專利名稱：：活化部分凝血活酶時(shí)間(aptt)測定試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)方面止血與血栓方面的檢卿》式劑，特別是一種可用于測定血漿中活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定試劑。技術(shù)背景在臨床檢驗(yàn)方面，臨床實(shí)驗(yàn)室對于止血與血栓方面的檢測廣泛用于出血、血栓性疾病及血栓前狀的診斷，療效觀察，抗凝藥劑量監(jiān)測和預(yù)后分析。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)步，人們對止血與血栓的發(fā)生和發(fā)展認(rèn)識越來越深刻，其檢測手段越來越先進(jìn)，其中一個(gè)顯著的特點(diǎn)是凝血儀的迅速發(fā)展和在血栓與止血檢測方面的廣泛應(yīng)用。一個(gè)血槳試樣的活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)可用于判斷內(nèi)源性凝血活性機(jī)制是否處于正常狀態(tài)，如血友病A，使APTT延長，顯示為缺乏凝血因子WI。APTT檢測常常還可以附帶檢測肝病治療。因此，對其準(zhǔn)確，快速測檢意義重大。測定APTT的試劑含一種活性劑(activator)，引發(fā)內(nèi)在血塊延續(xù)遞增，直至形成活性因子僅，活化因子X需要磷脂，這也應(yīng)包適在一個(gè)APTT試劑中，使血漿試樣與試劑接觸，經(jīng)過短時(shí)間活化之后，再添加鈣并測出形成血纖蛋白凝塊時(shí)間，對APTT測定系統(tǒng)的要求是APTT試劑操作簡單、穩(wěn)定并且價(jià)格合理，實(shí)驗(yàn)獲得APTT參數(shù)要可靠。現(xiàn)行的測定APTT試劑作為內(nèi)源性凝血誘發(fā)劑大多是表面活性材料。作為液體活性材料有鞣花酸和它的衍生物，此類活性材料對肝素的靈敏度低。作為固體活化材料如高岑土，硅藻土等，其缺點(diǎn)是內(nèi)源血塊活化時(shí)間長，需要較長的潛伏期。況且這些固體活性材料均為天然礦物材料，其品質(zhì)的一致性、均勻性都有可能影響測定結(jié)果，加之要求它們以懸浮物態(tài)存在，如出現(xiàn)沉淀能導(dǎo)致結(jié)塊時(shí)間延長，并且會使血凝儀測定終止點(diǎn)發(fā)生差錯(cuò)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定試劑，它是一種滿足APTT測定的高穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)試劑，其操作簡單，價(jià)格合適以及活化時(shí)間短、且靈敏度高。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，研制一種活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定試劑，其特征是該試劑由下述的原料配制而成試劑固體激活劑0.050.5g/L;磷脂20200mg/L;二價(jià)金屬離子鹽0.110mmol/L;穩(wěn)定劑0.1-0.5g/L;聚乙二醇PEG0.110g/L;緩沖劑0.054.0g/L;復(fù)興劑2.05.Og/L;其余是水。所述的磷脂是指源于兔腦的腦磷脂或者牛腦的腦磷脂，特別是來源于腦髓中灰質(zhì)部分。所述的試劑固體激活劑是納米二氧化硅，為親水性二氧化硅，其比表面積大于140m7g以上，其顆粒直徑在15-6nm之間，最佳的比表面積是200—210m7g，顆粒直徑為10—12nm。所述的二價(jià)金屬離子鹽是二價(jià)金屬離子的硫酸鹽或氯鹽。所述的硫酸鹽是CuS04、NiS04、ZnS04、MnS04、MgS04，氯鹽是CuCl2、ZnCl2、MgCl2。所述的穩(wěn)定劑是牛血清血白蛋白。所述的緩沖劑是指N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸-甘氨酸緩沖劑，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸。所述的聚乙二醇是指的聚合度在20008000之間的聚乙二醇，最佳聚合度在40006000之間。所述的復(fù)興劑是甘露醇、海藻糖。