專利名稱：：用于側(cè)流分析的測試條的制作方法用于側(cè)流分析的測試條
背景技術：
：發(fā)明領域本發(fā)明主要涉及用于快速分析的測試裝置，更具體地涉及用于新型側(cè)流分析的裝置和方法。
背景技術：
：對于包括醫(yī)療診斷、環(huán)境監(jiān)測、法醫(yī)毒理學和食物病原體測試的各種應用，用于檢測生物化合物存在的快速診斷體外分析已經(jīng)變?yōu)槌Ｒ?guī)手段。近年來，該領域中對于新的、廉價的和敏感的快速分析的不斷增長的需要已經(jīng)產(chǎn)生了許多新的發(fā)展。然而，仍然不斷需要新的和改進的檢測方法以及更高靈敏度和更低成本的裝置。特別是，對于可由未經(jīng)訓練的人使用的低成本即時臨床診斷試劑盒，存在巨大的需求。進行一步法快速分析的一種通用形式是側(cè)流分析技術，其中將樣品應用于用分析特效試劑預處理過的測試條的一端。通過毛細管作用沿所述測試條引導祥品，穿過指示劑區(qū)域，其中出現(xiàn)可見的或另外可檢測到的信號表明樣品中存在被分析物。所述指示劑區(qū)域通常包括許多在規(guī)定區(qū)域內(nèi)固定至所述測試條的特定結合對，其通常是線。所述測試條還可以包括標記區(qū)域，位于樣品應用區(qū)域的下游，具有標記物質(zhì)。這樣進行側(cè)流分析通過將疑似包含分析物的樣品應用于樣品接受端，并使得它能通過毛細管作用沿著所述條前進，以當其存在時獲得標記化合物，并進一步在下游待被捕獲和在檢測/捕獲區(qū)域集中。有許多這種基本結構的變化形式，關于位于沿所述條的固定、標記和其他物質(zhì)的數(shù)量和性質(zhì)以及它們與被分析物的相互作用，以及可檢測信號的性質(zhì)和形成。例如，可檢測信號不一定由固定物質(zhì)與分析物之間的直接相互作用產(chǎn)生，而是取決于特定的分析和條結構，可能由與二次產(chǎn)物的間接相互作用產(chǎn)生，該二次產(chǎn)物在固定物質(zhì)的上游形成并且它的產(chǎn)生需要分析物的存在。根據(jù)其他的變化形式，當檢測區(qū)域位于捕獲區(qū)域下游時，固定試劑可以用于捕獲未反應的上游試劑，例如未結合的標記試劑。然而，大多數(shù)情況下，現(xiàn)有技術的側(cè)流條包括至少一種預固定試劑。本發(fā)明提供一種用于側(cè)流分析的新型條，其中所有的檢測反應物可移動地結合到所述條，并且其中捕獲區(qū)域形成在兩個順序排序的不同特征的流動基質(zhì)間的界面上。特別是，本發(fā)明的條適用但不限于體液中酶或者酶底物的檢測。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個方面是用于流體樣品中分析物檢測的測試條，其沒有預固定的試劑。所述條包含順序排列以在其間形成接合點的第一和第二流動基質(zhì)，其中第一流動基質(zhì)包含可移動地結合至其上的檢測組合物，并且其中所述檢測組合物的至少一種組分可以干燥形式預先沉積在第一基質(zhì)上。選擇所述檢測組合物，使得當其接觸分析物時產(chǎn)生至少一種可檢測的產(chǎn)物。選擇第一和第二固體基質(zhì)，使得當流體樣品從第一基質(zhì)行進至第二基質(zhì)時，所述至少一種可檢測的產(chǎn)物在基質(zhì)之間的接合點處聚集。第一基質(zhì)與第二基質(zhì)相比具有更高的孔隙率，以使得所述可檢測的產(chǎn)物能以更高的滲透速率通過第一基質(zhì)。優(yōu)選地，當所述至少一種可檢測的產(chǎn)物不溶于樣品流體中時，所述檢測組合物的組分可溶于樣品流體中。優(yōu)選地，第一和第二基質(zhì)被夾在背襯和上部非滲透性的層壓材料之間，其中所述背襯和上部層壓材料的至少一個是透明的或者半透明的。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，使所述條成形以用于檢測流體樣品中的酶活性。根據(jù)該實施方式，所述檢測組合物包含在分析中對酶具有特異性的顯色底物試劑體系。所述顯色底物試劑體系可以包括顯色的酶底物，諸如含吲哚酚的底物，其在接觸酶時得到有色的產(chǎn)物?；蛘?，所述顯色底物試劑體系可以包含酶底物和顯色試劑的混合物，其中在酶與酶底物之間的酶促反應存在下，所述顯色試劑產(chǎn)生可檢測到的有色產(chǎn)物。