專利名稱：定向固定抗體的光纖生物探針及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于免疫檢測用的倏逝波光纖生物傳感器上的光纖生物探 針，特別是一種在光纖表面上定向固定抗體的光纖生物探針及其制備方法。
背景技術：
目前，廣泛使用的基于光纖倏逝波生物傳感器的生物檢測系統(tǒng)，是采用 光波在光纖內(nèi)以全反射方式傳輸過程中產(chǎn)生的倏逝波激發(fā)以生物親和反應而 結合于光纖探針表面生物分子上標記的熒光染料。把表面固定了一種捕獲生 物分子的光纖探針置于被檢測樣品中，該樣品中如果存在與固定在光纖探針 表面的生物分子同種生物物質(zhì)，則兩者將發(fā)生親和反應形成復合分子，樣品 中的被測生物分子則結合到光纖探針的表面。然后再把該光纖探針置于具有 熒光染料標記的識別生物分子溶液中，同樣兩者也會發(fā)生特異反應，該溶液 中的識別生物分子與光纖生物探針上的復合分子結合，則將熒光染料固定于 光纖探針的表面。通過倏逝波激發(fā)光纖探針表面倏逝波場范圍內(nèi)的熒光染料， 從而檢測被檢測分子的生物物質(zhì)的屬性及其含量。
影響光纖生物傳感器的效率主要由兩大因素光纖傳感器的工程設計和 生物學問題，生物學因素與工程學一樣，決定著光纖傳感器的成敗。光纖表 面生物敏感分子的固定對于檢測的敏感性和特異性至關重要。然而被直接固 定在光纖纖芯表面上的抗體分子的生物活性通常低于溶液中的抗體分子，生 物活性降低的主要原因是被直接固定在纖芯表面上的抗體分子空間位阻增
大，不利于抗體一 抗原的結合，如文獻《A quantitative assessment of heterogeneityforsurface-immobilizedproteins 》(Anal. Chem.
73(2001),471-480)所述，界面的微環(huán)境導致生物分子的構象改變甚至會發(fā)生 變性。另外一個原因是被直接固定在纖芯表面上的抗體分子的功能域在纖芯 表面上趨向向下或趨向側面時，不利于抗原一抗體的結合；如果抗體分子上 與抗原結合的功能域吸附在纖芯表面上，抗體分子就不能同抗原發(fā)生結合， 如圖1所示，抗體分子5含有兩個抗原結合域7，其中一個與固相表面結合 在一起，從而失去了與抗原分子結合的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，為克服上述被直接固定在固相表面上的抗體分子的 空間位阻大、抗體分子的功能域在固相表面上趨向向下或趨向側面、抗體分 子上與抗原結合的功能域吸附在固相表面上，不利于抗體一抗原結合，以及 抗體分子容易失活的缺點，為了提高光纖生物探針上的抗體與抗原的結合能 力，提供一種定向固定抗體的光纖生物探針及其制備方法。
本發(fā)明定向固定抗體的光纖生物探針，由光纖和固定在該光纖表面上的 捕獲抗體分子層構成，其特點是在光纖和捕獲抗體分子層之間還包括一層蛋 白G分子層。
為更好的促進蛋白G分子層的形成，在所述的光纖和蛋白G分子層之間 還有一層親水極化層。
本發(fā)明定向固定抗體的光纖生物探針使用蛋白G來定向固定抗體分子。 蛋白G是細菌胞壁蛋白，它能夠同抗體的Fc片段8特異性結合。蛋白G特 異性的結合抗體分子的Fc片段8，使抗體分子上同抗原分子特異性結合的兩 個功能域Fab7伸向表面外以便于同抗原分子結合。如圖2所示，通過蛋白G 特異性結合而定向固定在光纖纖芯表面上的抗體分子5同抗原分子6結合的 兩個功能域7伸向表面外，自由的同抗原分子6結合。結合在光纖纖芯表面 上的蛋白G起到橋梁的作用，使被連接的抗體分子在溶液中充分伸展，極大 的降低了空間位阻效應，使抗體一抗原之間的結合類似于在溶液中一樣自由。