所述的試劑的制備方法如下稱取0.052.0gN-2-羥乙基哌嗪-N，-2-乙垸磺酸和0.14.Og甘氨酸于400mL無菌蒸餾水中，攪拌溶解，用稀氫氧化鈉或稀鹽酸調(diào)整pH至7.30，定容至700mL，加納米二氧化硅0.050.5g，在磁力攪拌器上攪拌混合均勻，加20200mg兔腦磷脂提取液，攪拌30min，充分混合均勻，再加入O.11Ornrno1MnCl220mL,線牛血清血白蛋白0.1-0.5g，聚乙二醇0.110g,攪拌，放置4h以上即為液態(tài)測試APTT試劑，再加入2.05.0g甘露醇，其余用水補(bǔ)足，使其體積為1L,即為測定活化部分凝血活酶時(shí)伺APTT的試劑；凍干保存。本發(fā)明的特點(diǎn)是本發(fā)明是用于測定活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的試劑以及這種試劑的制備方法和測定血漿試樣中活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的測定方法。本發(fā)明的測定APTT試劑由各組分構(gòu)成，固態(tài)激活劑納米二氧化硅，進(jìn)一步激活X因子的磷脂及二價(jià)金屬離子，如CuS(X、NiS(X、ZnS04、MnS04、MgS04，以及保持測試體系處于適當(dāng)pH的緩沖液如N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸-甘氨酸緩沖劑，三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖劑，為提高激活劑分散性和均勻性的聚乙二醇，以及為便于長期保存的穩(wěn)定劑牛血清血白蛋白和復(fù)興劑甘露醇、海藻糖。試劑中納米二氧化硅溶液為0.050.5g/L，要求其為親水性。試劑中20200mg/L的磷脂，這是實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性高所需要的，該磷脂為混合物。為了進(jìn)一歩縮短凝血時(shí)間實(shí)現(xiàn)快速測定，有必要加入水溶性好的二價(jià)金屬離子，為阻止氧化提高試劑在凍干及保存過程中的穩(wěn)定性，可加入一定量的牛血清白蛋白。如果缺少這些組分或組成不在權(quán)利要求的濃度范圍之內(nèi)，則會由于凝血過快或過慢，無法準(zhǔn)確測定準(zhǔn)確對間。具體實(shí)施方式，以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不僅限于以下實(shí)施例。實(shí)施例l:稱取1.15gN-2-羥乙基哌嗪-N，-2-乙烷磺酸和2.25g甘氨酸于400mL無菌蒸餾水中，攪拌溶解，用pH計(jì)測定pH在7.30，否則用稀氫氧化鈉或稀鹽酸調(diào)整至7.30，加水至700mL，加納米二氧化硅0.12g，在磁力攪拌器上攪拌混合均勻，加100mg兔腦磷脂，攪拌30min，充分混合均勻，再加入0.1mmol.L_1MgCl220mL,1%牛血清血蛋白0.lg,聚乙二醇3.0g，攪拌，放置4h以上即為液態(tài)測試APTT試劑，為了便于保存，運(yùn)輸，可加入5g復(fù)興劑甘露醇，凍干保存。實(shí)施例2:稱取2.0g三羥甲基氨基甲烷和10%的鹽酸1.OmL于400mL無菌蒸餾水中，攪拌溶解，用pH計(jì)測定pH在7.30，否則用稀氫氧化鈉或稀鹽酸調(diào)整至7.30，加水至700mL，加納米二氧化硅0.5g，在磁力攪拌器上攪拌混合均勻，加200nig牛腦磷脂，攪拌30min，充分混合均勻，再加入0.5mmol.L—1MgS0420mL,1%牛血清血蛋白0.5g，聚乙二醇3.0g，攪拌，放置4h以上即為液態(tài)測試APTT試劑，為了便于保存，運(yùn)輸，可加入4.0g復(fù)興劑海藻糖，凍干保存。實(shí)施例3:稱取0.05gN-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸和0.lg甘氨酸于400mL無菌蒸餾水中，攪拌溶解，用pH計(jì)測定pH在7.30，否則用稀氫氧化鈉或稀鹽酸調(diào)整至7.30，加水至700mL,加入不同特性的納米二氧化硅0.05g，在磁力攪拌器上攪拌混合均勻，加20mg兔腦磷脂，攪拌30min，充分混合均勻，再加入0.5mmol.L—1MnS0420mL，1%牛血清血蛋白0.3g，聚乙二醇0.lg，攪拌，放置4h以上即為液態(tài)測試APTT試劑。