優(yōu)選地，當所述有色產(chǎn)物在樣品流體中不可溶時，所述顯色底物試劑體系的組分可溶于樣品流體中。本發(fā)明的第二個方面是用于測定流體樣品中的分析物的方法，其包含以下步驟提供如上定義的本發(fā)明的新型測試條；使所述測試條接觸流體樣品；并且在兩種基質(zhì)之間的界面處觀察到出現(xiàn)了明顯的變化，優(yōu)選顏色變化，其中出現(xiàn)的明顯變化表明流體樣品中所述分析物的存在。本發(fā)明的第三個方面是適用于流體樣品中分析物檢測的條的制造方法，所述方法包含以下步驟選擇用于檢測所述分析物的檢測組合物，選擇所述檢測組合物以便在與所述分析物接觸時產(chǎn)生至少一種可檢測的產(chǎn)物；選擇特征不同的第一和第二流動基質(zhì)，使得當樣品從第一基質(zhì)行進到第二基質(zhì)時，至少一種可檢測的產(chǎn)物保留在所述第一和第二基質(zhì)之間的界面處；將第一和第二基質(zhì)以順序排序的方式排列在非吸收性的載體上，以便在其間形成界面；以及將預定量的檢測組合物提供給第一基質(zhì)。結合附圖，從以下詳細說明中將更充分地理解和領會本發(fā)明圖1和2分別是根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施方案構造的側(cè)流條的分解側(cè)視圖和俯視圖3是在本發(fā)明的側(cè)流條上獲得的陽性信號的示意圖。圖4是說明書實施例1~3所用條的構造圖的分解視圖，說明了不同條層的尺寸和相對位置。圖5顯示了用本發(fā)明構造用于唾液酸酶檢測的側(cè)流條得到的示例性結果；左邊的條顯示了用脆弱類桿菌(B.fragilis)的樣品得到的結7果；右邊的條顯示了用運行緩沖液的對照實驗；條在培育10分鐘后掃描。圖6顯示了用本發(fā)明構造用于檢測堿性磷酸酶(AP)的側(cè)流條得到的示例性結果；圖7顯示了用本發(fā)明構造用于檢測過氧化物酶(POD)的側(cè)流條得到的示例性結果。優(yōu)選實施方式的詳細說明本發(fā)明提供一種用于測定流體樣品(包括人類、動物或者人造的樣品)中分析物的新型的側(cè)流分析條。本發(fā)明的條能被用于定性的、半定量的或者定量的檢測。本發(fā)明還提供用于制造和使用所述條的方法。本發(fā)明的條適用于樣品流體中，更特別是體液中酶活性的檢測，但不限于此。在生物或化學樣品(諸如完整的有機體、細胞或者細胞提取物、生物流體或者化學混合物)的分析中，酶活性的檢測是有用的。特別是，體液中的酶水平表示健康狀況。某些酶的活性評價可以提供關于新陳代謝、疾病狀態(tài)和病毒和細菌病原體身份的信息。本發(fā)明的條包含至少兩個順序排序的、不同特征的固態(tài)流動基質(zhì)，其中所有的檢測反應物可移動地結合到第一基質(zhì)，并且其中在兩個流動基質(zhì)間的界面上形成捕獲區(qū)域。在第一或者第二基質(zhì)上不提供固定試劑。本申請通篇中使用的術語"流動基質(zhì)"是指任何液體可滲透的運輸固體材料，其使得液體能通過其流動，該材料包括諸如硝化纖維、尼龍、人造絲、纖維素、紙、玻璃纖維和硅石或者任何其他多孔的、纖維的、吸水的或非吸水的材料。優(yōu)選所述流動基質(zhì)被成形為基本平坦的細長條。所述流動基質(zhì)材料可按需要預先處理或者改變。參考圖l和2，其中表示本發(fā)明的條，通常標示為10。條10包含兩種流動基質(zhì)，樣品接收固體基質(zhì)2和反應固體基質(zhì)4順序排列在背8襯層15上，以形成約l~5mm長的界面區(qū)域8，其中在界面區(qū)域8處基質(zhì)2和4重疊。界面重疊區(qū)域8是信號區(qū)，其中可檢測到的變化，通常是顏色變化在陽性測定時出現(xiàn)。選擇基質(zhì)2和4以具有不同的孔隙率，并因此具有不同的滲透速率。特別是，選擇基質(zhì)使得通過基質(zhì)2的滲透速率高于通過基質(zhì)4的滲透速率?；|(zhì)2可以是玻璃纖維(GF)、濾紙或者任何其他本領域已知的具有相對大的孔徑的過濾或網(wǎng)狀介質(zhì)，優(yōu)選纖維材料。基質(zhì)4優(yōu)選但不限于硝化纖維(NC)或尼龍膜。優(yōu)選地，膜4的孔徑在約0.22pm約15lam的范圍內(nèi)。