另外，蛋白G分子層還能夠鈍化光纖的表面，有效的降低光纖表面的非特異 性吸附，提高免疫檢測即檢測抗原的分析靈敏度。
所述的捕獲抗體分子層的抗體包括各種用于免疫檢測的抗體，如抗體人
免疫球蛋白G (antilgG)、抗體牛血清白蛋白(antiBSA)或抗體人血清凝血 蛋白原(antiFIB)。
本發(fā)明定向固定抗體的光纖生物探針的制備方法包括以下步驟
a. 選擇所需直徑大小的光纖，用常規(guī)清潔處理方法進行表面清潔處理；
b. 將經(jīng)過上述步驟a清潔處理干凈的光纖浸入到蛋白G溶液中，浸泡的 時間依賴溶液濃度來定，以達到飽和吸附為止，取出后用去離子水洗凈，即 得到蛋白G的飽和吸附分子層；
c. 將經(jīng)過上述步驟b處理的光纖浸入到捕獲抗體分子溶液中，浸泡的時 間依賴溶液濃度來定，以蛋白G結合捕獲抗體分子至飽和狀態(tài)為止，取出后 用去離子水洗凈，得到捕獲抗體分子層，即制得定向固定抗體光纖生物探針。
本發(fā)明提供的定向固定抗體的光纖生物探針制備方法還可以進一步包括 在光纖纖芯的表面和蛋白G分子層之間的親水極化表面層的制備方法，其制
備方法步驟如下
a. 選擇所需直徑大小的光纖，經(jīng)常規(guī)清潔處理后，在洗液1中清洗30 分鐘，再在清洗液2中清洗30分鐘，然后在清洗液3中煮沸10分鐘，用去 離子水清洗至中性，即得到表面上具有親水極化層的光纖；
其中所述清洗液l為濃HC1:乙醇-1:1 (V/V) 清洗液2為濃硫酸 清洗液3為超純水；
b. 將經(jīng)過上述步驟a處理的光纖浸入到蛋白G溶液中，浸泡的時間依賴 溶液濃度來定，以達到飽和吸附為止，取出后用去離子水洗凈，即得到蛋白 G的飽和吸附分子層；
C.將經(jīng)過上述步驟b處理的光纖浸入到捕獲抗體分子溶液中，浸泡的時
間依賴溶液濃度來定，以蛋白G結合捕獲抗體分子至飽和狀態(tài)為止，取出后
用去離子水洗凈，得到捕獲抗體分子層，即制得定向固定抗體光纖生物探針。 該方法是在光纖表面上首先形成親水極化層，然后在親水極化表面層上
形成蛋白G分子層，再在蛋白G分子層上形成捕獲抗體分子層。該親水極化 表面層有利于在蛋白G分子層的制備過程中從溶液中吸附蛋白G，促進蛋白 G分子層的形成。
本發(fā)明提供的定向固定抗體的光纖生物探針的用途包括
1) 優(yōu)化免疫測定；
2) 內(nèi)分泌激素檢測；
3) 藥物篩選；
4) 毒素檢測
5) 污染物檢測。
本發(fā)明定向固定抗體的光纖生物探針可對多種生物分子溶液進行免疫檢 測。將本發(fā)明的光纖生物探針浸入到待測分析物溶液，經(jīng)一定反應時間(時 間長短依賴溶液濃度)，溶液中的分子與光纖生物探針上的捕獲抗體分子特異 性結合形成抗原一抗體復合物。然后放入熒光物質(zhì)標記的識別分子溶液，識 別分子與復合分子特異性結合把熒光物質(zhì)固定在光纖生物探針的表面，熒光 物質(zhì)的熒光通過倏逝波光纖生物傳感器系統(tǒng)觀察到，以此判定溶液中待測生 物分子是否存在。
本發(fā)明的優(yōu)點及效果
1. 本發(fā)明提供的定向固定抗體的光纖生物探針克服了纖芯表面上直接固
