專利名稱：聚合物骨架元素標簽的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及新類別的標記生物分子，其已經(jīng)特別地設計 成與元素分析相聯(lián)合的檢測操作，以提供高靈敏度的多重生物標記 物測定。
背景技術(shù)：
引言能夠進行精確蛋白質(zhì)定量的技術(shù)在急速發(fā)展的蛋白質(zhì)
組學和藥物發(fā)現(xiàn)領:威以及臨床和i貪斷測試領域是希望的。在分子水
平上針對分析蛋白質(zhì)合成、功能和疾病的生物學研究中，它也是重
12要的。目前，存在多個廣泛用于估計蛋白質(zhì)濃度的現(xiàn)有技術(shù)，包括 Bradford和Lowry分析、UV光i普、有才幾質(zhì)i普、HPLC 、流式細月包 儀、配體結(jié)合測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)、以及RIA(放射免 疫分析)。然而，良好建立的分析工具和研究4支術(shù)的這種泛泛分類對 于如今的挑戰(zhàn)仍然是不足夠的。這些方法的失敗涉及靈敏度、選擇 性、動態(tài)范圍、以及以精確和絕對方式同時測定多個蛋白質(zhì)濃度的 能力(多重化)的局限。元素分析對蛋白質(zhì)定量領域提供了顯著優(yōu)點 的認識已經(jīng)經(jīng)由感應耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)連接的免疫測定 (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS) linked immunoassays) "4指導開發(fā)了若干蛋白質(zhì)定量的新方法。這個新技 術(shù)才是供了在生物才羊品分析中用于ICP-MS的創(chuàng)新舞臺5;6。 ICP-MS 的獨特分析性能允許從在生物樣品中不是天然存在的非放射性元 素中選擇標簽。
定義"元素分析"是一種其中分析樣品的元素組成和/或同 ^f立素組成的方法。元素分4斤可以通過i午多方法完成，包4舌，^旦不限 于
(i) 光學原子光i普法，如，火焰原子吸收(flame atomic absorption)、石墨爐原子吸收、及感應耦合等離子體原子發(fā)射 (inductively coupled plasma atomic emission), 其4笨'測原、子的夕卜吾卩電 子結(jié)構(gòu)；
(ii) 質(zhì)譜原子光譜法，如感應耦合質(zhì)鐠法，其探測原子的質(zhì)量；
(iii) X-射線焚光法、4立子感應的x-射線發(fā)射(particle induced x-ray emission)、 x-射線光電子光譜、以及俄歇電子能i普，其4罙測原 子的內(nèi)部電子結(jié)構(gòu)。
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"元素分析4義"是采用元素分析的方法之一以用于定量 樣品的原子組成的〗義器。"粒子元素分析"是這樣一種方法，即其中由分散在液 體中的粒子(例如緩沖液中的珠粒，或生長介質(zhì)或血液中的細胞)構(gòu) 成的樣品以對單個粒子(例如，i朱4立之間、細月包之間、粒子之間)記 錄原子組成的方式進行詢問。分析4義器的實例是基于流式細胞儀的 質(zhì)譜儀、ICP-TOF、或ICP-MS或構(gòu)造用于詢問單個粒子的任何元 素分析儀。"容量或體積元素分析，'是其中分析樣品以原子組成在 整個樣品體積上進;f亍平均的方式詢問的方法。"內(nèi)標物，，限定為已知量的化合物，其不同于加入到未 知物中的分析物。將來自分析物的信號與來自內(nèi)標物的信號進行比 較，以找出存在多少分析物。當進4亍質(zhì)譜定量時，可以l吏用內(nèi)標物。 內(nèi)標物也可以通過本領域技術(shù)人員已知的其他方式使用。"生物樣品，，指的是需要分析的生物性質(zhì)的任何樣品。 例如，該樣品可以包括或可以懷疑包括動物、植物、真菌或細菌的 生物分子、組織、液體和細力包。它還包4舌病毒起源的分子。典型的 才羊品包4舌，j旦不限于，痰、血液、血細月包(如，白細月包)、組織或細 針穿刺活;險樣品、尿、腹膜液、及胸膜液、或其中的細胞。生物樣 品還可以包括組織切片，如為了組織學目的采集的冷凍切片。另一 生物才羊品的典型來源為病毒和動物、植物、纟田菌、真菌的細月包培養(yǎng) 物，其中基因表達狀態(tài)可以被操控以探索基因中的關系。生物樣品 還可以包4舌生物分子(純^:或未純^b的)的;容液，所述生物分子如蛋 白、肽、抗體、DNA、 RNA、適配子、多糖、脂質(zhì)等。其他實例是 本領域沖支術(shù)人員已知的。
