專利名稱：：一種化妝品中孕激素黃體酮的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種化妝品中孕激素黃體酮的測定方法，特別是涉及一種通過超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用4義(UPLC/MS/MS)對(duì)化妝品中孕激素黃體酮進(jìn)4于定性和定量一企測的方法。
背景技術(shù)：
：黃體酉同(Proglsterone)又名孕酉同(Utrogestan)、Ji力孕素(Pro—gestln),為孕激素，在醫(yī)療上黃體酮有口H和注射兩種劑型，具有人工調(diào)整月經(jīng)周期等作用，但黃體酮也具有一定的副作用，大劑量時(shí)能抑制垂體促性腺激素的分泌，產(chǎn)生抑制排印作用。目前，化妝品中黃體酮對(duì)雀斑美容具有很好的療效，但是其檢測方法只有《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中制定了黃體酮的高效液相色鐠法，此方法的缺點(diǎn)是不能對(duì)含有微量孕激素黃體酮的樣品，以及含有較多干擾雜質(zhì)的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定性判斷和定量測定，因此建立一種能夠準(zhǔn)確定性、快速和準(zhǔn)確定量的檢測方法，有利于監(jiān)控化妝品領(lǐng)域黃體酮添加使用量和殘留量，從而保障化妝品的安全使用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服了孕激素黃體酮目前檢測標(biāo)準(zhǔn)中技術(shù)上既不能微量定量也不能準(zhǔn)確定性的缺陷，通過摸索提取液、萃取液、定容液，以及最佳萃取溶劑配比7;口最佳色語條件而提供一種化妝品中孕激素黃體酮的定性和定量纟全測方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下設(shè)計(jì)方案本發(fā)明的一種通過超高效液相色譜質(zhì)語聯(lián)用儀(UPLC/MS/MS)對(duì)化妝品中孕激素黃體酮進(jìn)行定性和定量檢測的方法包括如下步驟待測試樣為溶液狀樣品，準(zhǔn)確稱取充分混勻后的樣品1.000g2.000g(±0.Olg)于lOmL具塞比色管中，在水浴上餾除乙醇等揮發(fā)性有機(jī)溶劑，用甲醇稀釋到10mL,充分混勻后'，濾膜過濾后獲得試樣處理液。待測試樣為膏狀、乳狀樣品，準(zhǔn)確稱耳又充分混勻后的樣品1.000g~2.000g(±0.01g)于250mL錐形瓶中，在水浴上餾除乙醇等揮發(fā)性有機(jī)溶劑，加入飽和氯化鈉溶液50mL，2。/。硫酸2.0mL，充分振蕩溶解后轉(zhuǎn)移至250mL分液漏斗，以環(huán)己烷30mL分三次萃耳又，必要時(shí)離心分離，合并環(huán)己烷，減壓蒸餾除去環(huán)己烷，甲醇溶解殘留物，轉(zhuǎn)移到10mL具塞比色管中，用曱醇稀釋到刻度，充分混勻后，濾膜過濾后獲得試樣處理液。稱取孕激素黃體酮標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容后作為儲(chǔ)備液，然后進(jìn)一步用曱醇稀釋為具有濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)使用液；利用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC/MS/MS)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)使用液和試樣處理液進(jìn)4于;險(xiǎn)測；計(jì)算結(jié)果，試樣中孕激素黃體酮的計(jì)算公式為式中X-試樣中納他霉素的含量，單位為毫克每千克(mg/kg);C-試樣處理液濃度(ng/mL);V-試樣定容體積，單位為克(mL);m-試樣質(zhì)量，單位為克(g)。優(yōu)選地，所述水浴上餾除乙醇等揮發(fā)性有機(jī)溶劑。優(yōu)選地，添加飽和氯化鈉水溶液50mL,2y。硫酸水溶液2mL,充分振蕩溶解。優(yōu)選地，采用環(huán)己烷30mL,分三次萃取。優(yōu)選地，采用曱醇作為定容液。所述利用超高效液相色語質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC/MS/MS)對(duì)試樣處理液進(jìn)行檢測的色語條件為液相色"i普條件色i普柱ACQUITYUPLCBEHC18,2.lmmx50mm,1.7fim;柱溫30°C;流動(dòng)相乙腈+0.2%曱酸水溶液(60+40);流速0.3mL/min;進(jìn)樣量5pL;質(zhì)譜條件離子源電噴霧離子源；掃描方式正離子掃描；才全測方式多反應(yīng)4t測；毛細(xì)管電壓(Kv):1.0;離子源溫度(°C):110;去溶劑溫度(°C):350;去溶劑流速(L/hr):700;本實(shí)驗(yàn)的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)、駐留時(shí)間、錐孔電壓和碰撞能量參數(shù)見表l。