定抗體引起的抗體生物活性下降的缺點；
2. 本發(fā)明的光纖生物探針，定向固定抗體分子，使抗體分子上的抗原結 合域伸向纖芯表面外，自由的同抗原結合；
3. 本發(fā)明的光纖生物探針，其中蛋白G起到了橋梁的作用，減少了抗 體分子的空間位阻；
4. 蛋白G分子層還能夠鈍化表面，有效的降低了表面的非特異性吸附， 提高檢測抗原的分析靈敏度；


圖1是直接固定在光纖表面上的抗體分子示意圖； 圖2是本發(fā)明的定向固定的抗體分子示意圖3是本發(fā)明的實施例1制備的定向固定抗體的光纖生物探針的結構示 意圖中l(wèi)為光纖纖芯，2為親水極化表面層，3為蛋白G分子層，4為捕 獲抗體分子層，5為抗體分子，6為抗原分子,7為抗原結合域，8為抗體的Fc 片段
具體實施方式
實施例1
制備在光纖表面上定向固定抗BSA的光纖生物探針，其結構包括如圖 3所示，光纖l，在光纖的表面上形成單分子層的親水極化層2，在親水極化 層2上形成的蛋白G單分子層3，以及在蛋白G分子層3上形成的捕獲抗BSA 抗體分子層4。
該光纖生物探針的制備按以下步驟進行
1. 光纖表面的清潔處理
用常規(guī)清潔處理方法對其進行表面清潔處理。
2. 親水極化層的形成
將上述步驟1清潔處理干凈的光纖纖芯先在清洗液1中清洗30分鐘，再 在清洗液2中清洗30分鐘，然后在清洗液3中煮沸10分鐘，制備出在光纖 纖芯上具有親水的極化層。其中清洗液l為濃HC1:乙醇4:1 (V/V) 清洗液2為濃硫酸
清洗液3為超純水
3. 蛋白G分子層的制備
將經(jīng)過步驟2處理的光纖浸入到lmg/mL的蛋白G溶液中，浸泡30分鐘 后，取出后用去離子水將上面的殘存物清除干凈，即形成了第三層蛋白G的 分子層。
4. 捕獲分子層的制備
把上述步驟3形成的蛋白G的分子層浸入到濃度為lmg/mL的antiBSA 溶液中，浸泡30分鐘后，取出用去離子水洗凈，即在蛋白G分子層上得到 捕獲抗BSA分子層，從而制得在光纖纖芯表面上定向固定抗BSA的光纖生 物探針，其結構如圖3所示。
定向固定抗BSA的光纖生物探針對BSA的檢測
把本實施例制備的定向固定抗BSA的光纖生物探針全部浸入到待測溶液 中，如果溶液中含有BSA分子，就會同光纖生物探針上的抗體發(fā)生特異性結 合，形成復合分子，然后放入熒光物質(zhì)標記的識別分子溶液，識別分子與復 合分子特異性結合把熒光物質(zhì)固定在光纖生物探針的表面，熒光物質(zhì)的熒光 通過倏逝波光纖生物傳感器系統(tǒng)觀察到，以此判定溶液中待測生物分子是否 存在。
實施例2
制備一在光纖纖芯表面上定向固定抗HbsAg的光纖生物探針，其結構包 括光纖纖芯l，在光纖纖芯的表面上形成單分子層的親水表面極化層2，在 親水極化層2上形成的蛋白G單分子層3，以及在蛋白G分子層3上形成的 抗HbsAg捕獲抗體分子層4。
采用實施例1中的步驟得到蛋白G分子層，捕獲分子層的制備，把上述步驟3形成的蛋白G的分子層浸入到濃度為lmg/mL的抗HbsAg 溶液中，浸泡30分鐘后，取出用去離子水洗凈，即在蛋白G分子層上得到 捕獲抗體分子抗HbsAg分子層，從而制得在光纖纖芯表面上定向固定抗 HbsAg的光纖生物探針，其結構如圖3所示。
定向固定抗HbsAg的光纖生物探針對BSA的檢測