根據(jù)特定的分析(設計條用于該分析)及其可檢測的產(chǎn)物選擇特定的膜4，使得可檢測的產(chǎn)物保留在界面8。所述條還包括吸收墊6以確保樣品的連續(xù)流動，以及上部層壓材料25。使上部層壓材料25成形以充分地覆蓋膜4以及部分地覆蓋膜2和吸收墊6，留出未覆蓋的膜2的部分20(樣品將要應用于此)和暴露的襯墊6的大部分。吸收墊6由吸水材料制得，諸如纖維素或濾紙，使得液體被吸引通過基質(zhì)2和4并且聚集在吸收墊6中。根據(jù)將要用于分析的液體體積，選擇襯墊6的尺寸和形狀。通常用于襯墊6的材料包括但不限于纖維素和濾紙。背部和上部層壓材料15和25是非吸收性的膜。優(yōu)選地，膜15和25是透明的或半透明的膜，使得從條的兩側(cè)能觀察信號。然而，在某些應用中，在一側(cè)使用白色膜并在另一側(cè)使用透明膜能夠增加信號區(qū)的對比度。為了便于制造，層壓材料15和25優(yōu)選是由隔離襯里保護的一側(cè)有粘性的塑料膜。在實踐中，通過將層壓材料15以粘性側(cè)向上的方式放置，剝落隔離襯里并如圖1所示在襯里15上放置基質(zhì)2、4和6，從而組裝條10。為了完成組裝，將層壓材料25以有粘性的側(cè)面向下放置的方式置于上面。分析物特定檢測組合物可移動地放置在樣品接收基質(zhì)2上。檢測組合物包含這樣的試劑，其在分析物存在下會產(chǎn)生至少一種聚集在基質(zhì)2和4之間的界面8處的可檢測的產(chǎn)物。為了提高信號強度，檢測組合物還可以包含表面活性劑。在酶的分析中，例如唾液酸酶分析中，檢測組合物可以包含顯色酶底物，比如5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-a-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸(BCIN)，其在唾液酸酶存在下產(chǎn)生吲哚酚，以及顯色試劑，諸如四唑鎗鹽，其與吲哚酚反應產(chǎn)生強烈著色的不溶性靛藍和甲臘染料。在酶分析的其他實例中，檢測組合物可以包含酶底物和顯色試劑的混合物，所述顯色試劑參與酶促反應以產(chǎn)生可檢測的產(chǎn)物。這樣的顯色試劑可以是例如參與酶的電子傳遞鏈的電子受體或電子供體。例如，使用包含脫氫酶底物和顯色電子受體(諸如四唑鑰鹽)的檢測組合物，可以檢測脫氫酶。使用包含過氧化物酶底物和顯色電子供體(諸如四甲基聯(lián)苯胺(TMB))的檢測組合物，可以檢測過氧化物酶。通常，可以這樣在現(xiàn)有裝置中完成酶分析的實現(xiàn)通過選擇相當于用于酶組織化學中的那些檢測組合物，即包括用于所關心的酶的底物以及試劑的組合物，其在酶促反應存在下得到不可溶有色的、或否則得到可檢測到的沉淀物。通過正確選擇基質(zhì)2和4，有色的沉淀物粒子保留并集中在兩種基質(zhì)間的界面處，以產(chǎn)生明顯的信號。各種檢測組分在流動基質(zhì)2上的位置可以充分地或部分地彼此重疊，或者可以包含分離的區(qū)域。類似地，樣品應用區(qū)域可以與用檢測組分浸漬的一個或多個區(qū)域重疊，或者可以是分離的區(qū)域。應該了解，可以改變在基質(zhì)2上各種區(qū)域的特定位置，只要當沿著基質(zhì)2行進并在到達基質(zhì)4之前，所有樣品組分和所有檢測組分充分混合并溶解在樣品流體內(nèi)即可，以使得能有足夠的相互作用時間。為了制造的簡化和方便，用所有檢測組分充分浸漬基質(zhì)2是便利的。因而，如果所有檢測組分的混合物在溶液中是穩(wěn)定的，則基質(zhì)2可以被浸泡在這樣的溶液內(nèi)一段預定時間，并使其干燥?；蛘?，如果溶液是不穩(wěn)定的，則基質(zhì)2可以完全地或部分地浸泡在僅包含在一起穩(wěn)定的那些組分的溶液內(nèi)。保留的組分可以加載在干燥的基質(zhì)上，或者在用溶液組分的干燥形式預浸漬的區(qū)域上，或者在自由的非浸漬區(qū)域上。還有另一個選擇是基本上在樣品加載的同時，或者之前或之后，立即將一種或多種組分加載在基質(zhì)2上。應該注意到根據(jù)本發(fā)明，檢測組合物不含預先形成的標記粒子，諸如乳液或者膠體金粒子。這種惰性粒子，結合至生物特性對的一員，通過與生物特性對的第二部分形成絡合物而作為用于產(chǎn)生信號的標記手段是本領域公知的。