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"抗體"是通常在動物血清中發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白糖蛋白
分子?？贵w可以在哺乳動物如兔、小鼠、大鼠、山羊等以及雞中制
備，或可以通過本領域技術(shù)人員已知并描述在例如美國專利No. 4,816,567中的重組方法制備。用于動物中高抗體產(chǎn)生應答的免疫和 引發(fā)的過程對于本領域技術(shù)人員是熟知的，可以在例如Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988， pages 92-115中找到?？贵w可以作為全分子、稱為Fab'和Fab2'片段的分 子片段、作為單價抗體(結(jié)合輕鏈和修飾重鏈)、以及本領域技術(shù)人 員已知的其他實例^f吏用。"初級抗體(或一抗)"為特異性結(jié)合于注射入動物中 的抗原的抗體。它們可以從動物提取或者可以通過重組方式制備。"次級抗體(或二抗)"為特異性結(jié)合于初級抗體的那 些抗體。例如，初級抗體可以;波用作注射入不同物種的動物的抗原，
以產(chǎn)生次級抗體。例如，兔次級4元鼠抗體可以通過用鼠4元體免疫兔 而制備。"抗原，，為刺激宿主機體中的免疫應答，尤其是抗體產(chǎn) 生的物質(zhì)?？乖ǔ榈鞍谆蚨嗵牵强梢詾槿魏晤愋偷姆肿?， 包括但不限于偶聯(lián)到載體蛋白的小分子(半抗原)。"生物標記物，，為分子和構(gòu)建體，其可以例如為抗原、 小分子、核苷酸、寡核香酸、DNA或RNA,其可以存在于〗又一種 類型細l包的細胞體積(cell volume)中或細力包表面上，或者其相對豐度 對于該類型的細胞是獨特的。細胞生物標記物可以用于區(qū)別該細胞 與其他細胞。例如，僅存在于一種類型細胞的細胞表面上的抗原被 稱為細胞表面生物標記物，其區(qū)別該細胞與其他細胞。本文所用的"免疫分析(免疫測定)"是指這樣的分析， 其中分沖斤物，如細月包抗原或生物標i己物通過親和性試劑如初級抗體進行4全測。例如，"免疫分析"可以為這樣的分析，其中分析物通 過標記的親和性試劑如結(jié)合于金屬標記的聚合物的初級抗體進行檢測。本文所用的"生物分子"是指任何生物學分子，包括小 生物分子，例如，但不限于脂質(zhì)、磷脂、糖脂、甾醇、維生素、 激素、神經(jīng)遞質(zhì)、碳水化合物、糖、二糖、氨基酸、核苷酸、磷酸 酯(鹽)、和單4唐；以及大生物分子，例如^f旦不限于肽、寡肽、多 肽、蛋白、核酸，即DNA、 RNA,寡糖、多#唐和朊病毒(Prion )。 其他生物分子對于本領域沖支術(shù)人員是已知的，并包括在申請人的教 導中。"親和性試劑"是能夠緊密結(jié)合于靶分子或分析物，例 如抗原或生物標記物的生物分子。例如，抗體是識別并以高親和力 結(jié)合特定抗原的親和性試劑?？股鞍祖溇?Streptavidin)是特異 性結(jié)合生物素的蛋白分子，并可以被認為是親和性試劑的另 一 實 例。其他親和性試劑對與本領域才支術(shù)人員是已知的，包括 f旦不限于 適配子、寡核苦酸、蛋白分子、凝集素和多糖。"標記的親和性試劑"是通常通過連4妄基團結(jié)合于合成 的標簽(部分)的親和性試劑(例如，抗體或適配子或寡核苷酸、多糖、 脂質(zhì)、激素、生長因子)。所述標簽可以為，但不限于，具有共價連 接的多個螯合基團的聚合物。到較大的程度，螯合基團可以具有連 接于它們的元素或多個元素。螯合階段的順序和次序取決于標記方 案。術(shù)語"4企測"在最廣泛的意義上〗吏用，以包括特定分子 的定性和定量測量。例如，在標簽(例如，標記的抗體或其他標記 的親和性試劑)的幫助下，特定抗原或生物標記物的定性和定量測量。
