Berlin (1984).50. Shen YR,量子電子進展(Prog. Quantum Electron) 4 207(1976).51. Auston DH 等，物理評論快報(Phys Rev Lett) 53 1555(1984).52. Shen YR 等，物理評論(Phys Rev) 163 224(1967).53. Laubereau A 等，現(xiàn)代物理評論(Rev. Mod Phys) 50 607 (1978).54. Shen YR 等，物理評論(Phys Rev)A 137 1787(1965).55. Kosic TJ 等，化學物理快報(Chem Phys Lett) 96 57(1983).56. Cameron A 等，晶體學報(Acta CrystalIogr) 18 636 (1965) ·57. Kaiser Ψ 等，in Laser Handbook Vol 2, Arrechi FTNorth-Holland, Amsterdam(1972).58. Dissado LA 等，化學物理(Chem Phys) 86 375(1984).59. Dissado LA 等，化學物理快報(Chem Phys Lett) 87 74(1982).60. Collins MA 等，化學物理(Chem Phys) 54 305(1981).61. Grover M 等，化學物理雜志(J Chem Phys) 54 4843(1971).62. Gehrig GA 等，物理進展報告(Rep Prog Phys) 38 1 (1975).63. Tanaka J 等，日本化學協(xié)會簡報(Bull Chem Soc Jpn) 361237 (1963).64. Cohen MD 等，化學物理(Chem Phys) 27 211 (1978).65. Nelson KA 等，化學物理快報(Chem Phys Lett) 64 88(1979).66. Walker B 等，化學物理(Chem Phys) 97 177(1985).67. Prasad PN 等，分子晶體與液晶(MoI Cryst Liq Cryst) 93 25(1983).68. Sukenik JA 等，美國化學協(xié)會雜志(J Am Chem Soc)99 851(1977).69. Dwarakanath 等，美國化學協(xié)會雜志(J Am Chem Soc) 1024254 (1980).70. Merski J 等，物理化學雜志(J Chem Phys) 75 3691，3705，3719，3731 (1981) ·71. Luty T 等，物理化學雜志(J Chem Phys) 81 520(1984).72. Luty T 等，物理化學雜志(J Chem Phys) 82 1515(1985).73. Nelson KA 等，物理化學雜志(J Chem Phys) 72 5202(1980).74. Shriver DF 等，紅外線和拉曼光譜的優(yōu)點，Clark RJH 編，6127 Heydon and Son, London (1980).
6
75. Com RM 等，物理化學雜志(J Chem Phys) 12 5231(1984).76. Sidorov NV 等，分子晶體與液晶(Mol Cryst Liq Cryst) 90185 (1983).77. Baughman RH 等，低維材料的合成及性能，Miller JS 等編，75 Academy of Science Press, New York(1978).78. Gross H 等，化學物理快報(Chem Phys Lett) 95 584(1983).79. Warshel A 等，化學物理(Chem Phys)6 463(1974).80. Cotton 等，高等無機化學(Advanced Inorganic Chemistry)第 4 版， Interscience, New York(1980).81. Wrighton MS，金屬-金屬鍵的反應性，Chisholm MH 編，ACSSymp Ser 155 85， American Chemical Society, Washington DC(1981).