根據(jù)本發(fā)明，通過形成具有可檢測性質(zhì)的新產(chǎn)物而產(chǎn)生陽性信號，例如明顯的顏色，其之前在條上不存在，并且其形成需要分析物的存在。因而，與基于捕獲預沉積的有色粒子檢測的情況不同，本發(fā)明的信號基于具有新的明顯可檢測性質(zhì)的新產(chǎn)品的形成。該可檢測的產(chǎn)物，通過檢測組分與分析物間的化學反應形成，即在化學鍵形成和分裂時形成，集中在兩種基質(zhì)之間的界面處，因而增強了信號。優(yōu)選地，可檢測的產(chǎn)物在樣品流體中是不可溶的，以便形成被第二、滲透性較低的基質(zhì)保留的沉淀物粒子，而檢測組合物僅包含完全溶解在洗脫流體中的試劑。為了進行測試，樣品和洗脫試劑(通常是運行緩沖液)加載于襯墊2的暴露端20。通常，樣品是水溶液或者生物流體。樣品可以被作為一種溶液預先加入將要加載的運行緩沖液，或者可以在樣品點樣后加載運行緩沖液。當樣品溶液沿條移動時，隨樣品液體沿著條行進，所述預沉積的檢測組分被再次溶解于所述待與樣品組分混合并反應的溶液內(nèi)。因而，在上面給定的酶實例中，如果酶存在于樣品中，顯色的底物裂開以得到顯色的中間體，該中間體進一步與顯色試劑反應以得到強烈著色的產(chǎn)物。有色產(chǎn)物聚集在兩種基質(zhì)間的重疊界面8處，以產(chǎn)生清楚突出的信號線。參考圖3,由在信號區(qū)8處出現(xiàn)的明顯的線30表示陽性結果，而信號區(qū)處不存在這種線則表示陰性結果。對應于測試樣品中分析物的存在或不存在，本發(fā)明的側(cè)流條可用于以定性的方式以給出陽性/陰性響應。根據(jù)該實施方式，所述條可以被引入側(cè)流裝置中，該裝置具有用于加載樣品的接收口以及在信號區(qū)的至少一個透明窗，因而提供了無需附加設備的簡單自容式檢測裝置?？梢杂眯噬蕪姸鹊燃壴黾訁⒖?，以通過將信號強度匹配至校準等級而得到半定量的測量?；蛘呖梢酝ㄟ^儀器讀條，所述儀器例如但不11限于分光光度計、掃描儀、光密度計、讀出器、照相機，以給出定量的結果。如前面所述，因為可以從條的兩側(cè)觀察信號，這使得能測量信號的吸收以及反射。以下給出的詳細實施例僅為了說明目的，而非意欲將本發(fā)明限制為其所描述的內(nèi)容。實施例1:唾液酸酶測試條根據(jù)本發(fā)明，如下所述構造用于檢測流體樣品中唾液酸酶活性的唾液酸酶測試條。所述分析基于顯色的唾液酸酶底物5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-a-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸(BCIN)在唾液酸酶存在下的水解以得到吲哚酚，和所產(chǎn)生的吲哚酚與硝基四氮唑藍(NBT)進一步反應，以產(chǎn)生聚集在兩基質(zhì)間的界面處的靛藍和甲臘。BCIN和NBT的化學結構以及分析反應的詳細反應示意圖在標題為"干燥形式唾液酸酶分析"的共同未決申請中出現(xiàn)，該申請與本發(fā)明提交日期相同并轉(zhuǎn)讓給相同的受讓人，其全部內(nèi)容此處并入作為參考。用包括陰道拭子樣品的所述條測試各種樣品，用于檢測細菌性陰道病(BV)。A.制備NBT浸漬的樣品墊在暗處于室溫下，將玻璃纖維濾材(微孔，GFCP0010000，10mmX10cm)浸泡于NBT溶液中30分鐘。將浸透的玻璃纖維濾材放置在吸水紙上以除去過量的流體，然后轉(zhuǎn)移至干燥箱在50'C下15分鐘。將干燥的NBT浸漬玻璃纖維濾材(樣品墊)在室溫下儲存在干燥且黑暗的干燥房間(相對濕度510%)中。B.卡的組裝根據(jù)以下步驟并根據(jù)圖4組裝測試卡，圖4詳細說明了每個卡組件精確的縱向尺寸和位置。在制備之后，修整該卡以獲得多個用于唾液酸酶分析的條。1.用帶有隔離襯里保護粘合劑的、43X250mm的清潔塑料膜片作12為背部層壓材料，在圖2中用15標示，(ARcare8876，AdhesivesResearch,Limerick,愛爾蘭)置于工作臺的頂部。剝落隔離襯里以暴露出該帶的粘合劑側(cè)。2.將反應膜(硝化纖維HF18004，微孔，SA3J154101，25X300mm，或者BiodyneB，PALL，BNBZF3RT，25X300mm，或者BiodynePLUS,PALL，ZNXG3R，25X300mm)附著在背部覆蓋物的粘合劑側(cè)上，距下端8mm。