表lACQUITYTQDMRM參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注315.30〉109.OO為定性離子對(duì)315.30>97.OO為定量離子對(duì)并根據(jù)定性離子對(duì)315.30〉97.00結(jié)合質(zhì)譜定性理論進(jìn)行定性，外標(biāo)峰面積法定量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是采用本發(fā)明的方法檢測化妝品中孕激素黃體酮，快速有效，RSD小于5。/。，既能準(zhǔn)確的進(jìn)行定性判斷，也能進(jìn)行定量分析，最低檢測限達(dá)到0.01mg/kg。由此可見，本發(fā)明的方法，為化妝品中孕激素黃體酮的檢測，提供了一種可靠的便于實(shí)施的依據(jù)，能夠滿足研究、生產(chǎn)和曰常市場抽檢的需要。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1,溶液狀化妝品中孕激素黃體酮的精密度和回收率檢測待測試樣為溶液狀樣品，準(zhǔn)確稱取充分混勻后的樣品1.000g2.000g(±0.01g)于lOmL具塞比色管中，在水浴上餾除乙醇等揮發(fā)性有機(jī)溶劑，用甲醇稀釋到10mL，充分混勻后，過0.22um濾膜，作為試樣處理液備用。黃體酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稱取黃體酮0.Olg(準(zhǔn)確至0.0001g)于100ml容量瓶中，用少量曱醇溶解，最后用甲醇稀釋至刻度，此溶液作為黃體酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。lmL此溶液含黃體酮0.lmg,再稀釋為10.0、50.0、100、200、500ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)4吏用液。檢測條件為液相條件色語柱:ACQUITYUPLCBEHC18,2.lmmx50mm，1.7(im;柱溫30°C;流動(dòng)相乙腈+0.2%甲酸水溶液(60+40);流速0.3mL/min;進(jìn)樣量5pL;質(zhì)譜條件離子源電噴霧離子源；掃描方式正離子掃描；才全測方式多反應(yīng)沖企測；毛細(xì)管電壓(Kv):1.0;離子源溫度(°C):110;去溶劑溫度(°C):350;去溶劑流速(L/hr):700;本實(shí)驗(yàn)的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)、駐留時(shí)間、錐孔電壓和碰撞能量參數(shù)見表l。表lACQUITYTQDMRM參數(shù)MRM駐留時(shí)間(sees)4#孔電壓(volts)碰撞能量[ev]黃體酮315.30>97.000.100復(fù)0020.00315.30〉109.000.10040.0025.00注315.30〉109.OO為定性離子對(duì)315.30〉97.OO為定量離子對(duì)根據(jù)其質(zhì)譜峰定性，外標(biāo)峰面積法定量。計(jì)算結(jié)果，試樣中孕激素黃體酮的計(jì)算公式(1)為Y一CxK—1000xm式中X-試樣中孕激素黃體酮的含量，單位為毫克每千克(mg/kg);C-試樣處理液濃度(ng/mL);V-試樣定容體積，單位為克(mL);附-試樣質(zhì)量，單位為克(g);試樣中孕激素黃體酮的含量按公式(1)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如下:9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例2，膏狀、乳狀化妝品中孕激素黃體酮精密度和回收率的檢測待測試樣為膏狀、乳狀樣品，準(zhǔn)確稱耳又充分混勻后的樣品L000g2.000g(±0.01g)于100mL錐形瓶中，在水浴上餾除乙醇等揮發(fā)性有機(jī)溶劑，加入飽和氯化鈉溶液50mL,2。/。硫酸2.0mL，充分振蕩溶解后轉(zhuǎn)移至250mL分液漏斗，以環(huán)己烷30mL分三次萃取，必要時(shí)離心分離，合并環(huán)己烷，減壓蒸餾除去環(huán)己烷，曱醇溶解殘留物，轉(zhuǎn)移到10mL具塞比色管中，用曱醇稀釋到刻度。充分混勻后，過0.22um濾膜，作為試樣處理液備用。稱fl黃體酮0.Olg(準(zhǔn)確至0.OOOlg)于100ml容量jf瓦中，用少量曱醇溶解，最后用甲醇稀釋至刻度，此溶液作為黃體酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。