申請人:相信以上引入的材料根據(jù)37 CFR 1. 57是“非必需的”，因為其涉及為了指 示本發(fā)明的背景或闡明現(xiàn)有技術水平的目的。然而，如果審查員認為任何一篇上述引入的 材料構成37 CFR 1. 57(c) (1)-(3)含義中的“必需材料”，申請人將在適用規(guī)則的允許下修 改說明書以明確地陳述被引入作為參考的必需材料。

發(fā)明內容
本發(fā)明以最小化副作用并且不受響應于選擇壓力的抗性發(fā)展的影響的方式，尤其 提供了一種使微生物失活或減少微生物活性的裝置和方法。“使微生物失活或減少微生物 活性”指“抑制/減少微生物的生長、生存、功能和/或傳染性”。本發(fā)明的一個目的是操作、控制和使微生物失活。本發(fā)明的一個目的是在水存在下激發(fā)微生物中的振動態(tài)。本發(fā)明的一個目的是使用在IR和可見光譜區(qū)的低能電磁波激發(fā)微生物的振動 態(tài)。本發(fā)明的一個目的是使用沖擊受激拉曼散射(ISRS)對微生物功能性必需的結構 上產(chǎn)生大振幅的振動模式。本發(fā)明的一個目的是通過ISRS在對于微生物功能性必需的結構上將相干聲拉曼 激活振動模式激發(fā)到一種狀態(tài)，該狀態(tài)導致微生物活性的選擇性減少，包括通過受迫機械 聲振動的失活。本發(fā)明的一個目的是使病毒和/或細菌失活，使得病毒和/或細菌的組成部分以 可用于接種的方式被改變或解體。本發(fā)明的一個目的是選擇性使微生物失活而不影響真核細胞。本發(fā)明的一個目的是使血液中血源性病原體失活同時不傷害關鍵的血細胞和血 液組分。以上的和其它的目的可使用包括能在具有相應于對水基本上透過的電磁頻譜區(qū) 的波長的波寬上產(chǎn)生飛秒輻射脈沖的激光器的設備來實現(xiàn)。該設備還使用了諧波發(fā)生器例 如非線性BBO晶體，其產(chǎn)生散射效應，接著通過激發(fā)微生物的振動態(tài)來照射微生物。該設備 還可以具有聚焦透鏡例如顯微鏡物鏡。激光器可以是一個鈦藍寶石激光器。目標微生物包 括病毒和細菌以及原生動物。以上的和其它的目的可使用這樣的方法來達到，包括用對水基本上透過的電磁頻譜區(qū)內的飛秒脈沖輻射激發(fā)微生物的振動態(tài)，轉而在微生物內產(chǎn)生機械聲激發(fā)。當光束聚 焦于微生物上時，機械聲激發(fā)隨后導致微生物活性減少?？赏ㄟ^機械聲激發(fā)將微生物的活 性減少到這樣一種程度以致于該微生物失活。在此所示的本發(fā)明的方面和應用在下面的附圖和發(fā)明詳述部分進行描述。對于適 用領域技術人員而言，除非特別說明，說明書和權利要求書中的用詞和短語的含義都具有 普通的、通常的和習慣的含義。本發(fā)明人完全明白如果需要的話他們可以是其自己的詞典 編纂者。作為其自己的詞典編纂者，本發(fā)明人明確地選擇僅使用說明書和權利要求書中的 術語的普通的和通常的含義，除非他們另外清楚地陳述，以及進一步特別地闡明該術語的 “特別”定義并解釋其如何不同于普通的和通常的含義。如果缺少這種旨在應用“特別”定 義的清楚陳述，則將這些術語的簡單的、普通的和通常的含義應用于說明書和權利要求書 的解釋就是本發(fā)明人的意圖和需要。本發(fā)明人也知曉英文語法的標準規(guī)則。因此，如果名詞、術語或短語意在以某種方 式進行進一步表征、指定或限定，則根據(jù)英文語法的標準規(guī)則，這樣的名詞、術語或短語將 明確地包括附加的形容詞、描述性術語或其它修飾詞。如果不使用這樣的形容詞、描述性術 語或修飾詞，則如上所述對于適用領域技術人員而言，意在對這樣的名詞、術語或短語給出 它們普通的、和通常的英文含義。此外，本發(fā)明人完全通曉35 U. S. C. § 112，· | 6的專門條款的標準和應用。因此， 在發(fā)明詳述或