3.將NBT浸漬的樣品墊(如A部分所述制備)附著在背部覆蓋物下側(cè)上，與反應膜的頂部重疊2mm。4.將吸收墊(凝膠吸水紙，S&S，GB003，21X300mm)放置于背部覆蓋物上側(cè)的頂部，與反應膜在頂部重疊12mm。5.將頂部層壓材料膜(ARcare7759，AdhesivesResearch,Limerick,愛爾蘭)的隔離襯里剝落，以暴露出粘合劑側(cè)，并將該膜用粘合劑面面向反應膜的頂部附著，與樣品墊和吸收墊的頂部重疊。在室溫下于暗處在干燥室內(nèi)(相對濕度5~10%)固化所述都卡過夜。固化之后，使用自動模具切割機修整所述卡得到4mm寬的條。C.在條樣品墊上浸漬BCIN將lpl的BCIN(5-溴代-4-氯代-3-卩引哚基-cc-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸)溶液加至樣品墊的頂部，并使其在37'C干燥15分鐘。D.用唾液酸酶測試條進行測試Dl.細菌的和純化的唾液酸酶樣品使用產(chǎn)生唾液酸酶的細菌樣品，將如以上部分B所述構造的條用于唾液酸酶活性的測試脆弱類桿菌(Bacteroidesfragilis)、唾液酸酶陰性細菌植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和純化的唾液酸酶。將25pl的樣品加載在條的樣品墊上開始測試。陽性唾液酸酶反應的信號，褐紫色，聚集在兩不同的基質(zhì)(樣品墊和反應膜)之間的界面處，即信號區(qū)處。陰性對照(其中沒有唾液酸酶存在)在信號區(qū)顯示出黃色背景。記錄每個測試信號的出現(xiàn)時間。觀察條直到30分鐘。圖5表示用脆弱類桿菌的樣品(左邊的條)和用運行緩沖液(右邊的條)作為陰性對照得到的示例性結果。肉眼可觀察到信號區(qū)的顏色變化，并對應于通過眼睛估測的強度指定"+"值(見表1)。作為選擇或者此外，能夠通過電子光學儀器檢測和測量顏色。從將樣品加載到測試條的信號出現(xiàn)時間，和10分鐘時的信號強度總結在隨后的表1中。表l:通過唾液酸酶測試條獲得的結果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*相對信號強度非常強(++++)，強(+++),中等(++),弱(+)和無信號(國)。D2.臨床的樣品(陰道拭子)測試47例臨床樣品以測試唾液酸酶測試條用于診斷細菌性陰道病BV的臨床意義。從以色列，Holon，Wolfson醫(yī)療中心的泌尿生殖感染單位的志愿者處獲得陰道排出物樣品。由醫(yī)師使用無菌拭子(552C，Copan，意大利)收集陰道排出物。拭子頭(尖端)放置在2ml的螺旋帽管內(nèi)，并保持在4t:直到使用。通過將300^1的運行緩沖液加入管中，并通過渦流從拭子洗脫分泌物1分鐘，從而清洗陰道拭子并獲得同質(zhì)的樣品。對于每個陰道拭子，使用革蘭氏染色法和Nugent評分(RPNugent等人，ReliabilityofDiagnosingBacterialVaginosisIsImprovedbyaStandardizedMethodofGramStainInterpretation(J.Clin.Microbiol.,29:297~301(1999)))進行BV的診斷。從300iil拭子洗液，取出25^1用于測試。如上所述進行對于培養(yǎng)樣品的測試。表2總結了47例用于BV診斷和用唾液酸酶測試條測試的陰道拭子洗液的結果。表2:通過Nugent評分用于BV診斷的47例陰道拭子由唾液酸酶測試條獲得的結果N-47BV(Nugent評分)陽性陰性唾液酸酶測試條陽性220陰性025總計2225唾液酸酶測試條的靈敏度和專一性是100%?？偨Y在表1和2中的結果清楚地證明了提到的唾液酸酶測試條能被使用于BV的診斷。唾液酸酶分析用溶液的材料和制備NBT溶液2mg/ml的NBT(氯化硝基四氮唑藍，N-8100BiosynthAG,瑞士)，5%的蔗糖(5553810，F(xiàn)rutarom，Haifa,以色列)，0.1%的MgClz(1200310，Merck,Darmstadt,德國)在50mM的MES(M-8250,Sigma-Aldrich，Rehovoth，以色列)緩沖液中，pH6.0;具有Surfynol-440的NBT溶液2mg/ml的NBT(氯化硝基四氮唑藍，N-8100BiosynthAG，瑞士)，5%的蔗糖(5553810，F(xiàn)rutarom，Haifa,15以色列)，0."