lmL此溶液含黃體酮0.lmg，再逐漸稀釋為10.0、50.0、100、200、500ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)4吏用液。檢測條件為液相條件色語柱ACQUITYUPLCBEHC18,2.lmmx50mm,1.7nm;柱溫30°C;流動(dòng)相乙腈+0.2%甲酸水溶液(60+40);流速0.3mL/min;進(jìn)樣量5|uL;質(zhì)語條件離子源電噴霧離子源；掃描方式正離子掃描；才全測方式多反應(yīng)4全測；毛細(xì)管電壓(Kv):1.0;離子源溫度(°C):110;去溶劑溫度(°C):350;去溶劑流速(L/hr):700;本實(shí)驗(yàn)的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)、駐留時(shí)間、錐孔電壓和碰撞能量參數(shù)見表l。表lACQUITYTQDMRM參數(shù)MRM駐留時(shí)間(sees)錐孔電壓(volts)碰撞能量[ev]黃體酮315.30>97.000.10040.0020.00315.30〉109.000.10040.0025.00注315.30〉109.OO為定性離子對(duì)315.30〉97.OO為定量離子對(duì)根據(jù)其質(zhì)i普峰定性，外標(biāo)峰面積法定量。計(jì)算結(jié)果，試樣中孕激素黃體酮的計(jì)算公式(1)為Y_CxF_1000xm式中X-試樣中孕激素黃體酮的含量，單位為毫克每千克(mg/kg);C-試樣處理液濃度(ng/mL);V-試樣定容體積，單位為克(mL);附-試樣質(zhì)量，單位為克(g);試樣中孕激素黃體酮的含量按公式(1)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如下:ii<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>顯而易見，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，可以用發(fā)明的這種通過超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC/MS/MS)對(duì)化妝品中孕激素黃體酮進(jìn)行定性和定量4全測。上述實(shí)施例僅供說明本發(fā)明之用，而并非是對(duì)本發(fā)明的限制，有關(guān)
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明范圍的情況下，還可以作出各種變化和變型，因此所有等同的技術(shù)方案也應(yīng)屬于本發(fā)明的范疇，本發(fā)明的專利保護(hù)范圍應(yīng)由各權(quán)利要求限定。權(quán)利要求1、一種通過超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC/MS/MS)對(duì)化妝品中孕激素黃體酮的測定方法，其特征在于，所述測定方法包括如下步驟待測試樣為溶液狀樣品準(zhǔn)確稱取充分混勻后的樣品1.000g～2.000g(±0.01g)于10mL具塞比色管中，在水浴上餾除乙醇等揮發(fā)性有機(jī)溶劑，用甲醇稀釋到10mL，充分混勻后，濾膜過濾后獲得試樣處理液；待測試樣為膏狀、乳狀樣品準(zhǔn)確稱取充分混勻后的樣品1.000g～2.000g(±0.01g)于100mL錐形瓶中，在水浴上餾除乙醇等揮發(fā)性有機(jī)溶劑，加入飽和氯化鈉溶液50mL，2％硫酸2.0mL，充分振蕩溶解后轉(zhuǎn)移至250mL分液漏斗，以環(huán)己烷30mL分三次萃取，必要時(shí)離心分離，合并環(huán)己烷，減壓蒸餾除去環(huán)己烷，甲醇溶解殘留物，轉(zhuǎn)移到10mL具塞比色管中，用甲醇稀釋到刻度，濾膜過濾后獲得試樣處理液；稱取孕激素黃體酮標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容，作為黃體酮儲(chǔ)備液，然后進(jìn)一步用甲醇稀釋為具有濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)使用液；利用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC/MS/MS)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)使用液和試樣處理液進(jìn)行定性和定量檢測；計(jì)算結(jié)果，試樣中孕激素黃體酮的計(jì)算公式為式中X-試樣中孕激素黃體酮的含量，單位為毫克每千克(mg/kg)；C-試樣處理液濃度(ng/mL)；V-試樣定容體積，單位為克(mL)；m-試樣質(zhì)量，單位為克(g)；2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種化妝品中孕激素黃體酮的測定方法，其特征在于水浴上餾除乙醇等揮發(fā)性有機(jī)溶劑，很好的解決了試樣液中一些有機(jī)溶劑的殘存，避免了其對(duì)色鐠峰的影響。