或權利要求書中的詞語“功能”、“手段”或“步驟”的使用并不意在以 某種方式指示援引35 U. S. C. § 112，· I |6的專門條款來定義本發(fā)明的意愿。相反地，如果 尋求援引35 U. S. C. § 112，· I 6的條款來定義本發(fā)明，則權利要求書將特別地且明確地陳 述確切的短語"...的手段”或"...的步驟”，也將陳述詞語“功能”(即，將陳述“執(zhí)行[插 入功能]功能的手段”)，而不在這樣的短語中陳述任何結構、材料或動作來支持該功能。因 此，即使當權利要求書陳述“用于執(zhí)行...功能的手段”或“用于執(zhí)行...功能的步驟”，如 果該權利要求同時陳述任何結構、材料或動作來支持該手段或步驟，或者支持執(zhí)行所陳述 的功能，則這就是本發(fā)明人不援引35 U. S. C. §112，· |6的條款的清楚意圖。此外，即使 35 U. S. C. § 112，· I 6的條款被援引來定義所要求保護的發(fā)明，本發(fā)明也不受限于僅在優(yōu) 選的實施方案中所描述的特殊結構、材料或動作，而是除此之外，還包括如本發(fā)明替代實施 方案或形式中所描述的執(zhí)行所請求保護功能的任何和所有結構、材料或動作，或用于執(zhí)行 所請求保護功能的公知存在的或隨后開發(fā)的等價的結構、材料或動作。

當考慮與下列說明性附圖結合時，可從所涉及的發(fā)明詳述中導出本發(fā)明的更完整 的理解。在這些附圖中，所有附圖的相同的附圖標記表示相同的元件或動作。圖1顯示了可用于減少M13噬菌體活性的本發(fā)明的一種形式。圖2A顯示了滴定度為1 X IO3Pfu的M13噬菌體不經(jīng)過激光照射的噬菌斑形成分 析結果。圖2B顯示了滴定度為IX IO3Pfu的M13噬菌體經(jīng)過激光照射的噬菌斑形成分析結果。圖3A顯示了滴定度為5X IO2Pfu的M13噬菌體不經(jīng)過激光照射的噬菌斑形成分
圖3B顯示了滴定度為5 X IO2Pfu的M13噬菌體經(jīng)過激光照射的噬菌斑形成分析結果。圖4顯示了滴定度為1 X IO3Pfu的M13噬菌體經(jīng)過改變的激發(fā)激光功率密度的噬 菌斑形成分析結果。圖5是顯示不同的脈沖寬度使微生物失活結果的表格。附圖中的元件和動作是用簡單形式舉例說明，并不需要根據(jù)任何特殊的順序或實 施方案來展現(xiàn)。發(fā)明詳述在下面的描述中，為了解釋的目的，列出很多的細節(jié)以便提供對本發(fā)明各方面的 全面理解。然而，對于相關領域的技術人員而言，應當明白本發(fā)明可以不用這些細節(jié)來實 施。在其它實例中，更一般性地展示或討論已知的結構和設備以避免使本發(fā)明變得模糊不 清。在很多例子里，操作的描述足以使人們實施本發(fā)明的各種形式。應當指出有很多不同 的和可選的配置、設備和技術可以應用于公開的本發(fā)明。本發(fā)明的全部范圍并不限于以下 所描述的實例內。本發(fā)明用對水基本上透過的電磁頻譜區(qū)中的超短波、低能脈沖激發(fā)微生物的振動 態(tài)。一個這樣的區(qū)域是可見光譜。沖擊受激拉曼散射(ISRS)可用于在存在于液體溶液的 分子中產(chǎn)生大振幅的振動模式，以及在固態(tài)系統(tǒng)中產(chǎn)生點陣振動(參見參考文獻3)。在分子以及固態(tài)系統(tǒng)中已經(jīng)成功地說明了 ISRS(參見參考文獻8-12)。在分子系 統(tǒng)中，由于斯托克斯(Stokes)頻率包含在激發(fā)脈沖的譜寬中，因此用單激光束激發(fā)的ISRS 是一種受激的前向散射過程。此外，只要足夠短的激光脈沖通過拉曼激活固體或分子液體 或氣體，ISRS為一個過程，通過該過程相干點陣或分子振動的激發(fā)將會發(fā)生。對單光束激 發(fā)來說，如果忽略衰減，則由ISRS引起的離開平衡分子間距的位移的振幅(Rtl)可由下式給 出