/o的MgCl2(1200310，Merck，Darmstadt,德國)，0.5%的surfynol-440(2,4，7，9-四甲基-5-癸炔-4,7-二醇乙氧基化物，1.75EO/OH，Aldrich，461180)在50mM的MES(M-8250，Sigma-Aldrich，Rehovoth，以色列)緩沖液中，pH6.0;BCIN溶液35.3mg的BCIN(5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-a-D-N-乙酰神經(jīng)氨酸鈉鹽，B4666，Sigma)在lml的重蒸餾水中；運行緩沖液0.5%的PEG(PolyEthyleneGlycol國15000，Merck，819003)，0.5%的BSA(01200050，Seracare，CA，美國)，0.1%的吐溫20(Sigma，P-5927)，0.1。/。的MgCl2(Merck1200310)在TBS(Tris緩沖鹽水)中，pH7.8。細菌培養(yǎng)產(chǎn)生唾液酸酶的細菌脆弱類桿菌(ATCC#23745)的培養(yǎng)，107菌落形成單位/ml。通過在運行緩沖液中稀釋培養(yǎng)物至以下細胞數(shù)制備25|!1的樣品5X104，2.5X104，104和5乂103。唾液酸酶陰性的細菌植物乳桿菌(ATCC#14917)的培養(yǎng)，1()S菌落形成單位/ml。通過在運行緩沖液中稀釋培養(yǎng)物制備具有5乂105個細胞的25^il樣品。純化的唾液酸酶得自產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)(P0720L，神經(jīng)氨酸酶)的純化重組細菌唾液酸酶，得自NewEnglandBiolabs，MA,美國。通過在運行緩沖液中稀釋純化的唾液酸酶至以下水平制備25^1的樣品每個樣品5單位和1單位。實施例2:堿性磷酸酶測試條類似上述實施例1的方式，構造用于檢測流體樣品中堿性磷酸酶(AP)活性的測試條。分析基于顯色的磷酸酶底物5-溴代-4-氯代-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)在AP存在下的水解以得到吲哚酚，以及所產(chǎn)生的吲哚酚與氯化硝基四氮唑藍(NBT)的進一步反應，以產(chǎn)生聚集在兩基質(zhì)間的界面處的靛藍和甲臘。本實施例與上面實施例所述條之間的主要區(qū)別在于，本實施例中樣品接收基質(zhì)被浸在同時包含顯色的底物BCIP和顯色試劑NBT的溶液中。A.制備BCIP-NBT浸漬的樣品墊在暗處于室溫下，將玻璃纖維濾材(微孔，GFCP0010000，10mmX10cm)浸在BCIP-NBT溶液(0.2mg/ml的BCIP+0.3mg/ml的NBT，在0.1M的Tris緩沖液中，pH9.6)30分鐘。將玻璃纖維濾材轉(zhuǎn)移至干燥箱中，并在5(TC干燥15分鐘。將BCIP-NBT浸漬的玻璃纖維濾材(樣品墊)在室溫下儲存在干燥且黑暗的干燥房間(相對濕度5~10%)中。B.卡的組裝和條的修整根據(jù)以下步驟并根據(jù)圖4組裝測試卡，圖4說明了每個卡組件精確的縱向尺寸和位置。在制備之后，修整該卡以形成多個用于AP分析的條。1.將帶有隔離襯里保護的粘合劑的清潔塑料膜，即背面覆蓋物，43X250mm的片(ARcare8876，AdhesivesResearch,Limerick,愛爾蘭)放置在工作臺的頂部。剝落隔離襯里以暴露出該帶的粘合劑側(cè)。2.將反應膜(硝化纖維HF18004，微孔，SA3J154101，25X300mm)附著于背部覆蓋物的粘合劑側(cè)上，距下端8mm。3.將BCIP-NBT浸漬的樣品墊附著于背部覆蓋物下側(cè)上，并與反應膜的頂部重疊2mm。4.將吸收墊(凝膠吸水紙，S&S，GB003，21X300mm)置于背部覆蓋物上側(cè)的頂部，與反應膜在頂部重疊12mm。5.將頂部層壓材料膜(ARcare7759，AdhesivesResearch,Limerick,愛爾蘭)的隔離襯里剝落，以暴露出粘合劑側(cè)，并將該膜以粘合劑面向反應膜的頂部附著，與樣品墊和吸收墊的頂部重疊。