不同特性的納米二氧化硅對APTT的影響如下1.二氧化硅親水性對APTT時(shí)間的影響納米二氧化硅的加工與制造過程中，對二氧化硅進(jìn)行了不同的改性，有疏水性和親水性之分。本發(fā)明中所涉及的納米二氧化硅必須是親水性的，一方面是為了在水溶液中具有較好的懸浮性和均勻性，另一方面是為了保證APTT測值的準(zhǔn)確性。2.二氧化硅粒徑和表面積對APTT的影響納米二氧化硅的表面積及粒徑大小直接關(guān)系到固體激活^J的活性大小，測定APTT的試劑中作為誘發(fā)劑所含有納米二氧化硅在N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸-甘氨酸緩沖劑(pH7.30)中用不同混合比，不同的用量，不同粒徑和不同表面積，并且每升中加有腦磷脂提取液100ml,取正?；旌涎獫{及經(jīng)生理鹽水按50%稀釋的血漿(視為異常)0.lmL，與0.lmL試劑混合，在37。C下預(yù)熱3分鐘，后加入0.lmLO.025mol.L—'CaCL,溶液，在PK-II型血凝儀(中山市培康醫(yī)療電子器械廠)測量達(dá)到凝固點(diǎn)的時(shí)間，由表1表明。表l納米二氧化硅比表面積對APTT測定的作用5090140200210220(m2/g)粒子直徑(nm)35221512107APTT(NP)52373332;'3233APTT(AP)1026553505152表1表示Si02比表面積及顆粒直徑對APTT測值有影響，隨比表面積的增加、顆粒直徑的減小明顯縮短了血漿的凝結(jié)時(shí)間，當(dāng)比表面積大于140mVg、顆粒直徑小于15nm時(shí)，試劑中納米Si02不但改善了敏感性，而且測值趨于穩(wěn)定。納米二氧化硅的最佳的顆粒直徑為10—12nm，最佳比表面積為200—210m7g。3.納米二氧化硅用量的影響選用比表面積為140mVg的二氧化硅，加入不同用量，對APTT測值也有一定影響，結(jié)果如表2。_表2納米二氧化硅用量的影響_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例4:稱取1.15gN-2-羥乙基哌嗪-N，-2-乙垸磺酸和2.25g甘氨酸于400mL無菌蒸餾水中，攪拌溶解，用pH計(jì)測定pH在7.30，否則用稀氫氧化鈉或稀鹽酸調(diào)整至7.30，加水至700mL,加入比表面積為140m2/g，粒經(jīng)為15nm的親水性納米二氧化硅0.12g，在磁力攪拌器上攪拌混合均勻，加100mg兔腦磷脂，攪拌30min，充分混合均勻，再加入0.05mmol.L-'CuS04、或NiS04、或ZnS0420mL，1%牛血清血蛋白0.5g，聚乙二醇10g,攪拌，放置4h以上即為液態(tài)測試APTT試劑，納米二氧化硅對VI1I因子的敏感性的影響如下選定一個(gè)對vin因子的敏感性曲線，參照試樣，用缺WI因子標(biāo)準(zhǔn)血漿實(shí)驗(yàn)，用生理鹽水按幾何比進(jìn)行稀釋。0.lmL這種稀釋血漿與0.lmL配制試劑混合，在37。C下預(yù)熱3分鐘，同時(shí)加0.lmLO.025mol.l/'CaCL溶液，測定凝固時(shí)間，測定結(jié)果如表3。表3對VI因子的敏感性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例5:稱取1.15gN-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸和2.25g甘氨酸于400mL無菌蒸餾水中，攪拌溶解，用pH計(jì)測定pH在7.30，否則用稀氫氧化鈉或稀鹽酸調(diào)整至7.30，加水至700mL,加入tb^f只14QnVg，f旌圣15nm的親水性納米二氧化硅0.12g，在磁力攪拌器上攪拌混合均勻，加100mL兔^f磷脂，或腦髓中灰質(zhì)部分，其靈敏度最高，攪拌30min，充分混合均勻，再分別加入0.05mmol.L—'CuCl2、或ZnCl2、或NiS。4、或MnS04、或MgS0420mL,1%牛血清血蛋白0.5g，聚乙二醇3.Og,攪拌，放置4h以上即為液態(tài)測試APTT試劑，不同離子對APTT敏感性的影響結(jié)果如表4。_表4不同金屬離子對APTT測值的影響_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定試劑，其特征是該試劑由下述的原料配置而成試劑固體激活劑0.05～0.5g/L；磷脂20～200mg/L；二價(jià)金屬離子鹽0.1～10mmol/L；穩(wěn)定劑0.1-0.5g/L；聚乙二醇PEG0.1～10g/L；緩沖劑0.05～4.0g/L；復(fù)興劑2.0～5.0g/L；其余是水。