2 2.R0 = {δα / SR) 0β'ω°τι 'Α I πιω^ηο(ι);其中I是激發(fā)激光的功率密度；α是媒質的極化率；R是離開平衡分子間距的位 移；δ α / δ R與拉曼散射截面成正比；COtl是相干振動激勵的角頻率；τ L是激發(fā)激光的脈 沖寬度的半峰全寬(FWHM) ；m是分子質量；11是折射率；以及c是光速(參見參考文獻3)?；谏鲜龇匠淌?，更大的拉曼截面、更高的激光功率密度，以及更低的振動頻率， 都會造成更大的激發(fā)振動幅度。對于很多具有足夠低的振動頻率和合理的激發(fā)功率密度的 拉曼散射截面來說，通過ISRS可以實現(xiàn)在0.01-IA范圍內的振動位移幅度。相對于分子 位移，激發(fā)的分子系統(tǒng)的極化率應該大于10_16Cm2。在該范圍內的振動位移幅度可用于在微生物中產(chǎn)生振動。例如，M13噬菌體顯示 與病毒衣殼的軸向扭轉振動相關的低頻(約8. 5cm-1)振動模式(參見參考文獻13和14)。 使用超短脈沖激光激發(fā)，該振動模式的振幅可通過ISRS以相干方式激發(fā)，以達到微生物的 活性減少的程度。為了減少活性，必須超過振動模式的振幅閾值。例如，參見圖4，直至超過約50MW/ cm2的激發(fā)激光功率密度后，M13噬菌體的活性才受到影響。此外，即使超過激發(fā)激光功率
9密度的閾值，如果脈沖寬度長于800飛秒，則活性也不受影響。其它微生物在不同于M13噬 菌體的振幅上可具有自己的活性減少，這樣的振幅通過上述方程式估計。在本發(fā)明的一種形式中，可見飛秒激光系統(tǒng)通過ISRS在微生物內將相干聲拉曼 激活振動模式激發(fā)至導致其活性選擇性減少的狀態(tài)，包括其通過機械聲激發(fā)使其失活。現(xiàn) 在參見圖1，激光器100產(chǎn)生具有給定重復頻率的大約飛秒的脈沖(參見參考文獻4-7)。倍 頻器200用于照射樣品。反射鏡310、320、330和340將光束反射到聚焦透鏡400，該聚焦透 鏡400把光束聚焦到樣品容器500中。在樣品容器505的局部放大圖中，光束聚焦把樣品 容器限定在光束強聚焦的510區(qū)域內和光束較不強聚焦的520區(qū)域內?？捎糜诒景l(fā)明的激光器的一個實例是二極管抽運cw模式鎖定的鈦藍寶石激光 器。然而，其它飛秒激光器也可以使用。這樣的飛秒激光器包括環(huán)形激光器、氬泵浦雙噴 射染料激光器(argon-pumpeddual-jet dye lasers)或YAG激光器的二次諧波輸出、超短 脈沖光纖激光器。其它Ti 藍寶石激光器包括集束泵浦激光器(Integrated pumplaser) 例如來自Time-Bandwidth Products的Pallas-LP，腔倒空飛秒Ti 藍寶石激光系統(tǒng)例如 Tiger-CD可調諧Nd 玻璃激光器，如來自Time-Bandwidth Products的GLX-200，或被動模 式鎖定薄盤激光器例如來自Time-Bandwidth Products的Fortis。設定激光器以產(chǎn)生設定的重復頻率的脈沖連續(xù)波。優(yōu)選地，脈沖為約80飛秒波寬 以及重復頻率為約80MHz，波長為約425nm，以及功率為約40mW。然而，也可使用其它設定。 例如，可使用約1阿秒_約1皮秒的脈沖寬度和約400nm-約900nm的波長。優(yōu)選地，諧波生成系統(tǒng)可以是BBO非線性晶體，但是用于倍頻近紅外至可見光的 其它非線性晶體也可使用。這些替代的非線性晶體包括LB0、LiNb03、KTP、LiTa03、KNb03、 KDP, CLBO, ΒΙΒ0、CB0、ZGP、AgGaS2、AgGaSe2、CdSe 和 GaAs 非線性晶體。聚焦透鏡可以是具有超長工作距離，優(yōu)選約2. Ocm的顯微鏡物鏡。