C.用抗地高辛AP測試堿性磷酸酶(AP)的活性a.通過在pH7.8的TBS(Tris緩沖鹽水)中稀釋抗地高辛AP(Roche10932740.75單位/>1)至以下水平制備25|il的樣品0.0375單位/測試，0.00375單位/測試和0.000375單位/測試。b.將25^的樣品加載在條的樣品墊上。結果測試結果顯示在圖6中。陽性反應的信號，褐紫色，聚集在兩個不同的基質(zhì)(樣品墊和反應膜)之間的界面處，即信號區(qū)處。陰性對照(其中沒有抗地高辛ap存在)未顯示任何信號。所有的陽性信號在3分鐘之內(nèi)出現(xiàn)。實施例3:過氧化物酶測試條類似上述實施例1和2的方式，構造用于檢測流體樣品中過氧化物酶(POD)活性的測試條。然而在該實施例中，樣品接收基質(zhì)不用檢測試劑浸漬，而是以它清潔未處理的形式組裝入條。在即將加載樣品之前，以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)作為顯色物，將顯色的過氧化物酶底物混合物的可商購獲得溶液加載在條上。在過氧化物酶存在下，TMB底物混合物產(chǎn)生有色的產(chǎn)物。測試兩個不同的TMB過氧化物酶底物混合物，SigmaT0565和Pierce#34028。Sigma底物報告得到不可溶的產(chǎn)品并推薦用于膜應用。Pierce底物得到可溶性產(chǎn)物底物并將用于ELISA。A.運行緩沖液0.5%的PEG(PolyEthyleneGlycol-15000，Merck,81卯03)，0.5%的BSA(01200050，Seracare，CA，美國)，0.1%的吐溫20(Sigma，P-5927)，0.1。/。的MgCl2(Merck1200310)在TBS(Tris緩沖液鹽水)中，pH7.8。B.卡組裝和條修整根據(jù)以下步驟并根據(jù)圖4組裝測試卡，圖4說明了每個卡組件精18確的縱向尺寸和位置。在制備之后，修整該卡以形成多個用于POD分析的條。1.將帶有隔離襯里保護的粘合劑的清潔的塑料膜，即背面覆蓋物，43X250mm的片(ARcare8876，AdhesivesResearch,Limerick,愛爾蘭)放置在工作臺的頂部。剝落隔離襯里以暴露所述帶的粘合劑側(cè)。2.將反應膜(硝化纖維HF18004，微孔，SA3J154101，25X300mm)附著于背部覆蓋物粘合劑側(cè)上，距下端8mm。3.將樣品墊(玻璃纖維濾材，微孔GFCPOOIOOOO，10mmX10cm)附著于背部覆蓋物下側(cè)上，與反應膜頂部重疊2mm。4.將吸收墊(凝膠吸水紙，S&S，GB003，21X300mm)放置于背部覆蓋物上側(cè)的頂部，與反應膜在頂部重疊12mm。5.將頂部層壓材料膜(ARcare7759，AdhesivesResearch,Limerick,愛爾蘭)的隔離襯里剝落，以暴露出粘合劑側(cè)，并將該膜以粘合劑面向反應膜的頂部附著，與樣品墊和吸收墊的頂部重疊。C.用抗地高辛POD測試過氧化物酶(POD)的活性a.通過在運行緩沖液中稀釋抗地高辛POD(Roche1207733，0.15單位/pl)至以下水平制備25pl樣品7.5單位/測試，0.75單位/測試和0.075單位/測試。b.將5^的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物混合物(SigmaT0565或Pierce#34028)放置在條的樣品墊上。c.將25fil的樣品加載在樣品墊的頂部。結果圖7顯示了用Sigma底物和Pierce底物獲得的結果。陽性反應的信號，藍紫色，聚集在樣品墊和兩個不同的基質(zhì)(樣品墊和反應膜)之間的界面處，即信號區(qū)處。陰性對照(其中沒有抗地高辛POD存在)未顯示任何信號。所有的陽性信號在3分鐘之內(nèi)出現(xiàn)。本領域普通技術人員將領會本發(fā)明并不限于在上文中特別給出和描述的那些內(nèi)容。相反，本發(fā)明的范圍有附隨的權利要求所限定。20權利要求1.一種為檢測流體樣品中被分析物而構造的測試條，所述條包括順序排列以在其間形成界面的第一流動基質(zhì)和第二流動基質(zhì)，所述第一流動基質(zhì)包括可移動地結合至其上的檢測組合物，其中所述檢測組合物在所述被分析物存在下產(chǎn)生至少一種可檢測的產(chǎn)物，并且其中選擇所述第一和第二固體基質(zhì)，使得當流體樣品從所述第一流動基質(zhì)行進到所述第二流動基質(zhì)時，所述至少一種可檢測的產(chǎn)物聚集在所述界面處。