把本實施例制備的定向固定抗HbsAg的光纖生物探針全部浸入到待測溶 液中，如果溶液中含有HbsAg分子，就會同光纖生物探針上的抗體發(fā)生特異 性結合，形成復合分子，然后放入熒光物質(zhì)標記的識別分子溶液，識別分子 與復合分子特異性結合把熒光物質(zhì)固定在光纖生物探針的表面，熒光物質(zhì)的 熒光通過倏逝波光纖生物傳感器系統(tǒng)觀察到，以此判定溶液中待測生物分子 是否存在。
權利要求
1. 一種定向固定抗體的光纖生物探針，由光纖和固定在該光纖表面上的捕獲抗體分子層構成，其特征在于在光纖和捕獲抗體分子層之間還包括一層蛋白G分子層。
2. 根據(jù)權利要求l所述的定向固定抗體的光纖生物探針，其特征在于 在所述的光纖和蛋白G分子層之間還有一層親水極化層。
3. 根據(jù)權利要求l所述的定向固定抗體的光纖生物探針，其特征在于 所述的蛋白G分子層、親水極化表面層和捕獲抗體分子層均為單分子層。
4. 一種權利要求1所述的光纖生物探針的制備方法，其特征在于包括以 下步驟a. 選擇所需直徑大小的光纖，用常規(guī)清潔處理方法進行表面清潔處理；b. 將經(jīng)過上述步驟a清潔處理干凈的光纖浸入到蛋白G溶液中，浸泡的 時間依賴溶液濃度來定，以達到飽和吸附為止，取出后用去離子水洗凈，即 得到蛋白G的飽和吸附分子層；c. 將經(jīng)過上述步驟b處理的光纖浸入到捕獲抗體分子溶液中，浸泡的時 間依賴溶液濃度來定，以蛋白G結合捕獲抗體分子至飽和狀態(tài)為止，取出后 用去離子水洗凈，得到捕獲抗體分子層，即制得定向固定抗體光纖生物探針。
5. —種權利要求2所述的光纖生物探針的制備方法，其特征在于包括以 下步驟a.選擇所需直徑大小的光纖，經(jīng)常規(guī)清潔處理后，在洗液1中清洗30 分鐘，再在清洗液2中清洗30分鐘，然后在清洗液3中煮沸10分鐘，用去 離子水清洗至中性，即得到表面上具有親水極化層的光纖；其中所述清洗液l為濃HC1:乙醇4:1 (V/V) 清洗液2為濃硫酸清洗液3為超純水；b.將經(jīng)過上述步驟a處理的光纖浸入到蛋白G溶液中，浸泡的時間依賴溶液濃度來定，以達到飽和吸附為止，取出后用去離子水洗凈，即得到蛋白 G的飽和吸附分子層；C.將經(jīng)過上述步驟b處理的光纖浸入到捕獲抗體分子溶液中，浸泡的時間依賴溶液濃度來定，以蛋白G結合捕獲抗體分子至飽和狀態(tài)為止，取出后用去離子水洗凈，得到捕獲抗體分子層，即制得定向固定抗體光纖生物探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于免疫檢測用的倏逝波光纖生物傳感器上的光纖生物探針，特別是一種在光纖表面上定向固定抗體的光纖生物探針及其制備方法。該生物探針由光纖和固定在該光纖表面上的捕獲抗體分子層構成，其特點是在光纖和捕獲抗體分子層之間還包括一層蛋白G分子層。是將處理干凈的光纖浸入到蛋白G溶液中，得到蛋白G的飽和吸附層后再浸入到捕獲抗體分子溶液中，以蛋白G結合捕獲抗體分子至飽和狀態(tài)即制得定向固定抗體光纖生物探針?？朔死w芯表面上直接固定抗體引起的抗體生物活性下降的缺點，減少了抗體分子的空間位阻；并有效的降低了表面的非特異性吸附，提高檢測抗原的分析靈敏度。
文檔編號G01N33/53GK101387640SQ20081005130
公開日2009年3月18日 申請日期2008年10月22日 優(yōu)先權日2008年10月22日
發(fā)明者劉曉敏, 孔祥貴, 孫雅娟, 張友林, 曾慶輝 申請人:中國科學院長春光學精密機械與物理研究所