然而，也可使用 具有不同工作距離的其它聚焦透鏡。聚焦透鏡可包括復合透鏡或光纖透鏡?？烧{整本發(fā)明以將激光聚焦在其表面上具有微生物的結構上，以一種特定的方式 破壞該微生物的結構，或減少存在于液體、固體或氣體中的微生物的活性。對于飛秒激光器類型、其設定和特性的更詳細討論，可參見以下文章，在此引入作 為參考82. Claude Rulliere,Femtosecond Laser Pulses 理論禾口實驗[Principles and Experiments (Advance Texts in Physics)]第 2 版· (2005).83. Jean Claude Diels和Wolfgang Rudolph，超短激光脈沖現(xiàn)象飛秒時間規(guī)模 的基本原理、技術和應用(光學和光電子學系列)，Academic Press (1996).84. Sigrid Avrillier，飛秒激光在生物學中的應用，Proceedings ofSPIE, Volume 5463(2004).現(xiàn)在參看圖2A和2B，用具有425nm波長和100飛秒脈沖寬度的Inj/脈沖飛秒激 光照射用IX IO3Pfu的M13噬菌體制備的三塊獨立平板。M13噬菌體失活至統(tǒng)計學顯著(注 意圖中y軸在比例上的不同)。現(xiàn)在參見圖3A和3B，用具有425nm波長和100飛秒脈沖寬度的Inj/脈沖飛秒激 光照射用5 X IO2空斑形成單位的M13噬菌體制備的三塊獨立平板。M13噬菌體失活至統(tǒng)計 學顯著(注意圖中y軸在比例上的不同)。
現(xiàn)在參見圖4，M13噬菌體以1. 1 X 103pfu/板的濃度鋪板并經(jīng)受波長425nm和 IOOfs脈沖寬度的脈沖。使用不同的激光功率密度。至少對于M13噬菌體，達到至少45MW/ cm2的激光功率密度的激光才能有效使噬菌體失活。這些設定對于所有微生物可能是不同 的?，F(xiàn)在參看圖5，測定了具有425nm脈沖和64MW/cm2能量的不同脈沖寬度照射對Ml3 噬菌體的影響。注意到除非脈沖長度低于800飛秒，否則不能有效失活。這些設定對于所 有微生物可能是不相同的。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，通過使用沖擊受激拉曼散射，本發(fā)明可用飛秒激光 選擇性使病毒失活。M13噬菌體樣品以1. 1 X 107pfu/ml鋪板并經(jīng)受425nm波長和IOOfs脈 沖寬度的脈沖。使用不同的激光功率密度。至少對于M13噬菌體，達到至少49MW/cm2的激 光功率密度的激光才能有效使噬菌體失活。對于非常低功率的可見飛秒激光，病毒如M13 噬菌體可通過ISRS過程而失活。對于所有微生物這些設定可能是不相同的，然而，應當明 白本發(fā)明可通過利用飛秒激光系統(tǒng)的操作和控制來選擇性使微生物失活，同時使敏感物質 不受傷害。因此，對于不同類型的微生物，可在能選擇性使目標病毒和細菌失活而不在哺乳 動物細胞中引起細胞毒性的功率密度中，利用相應的窗口適當選擇波長和脈沖寬度。對于選擇性使微生物失活的更詳細討論，參見下列文章，在此引入作為參考85. K. T. Tsen等，使用通過沖擊受激拉曼散射的飛秒激光滅活病毒，Proceedings of SPIE, Volume 6854，68540N(2008).86. K. Τ. Tsen等，用近紅外飛秒選擇性滅活微生物，J. Phys. =Condensed Matter 19,472201(1-7)(2007).87. K. Τ. Tsen等，由通過沖擊受激拉曼散射過程的激光驅動相干激發(fā)滅活病毒， Journal of Biomedical Optics 12，064030 (1-7)(2007).88. K. Τ. Tsen等，用亞皮秒近紅外激光脈沖選擇性滅活人體免疫缺陷病毒， J.Phys. =Condensed Matter,20,252205(1-4) (2008).