專利名稱：：烏靈膠囊標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立方法和烏靈膠囊的鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及烏靈膠囊的鑒別，尤其涉及烏靈膠囊標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立方法和烏靈膠囊的鑒別方法。背條技術(shù)烏靈菌粉是浙江佐力藥業(yè)股份有限公司利用現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)，從天然烏靈參中分離菌種，經(jīng)過發(fā)酵而得的國家一類新藥，化學(xué)成分主要含有腺苷為主的核苷類物質(zhì)、氨基酸、異黃酮、微量元素、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)。烏靈膠囊是純?yōu)蹯`菌粉制劑，有補腎健腦、養(yǎng)心安神功效，臨床上用于神經(jīng)衰弱的心腎不交證，癥見心煩焦慮，失眠多夢，入睡困難，多夢驚恐，心悸，健忘，頭暈耳鳴等。烏靈膠囊為浙江佐力藥業(yè)股份有限公司獨家生產(chǎn)和享有品種，但隨著烏靈膠囊在臨床的廣泛應(yīng)用，銷量逐年快速增長，市場上也出現(xiàn)一些假冒烏靈膠囊的產(chǎn)品，由于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)所測定的腺苷并非烏靈膠囊特有成分，建立一種在整體上更好控制烏靈膠囊質(zhì)量并作為鑒別真?zhèn)沃笜?biāo)的鑒別方法，具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容為了建立一種在整體上更好控制烏靈膠囊質(zhì)量并作為鑒別真?zhèn)沃笜?biāo)的鑒別方法。本發(fā)明的一個目的是提供烏靈膠囊色譜分析供試溶液和供試溶液配置方法。本發(fā)明的第二個目的是提供烏靈膠囊的鑒別方法。為了實現(xiàn)上述的第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案-烏靈膠囊標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立方法，該方法包括以下的步驟(1)取烏靈膠囊內(nèi)容物，加入極性小的有機溶劑，加熱回流0.52小時，放冷，濾過，藥渣揮干溶劑；(2)加甲醇或含水甲醇，稱重，加熱回流或超聲提取0.51小時，放冷，再稱重，加甲醇補足重量，濾過，以續(xù)濾液作為供試品溶液；(3)對照品溶液采用取腺苷對照品適量，加甲醇溶液溶解，制成含腺苷溶液，作為對照品溶液；(4)然后分別吸取對照品溶液及供試品溶液，分別注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，記錄色譜圖；(5)以腺苷峰為參照，計算各共有特征峰的相對保留時間和相對峰面積，建立起標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。作為優(yōu)選，上述的有機溶劑選用石油醚、環(huán)己垸、正己垸中的任意一種。作為優(yōu)選，上述的液相色譜條件為檢測波長為240260nm;流速0.6ml/min~0.8ml/min;色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相為甲醇一0.1%磷酸溶液，梯度洗脫。作為優(yōu)選，上述的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相對保留時間和峰面積比值如下各峰的相對保留時間為l號峰0.187±20%、2號峰0.468±20%、3號峰0.723±20%、5號峰2.198±20%、6號峰2.232±20%、7號峰2.437±20%，8號峰2.480±20%,參照峰4號峰，為腺苷峰；各峰的峰面積比值2號峰0.60-0.95,3號峰0.480.90;參照峰4號峰，為腺苷峰。為了實現(xiàn)上述的第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案-烏靈膠囊的鑒別方法，采用上述的任意一種方法建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，所測定的供試品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度大于0.9。本發(fā)明的優(yōu)點如下(1)因ds色譜柱對油脂性物質(zhì)有強保留，易引起色譜柱堵塞，柱效下降，縮短色譜柱使用壽命，本發(fā)明供試品溶液是采用石油醚等低極性溶劑脫脂，以保護(hù)色譜柱。(2)本發(fā)明的供試品溶液是用甲醇或含水甲醇超聲或加熱回流提取，兼顧其水溶性及脂溶性兩部分的化學(xué)成分，具有簡便、穩(wěn)定、精密度高以及重現(xiàn)性好等優(yōu)點，彌補了烏靈菌粉現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只涉及其中單一成分的缺點，使對產(chǎn)品質(zhì)量的控制更加全面、真實、科學(xué)。(3)本發(fā)明釆用高效液相色譜法進(jìn)行檢測，檢測波長為260nm,研究證明，供試品溶液在該波長處色譜峰最多，各峰之間分離度也較好，所以該條件下測定的指紋圖譜更能全面反映烏靈膠囊所含的化學(xué)成分。圖l為腺苷對照品圖譜。圖2為烏靈膠囊指紋圖譜。具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，下述實施僅用于說明本發(fā)明而并非對本發(fā)明的限制。1儀器與試藥1.1儀器戴安高效液相色譜儀；UVD-340U檢測器；變色龍工作站。1.2試藥腺苷對照品中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇色譜純；水重蒸水;其它試劑為分析純。烏靈膠囊浙江佐力藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。2色譜條件色譜柱十八烷基鍵合硅膠(4.6X50mm，5um)kromasil;檢測波長260nm;流動相為甲醇—0.1%磷酸溶液系統(tǒng)梯度洗脫；流速0.6ml/mim;柱溫25°C;進(jìn)樣量10ul。理論板數(shù)以腺苷峰計算，應(yīng)不低于4000。圖譜記錄時間為95分鐘。梯度洗脫程序<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3指紋圖譜測定3.1烏靈膠囊指紋圖譜的確立供試品溶液的制備取烏靈膠囊內(nèi)容物l.OOg，加石油醚10ml加熱回流1小時，放冷，濾過，藥渣揮干石油醚，精密加甲醇25ml，精密稱重，加熱回流提取1小時，放冷，再稱重，加甲醇補足重量，濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液。