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定試劑，其特征是所述的磷脂是指源于兔腦的腦磷脂或者牛腦的腦磷脂，特別是來源于腦髓中灰質(zhì)部分靈敏度最高。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定試劑，其特征是所述的試劑固體激活劑是納米二氧化硅，并為親水性二氧化硅，其比表面積大于140m7g以上，其顆粒直徑在15-6nm之間，最佳的比表面積是200—210m7g，顆粒直徑為10—12歷。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定試劑，其特征是所述的二價(jià)金屬離子鹽是指二價(jià)金屬離子的硫酸鹽或氯鹽。5、根據(jù)權(quán)利要4所述的活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定試劑，其特征是-所述的硫酸鹽是CuS04、NiS04、ZnS04、MnS04、MgSO"氯鹽是CuCl2、ZnCl2、MgCl2。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定試劑，其特征是所述的穩(wěn)定劑是牛血清血白蛋白。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定試劑，其特征是所述的緩沖劑是指N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙垸磺酸-甘氮酸緩沖劑，三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖劑。...8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定試劑，其特征是所述的聚乙二醇是指的聚合度在20008000之間的聚乙二醇，最佳聚合度在40006000之間。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定試劑，其特征是所述的復(fù)興劑是甘露醇、海藻糖。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的活化部分凝血活酶時(shí)間(APTp測定試劑，其特征是所述的試劑的制備方法如下稱取O.052.OgN-2-羥乙基哌嗪-N，-2-乙烷磺酸和O.14.0g甘氨酸于400mL無菌蒸餾水中，攪拌溶解，用稀NaOH或稀鹽酸調(diào)整pH至7.30，定容至700mL，加納米二氧化硅0.050.5g，在磁力攪拌器上攪拌混合均勻，加20200mg兔腦磷脂，攪拌30min，充分混合均勻，再加入0.l10mmolMnCl220mL，1%牛血清血白蛋白0.1-0.5g,聚乙二醇0.l10g，攪拌，放置4h以上即為液態(tài)測試APTT試劑，再加入2.05.0g甘露醇，其余用水補(bǔ)足，使其體積為1L，即為測定活化部分凝血活酶時(shí)間APTT的試劑；凍干保存。全文摘要本發(fā)明涉及一種醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)方面止血與血栓方面的檢測試劑，特別是一種可用于測定血漿中活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)測定試劑，其特征是該試劑由下述的原料配置而成試劑固體激活劑0.05～0.5g/L；磷脂20～200mg/L；二價(jià)金屬離子鹽0.1～10mmol/L；穩(wěn)定劑0.1-0.5g/L；聚乙二醇PEG0.1～10g/L；緩沖劑0.05～4.0g/L；復(fù)興劑2.0～5.0g/L；其余是水。它是一種滿足APTT測定的高穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)試劑，其操作簡單，價(jià)格合適以及活化時(shí)間短、且靈敏度高。文檔編號G01N33/86GK101226201SQ20081001752公開日2008年7月23日申請日期2008年2月5日優(yōu)先權(quán)日2008年2月5日發(fā)明者楊勝科,費(fèi)曉華申請人:長安大學(xué)