可利用本發(fā)明的其它實施方案以從微生物中提取核酸。通過激發(fā)微生物，本發(fā)明 允許在微生物蛋白衣殼上形成穿孔，從而，微生物內的核酸可被釋放并被收集和分析。此外，由于振動幅度隨著激光功率密度持續(xù)變化，本發(fā)明的其它實施方案可包括 激發(fā)微生物直至微生物達到失活的狀態(tài)，但以一種改變或破裂的狀態(tài)保持完整。預計這樣 的微生物可用于疫苗的制造。在此陳述實施方案和實例是為了最好地解釋本發(fā)明及其實際應用，從而使得本領 域技術人員能實施并使用本發(fā)明。然而，本領域技術人員應當認識到前述描述和實例僅用 于說明和示例的目的。所述的描述并不意在窮舉或限制本發(fā)明于所公開的確切形式。許多 修改和改變可以從上述的教導中得出而不背離隨后權利要求的精神和范圍。
權利要求
一種減少微生物活性的裝置，該裝置包括激光器，該激光器具有被設定產(chǎn)生在對水基本上可透過的電磁頻譜區(qū)內的飛秒脈沖的輸出功率；和諧波發(fā)生器，該諧波發(fā)生器對飛秒脈沖進行操作以產(chǎn)生散射效應，從而通過激發(fā)微生物的振動態(tài)而照射微生物。
2.根據(jù)權利要求1所述的裝置，其中，所述激光器包括鈦藍寶石激光器或超短脈沖光 纖激光器。
3.根據(jù)權利要求1所述的裝置，其中，所述飛秒脈沖具有在1納焦/脈沖到1毫焦/脈 沖范圍內的功率。
4.根據(jù)權利要求1所述的裝置，其中，所述諧波發(fā)生器包括非線性晶體。
5.根據(jù)權利要求1所述的裝置，其中，所述諧波發(fā)生器包括BBO非線性晶體。
6.根據(jù)權利要求1所述的裝置，其中，對水基本上可透過的電磁頻譜區(qū)包括紅外區(qū)和 可見光區(qū)。
7.根據(jù)權利要求1所述的裝置，其中，所述微生物包括病毒。
8.根據(jù)權利要求1所述的裝置，其中，所述微生物包括細菌。
9.根據(jù)權利要求1所述的裝置，該裝置還包括將散射脈沖聚焦于微生物上的聚焦透^Mi ο
10.根據(jù)權利要求9所述的裝置，其中，所述聚焦透鏡包括顯微鏡物鏡。
11.一種減少微生物活性的方法，該方法包括用在對水基本上可透過的電磁頻譜區(qū)中的波長的飛秒脈沖輻射照射微生物到振動狀 態(tài)，從而在微生物內產(chǎn)生減少微生物活性的人工聲激發(fā)。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，該方法還包括將激發(fā)源的光束聚焦于微生物上。
13.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中，所述微生物被失活。
14.根據(jù)權利要求1所述的裝置，其中，所述微生物包括原生動物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使微生物失活或減少微生物活性的方法和應用該方法的裝置。通過用輻射飛秒寬度的脈沖激發(fā)微生物的振動狀態(tài)減少微生物活性。脈沖的波長處于水基本上透過的電磁頻譜區(qū)，例如可見光。脈沖引起微生物的振動，使得其活性減少。激光器產(chǎn)生這樣的脈沖。然后諧波發(fā)生器作用于脈沖以產(chǎn)生用于照射微生物的散射效應。一種這樣的激光器是鈦藍寶石激光器。諧波發(fā)生器的一個實例是非線性晶體例如BBO晶體。該裝置還可具有聚焦透鏡例如將光束聚焦于微生物上的顯微鏡物鏡。本發(fā)明有效地使病毒或細菌失活。本發(fā)明可用于從微生物中提取核酸。本發(fā)明可用于制造疫苗。本發(fā)明使選擇性使目標病毒和細菌失活而不引起哺乳動物細胞內的細胞毒性成為可能。
文檔編號G01N21/76GK101971008SQ200880101152
公開日2011年2月9日 申請日期2008年6月2日 優(yōu)先權日2007年6月1日
發(fā)明者鄭功榮 申請人:紹偉·D.·鄭;朱麗安·G.·江;鄭功榮