對照品溶液的制備取腺苷對照品適量，加10%甲醇溶液溶解，制成每lml含腺苷20ug的溶液，作為對照品溶液。參照物選用腺苷為參照物(S)。測定精密吸取供試品溶液及對照品溶液10Ul，分別注入高效液相色譜儀，按照液相色譜法測定，以參照物的色譜峰相對保留時間和相對峰面積為1，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，即得到烏靈膠囊標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。3.2共有峰的確定通過10批烏靈膠囊指紋圖譜的測定，比較其色譜圖，確定共有峰8個，以4號峰(腺苷峰)為參照物，相對峰面積超過0.5的共有峰為2號峰(RT0.468)和3號峰(RT0.723),其余均小于0.5。10批烏靈膠囊共有峰相對保留時間和相對峰面積統(tǒng)計結(jié)果見表3和表4。表3IO批烏靈膠囊指紋圖譜相對保留時間統(tǒng)計結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表410批烏靈膠囊指紋圖譜相對峰面積統(tǒng)計結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.3指紋圖譜精密度考察按照指紋圖譜精密度考察要求，以l批烏靈膠囊為供試品，連續(xù)進(jìn)樣5次，分別對共有峰相對保留時間及規(guī)定的共有峰(有規(guī)定的共有峰即為與參照峰相比，相對峰面積超過0.5的指紋峰)的相對峰面積進(jìn)行統(tǒng)計，RSDQ/。不超過3M。3.3指紋圖譜重現(xiàn)性考察以1批烏靈膠囊為供試品(N:5)，按照指紋圖譜重現(xiàn)性規(guī)定方法操作，分別對共有峰相對保留時間及規(guī)定的共有峰的相對峰面積進(jìn)行統(tǒng)計，RSD。/。不超過3%。3.3指紋圖譜穩(wěn)定性試驗按照指紋圖譜穩(wěn)定性測定方法操作，以l批烏靈膠囊為供試品，連續(xù)進(jìn)樣5次，考察24小時溶液穩(wěn)定，分別對共有峰相對保留時間及規(guī)定的共有峰的峰面積進(jìn)行統(tǒng)計，RSDy。不超過3Q/。。供試品24小時穩(wěn)定。以上試驗結(jié)果表明，該測定方法穩(wěn)定可靠，可作為控制烏靈膠囊質(zhì)量的指標(biāo)之一，并可作為鑒別烏靈膠囊真?zhèn)蔚蔫b別方法。權(quán)利要求1.烏靈膠囊標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立方法，其特征在于該方法包括以下的步驟(1)取烏靈膠囊內(nèi)容物，加入極性小的有機溶劑，加熱回流0.5～2小時，放冷，濾過，藥渣揮干溶劑；(2)加甲醇或含水甲醇，稱重，加熱回流或超聲提取0.5～1小時，放冷，再稱重，加甲醇補足重量，濾過，以續(xù)濾液作為供試品溶液；(3)對照品溶液采用取腺苷對照品適量，加甲醇溶液溶解，制成含腺苷溶液，作為對照品溶液；(4)吸取上述對照品溶液及供試品溶液各10μl，分別注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，記錄色譜圖；(5)以腺苷峰為參照，計算各共有特征峰的相對保留時間和相對峰面積，建立起標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的烏靈膠囊標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立方法，其特征在于有機溶劑選用石油醚、環(huán)己烷、正己烷中的任意一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的烏靈膠囊標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立方法，其特征在于液相色譜條件為檢測波長為240~260證；流速0.6ml/min~0.8ml/min;色譜柱填充劑為十八垸基硅烷鍵合硅膠；流動相為甲醇一0.1%磷酸溶液，梯度洗脫。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的烏靈膠囊標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立方法，其特征在于標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相對保留時間和峰面積比值如下各峰的相對保留時間為l號峰:0.187±20%、2號峰:0.468±20%、3號峰0.723±20%、5號峰2.198±20%、6號峰2.232±20%、7號峰2.437±20%，8號峰2.480±20%，參照峰4號峰，為腺苷峰；各峰的峰面積比值2號峰0.60-0.95，3號峰0.48-0.90;參照峰4號峰，為腺苷峰。5.烏靈膠囊的鑒別方法，其特征在于采用如權(quán)利要求14任意一項權(quán)利要求的方法建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，所測定的供試品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度大于0.9。全文摘要本發(fā)明涉及烏靈膠囊的鑒別，尤其涉及烏靈膠囊標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立方法和烏靈膠囊的鑒別方法。烏靈膠囊標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立方法，該方法包括供試品溶液的制備；對照品溶液的制備；然后分別吸取對照品溶液及供試品溶液，分別注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，記錄色譜圖；以腺苷峰為參照，計算各共有特征峰的相對保留時間和相對峰面積，建立起標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。本發(fā)明另外公開了采用上述標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的烏靈膠囊的鑒別方法。本發(fā)明方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好，整體上更好的控制烏靈菌粉和烏靈膠囊的質(zhì)量，可作為烏靈膠囊質(zhì)量控制以及鑒別真?zhèn)蔚闹笜?biāo)之一。文檔編號G01N30/86GK101387620SQ20081006272公開日2009年3月18日申請日期2008年7月1日優(yōu)先權(quán)日2008年7月1日發(fā)明者俞有強,朱方劍,羅艷萍,建陳,陳文祥申請人:浙江佐力藥業(yè)股份有限公司