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種化妝品中孕激素黃體酮的測定方法，其特征在于添加飽和氯化鈉水溶液50mL,2。/。硫酸水溶液2mL,充分振蕩溶解，能夠有效的去除油脂等大分子類物質(zhì)，防止乳化，從而保證樣品的回收率。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種化妝品中孕激素黃體酮的測定方法，其特征在于采用環(huán)己烷30mL分三次萃耳又，環(huán)己烷30mL和三次萃耳又，為最佳萃取條件。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種化妝品中孕激素黃體酮的測定方法，其特征在于采用曱醇作為定容液，很好的保證了在質(zhì)語條件下，標(biāo)準(zhǔn)液和試樣液保持了相同的介質(zhì)溶液，從而達(dá)到最優(yōu)的離子化條件。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種化妝品中孕激素黃體酮的測定方法，其特征在于所述利用超高效液相色譜質(zhì)語聯(lián)用儀(UPLC/MS/MS)對(duì)試樣處理液進(jìn)行定性和定量4全測的液相條件為色i普柱ACQUITYUPLCBEHC18,2.lmmx50mm,1.7,柱溫30°C流動(dòng)相乙腈+0.2%甲酸水溶液(60+40)流速0.3mlVmin進(jìn)樣量5pL此條件下具有4艮好的分離效旲。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種化妝品中孕激素黃體酮的測定方法，其特征在于所述利用超高效液相色譜質(zhì)語聯(lián)用儀(UPLC/MS/MS)對(duì)試樣處理液進(jìn)行定性和定量^r測的質(zhì)語條件為離子源電噴霧離子源；掃描方式正離子掃描；-險(xiǎn)測方式多反應(yīng)4全測；毛細(xì)管電壓(Kv):1.0;離子源溫度(°C):110;去溶劑溫度(°C):350;去溶劑流速(L/hr):700;本實(shí)驗(yàn)的多反應(yīng)監(jiān)測(M腿)、駐留時(shí)間、錐孔電壓和碰撞能量參數(shù)見表l。表lACQUITYTQDMRM參數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>注315.30〉109.OO為定性離子對(duì)315.30〉97.OO為定量離子對(duì)此條件下，黃體酮具有很好的色語峰形和較高的質(zhì)語靈敏度8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種化妝品中孕激素黃體酮的測定方法，其特征在于利用較為適用的超高效液相色i普質(zhì)語聯(lián)用儀(UPLC/MS/MS)對(duì)樣品中孕激素黃體酮進(jìn)行定性和定量檢測。全文摘要本發(fā)明涉及一種通過超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC/MS/MS)對(duì)化妝品中孕激素黃體酮的測定方法。待測試樣經(jīng)餾除乙醇等揮發(fā)性有機(jī)溶劑后，加入飽和氯化鈉和2％硫酸水溶液，充分振蕩溶解，環(huán)己烷萃取后減壓蒸餾，甲醇定容、過濾后得到試樣處理液；準(zhǔn)確稱取黃體酮標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解、稀釋為具有濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)使用液；利用液質(zhì)聯(lián)用儀(UPLC/MS/MS)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)使用液和試樣處理液進(jìn)行定性、定量檢測；然后便可計(jì)算出結(jié)果。采用本發(fā)明的方法檢測化妝品中黃體酮的含量，快速有效，相對(duì)平均偏差小于5.0％，由此可見，本發(fā)明的方法，為化妝品中孕激素黃體酮的檢測，提供了一種可靠的便于實(shí)施的方法，能夠滿足研究和生產(chǎn)中的需要。文檔編號(hào)G01N30/00GK101451981SQ20081024673公開日2009年6月10日申請日期2008年12月30日優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日發(fā)明者薇宋申請人:譜尼測試科技(北京)有限公司