2.如權利要求l所述的條，其中將所述檢測組合物的至少一種組份以可再次溶解的干燥形式沉積在所述第一基質(zhì)上。3.如權利要求l所述的條，其中所述第一基質(zhì)的孔隙率比所述第二基質(zhì)的孔隙率高。4.如權利要求l所述的條，其中所述至少一種可檢測的產(chǎn)物通過第一基質(zhì)的傳送速率高于所述至少一種可檢測的產(chǎn)物通過第二基質(zhì)的傳送速率。5.如權利要求l所述的條，其中所述第一基質(zhì)是玻璃纖維或者濾紙，以及其中所述第二基質(zhì)是硝化纖維或者尼龍膜。6.如權利要求l所述的條，其中所述至少一種產(chǎn)物在樣品流體中是不溶的。7.如權利要求l所述的條，其中所述檢測組合物在樣品流體中是能溶的。8.如權利要求l所述的條，其中所述第一和第二基質(zhì)被夾在背襯和上部非滲透性層壓材料之間。9.如權利要求8所述的條，其中所述背襯和上部層壓材料的至少一個是透明的或者半透明的。10.如權利要求1所述的條，其中所述被分析物是酶，并且其中所述檢測組合物包括對所述酶具有特異性的顯色底物試劑體系。11.一種用于檢測流體樣品中酶的條，所述條包括順序排列在非吸收性固體載體上的第一基質(zhì)和第二基質(zhì)，其間形成接合點，其中所述第一基質(zhì)具有可移動結合的酶檢測組合物，所述組合物包括在暴露于所述酶時會產(chǎn)生至少一種可檢測產(chǎn)物的組份的組合；并且其中選擇所述第一和第二基質(zhì)，使得當流體樣品從所述第一流動基質(zhì)行進到所述第二流動基質(zhì)時，所述至少一種可檢測的產(chǎn)物在所述接合點處聚集。12.如權利要求11所述的條，中是不溶的。13.如權利要求11所述的條，的顯色底物。14.如權利要求13所述的條，劑。15.如權利要求13所述的條，16.如權利要求15所述的條，嗡鹽。其中所述可檢測的產(chǎn)物在樣品流體其中所述酶檢測組合物包括所述酶其中所述酶檢測組合物還包括增色其中所述底物包括吲哚酚基團。其中所述酶檢測組合物還包括四唑17.如權利要求ll所述的條，其中所述酶檢測組合物包括所述酶的底物和顯色試劑，其中在酶與酶底物之間的酶促反應存在下，所述顯色試劑產(chǎn)生可檢測到的有色產(chǎn)物。18.如權利要求17所述的條，其中所述顯色試劑是電子供體或者電子受體。19.用于檢測流體樣品中被分析物的方法，所述方法包括以下步驟提供如權利要求110任一項所限定的測試裝置；將所述測試裝置暴露于所述流體樣品；并且觀察顏色變化的出現(xiàn)；其中出現(xiàn)顯著顏色變化表明在所述流體樣品中存在被分析物。20.用于制造適于檢測流體樣品中被分析物的測試裝置的方法，所述方法包括以下步驟選擇用于檢測所述被分析物的檢測組合物，選擇所述檢測組合物使其在暴露于所述被分析物時產(chǎn)生至少一種能檢測到的產(chǎn)物；選擇特征不同的第一和第二流動基質(zhì)，選擇所述第一和第二流動基質(zhì)以使得當所述樣品從第一基質(zhì)行進到第二基質(zhì)時，所述至少一種能檢測到的產(chǎn)物保留在所述第一和第二基質(zhì)間的界面處；以順序方式在非吸收性載體上排列第一和第二基質(zhì)，使得在其間形成界面；并且使所述第一基質(zhì)具有預定量的所述檢測組合物。全文摘要本發(fā)明提供了用于檢測流體樣品中分析物而構造的測試條，以及用于制造和使用測試條的方法。測試條包含順序排列以在其間形成界面的第一流動基質(zhì)和第二流動基質(zhì)。第一流動基質(zhì)包含可移動地結合至其上的檢測組合物，其中當暴露于分析物時，檢測組合物產(chǎn)生至少一種可檢測的產(chǎn)物，并且其中選擇第一和第二固體基質(zhì)使得當流體樣品從第一流動基質(zhì)行進到第二流動基質(zhì)時，至少一種可檢測的產(chǎn)物聚集在兩基質(zhì)間的界面處。文檔編號G01N33/52GK101501494SQ200780029795公開日2009年8月5日申請日期2007年8月8日優(yōu)先權日2006年8月10日發(fā)明者奧倫·什拉加·德沃,托默·克倫申請人:因弗因斯醫(yī)藥瑞士股份有限公司