"元素標簽"或"標簽"是一個化學部分，其包括具有 連接到支持分子結(jié)構(gòu)的一個或多個同位素(稱為"標簽原子")的元 素或多個元素，或者其能夠結(jié)合所述元素或同位素。元素標簽還可 以包括將元素標簽連4妾到感興趣的分子或靶分子(例如，分析物)的 工具。不同的元素標簽基于標簽的元素組成可以加以區(qū)別。元素標 簽可以包括給定同位素的許多拷貝并且每個標簽中可以具有每個 同位素的可再現(xiàn)的拷貝數(shù)量。元素標簽在功能上區(qū)別于同 一樣品中 的多個其他元素標簽，因為它的元素或同位素組成不同于其他標簽 的元素或同4立素組成。術(shù)語"標簽原子"區(qū)個分一個元素標簽與另一元素標簽并 通過元素分析沖全測的元素或同位素的原子。"支持物"為已經(jīng)通過例如吡咯-2，5-二酮(馬來酰亞胺 基)、磺酸陰離子、或?qū)?氯曱基)苯乙烯官能化的表面。支持物， 例如，可以為^f旦不限于，合成力莫、5朱粒(聚苯乙烯、瓊脂^f唐、石圭石等)、 塑料微孔內(nèi)的平坦表面、載玻片、反應管等，如本領域技術(shù)人員所 已知的。 "ICP-MS"為感應耦合等離子體質(zhì)譜儀-一種靈敏的基 于質(zhì)i普的元素分析4義。不同的ICP-MS構(gòu)造主要通過所采用的質(zhì)量 選擇技術(shù)而區(qū)別，并且可以為，例如四極或飛行時間(ICP-TOF)或 扇形》茲場(高分辨率ICP-MS)。存在許多商業(yè)上可獲得的ICP-MS模 型，具有廣i普的構(gòu)造、能力和^f奮改。"聚合物"為由分子構(gòu)成的物質(zhì)，其中的分子特征為互 相連接的一個或多個種類的原子或原子群(構(gòu)成單元)的多個重復， ^:量足以」提供一組性質(zhì)，其在添加或去除一個或幾個結(jié)構(gòu)單元下不 會顯著發(fā)生改變。(IUPAC定義，參見E. S. White, J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1997, 37， 171-192)。聚合物分子可以4安照其骨架(5爭越接鏈接)，以及側(cè)基(連接到每個構(gòu)成單元的 骨架部分)來考慮。側(cè)基通常是化學和功能不同于骨架的。對于金屬 離子具有高親和力的側(cè)基可用作對于那些離子的螯合基團或配體。"共聚物"為由兩個或多個化學不同的結(jié)構(gòu)單元組成的 聚合物。"線性聚合物"為特征在于線性序列的結(jié)構(gòu)單元的聚合物。 "嵌段共聚物"是具有共同類型結(jié)構(gòu)單元的序列(結(jié)合于不同類型 結(jié)構(gòu)單元的序列)的線性聚合物。"支化聚合物"是其中另外的聚 合物鏈(分支)從聚合物的骨架分出的聚合物。人們通常將最長的線 性序列稱為"主《連"。其中支鏈的結(jié)構(gòu)單元的化學組成與主《連不同 的支化聚合物稱為"接枝共聚物"。"星形聚合物，，具有從共同結(jié)構(gòu)單元或核心發(fā)出的多個 線性聚合物鏈。"高支化聚合物"為其中骨架原子呈樹形狀排列的 多分支聚合物。這些聚合物涉及"樹形化合物"，其具有三個區(qū)別 性結(jié)構(gòu)特征起始核心、由徑向附著與起始核心的重復單元構(gòu)成的 內(nèi)層(世代)、以及附著于最外一代的末端官能度的外表面。"樹形 化合物"不同于高支化聚合物，不同之處在于它們非常對稱、高支 化、及最大化的(遠螯)末端官能度。"金屬標記的聚合物"(也為"聚合物金屬標簽載體"、 或"金屬-聚合物結(jié)合物"、或"螯合物衍生的聚合物")是各種元 素標簽，其由具有至少一個螯合側(cè)基(附著有金屬原子)的聚合物骨 架組成。這些金屬標記的聚合物可以為，但不限于，線性、星形、 支化、或高支化均聚物或共聚物，以及嵌段或接枝共聚物。"金屬結(jié)合側(cè)基"為能夠結(jié)合金屬或金屬的同位素的在 聚合物上的側(cè)基。它還可以一皮稱為配體。
"附著(連接)基團"或"連接物"為用于將兩個不同的 分子或聚合物、分子的兩個亞單位、或分子偶聯(lián)(共軛結(jié)合)到底物 (例如親和性試劑)的分子部分。通常4吏用的簡寫NAS為N-丙烯酰氧琥珀酰亞胺 (acryloxysuccinimide); NMAS為N-曱基丙火希酰氧琥珀酰亞胺；DMA 為N,N-二曱基丙烯酰胺；t-BDB為可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)鏈 轉(zhuǎn)移劑，叔丁基二硫代苯曱酸酯(鹽)；AMBN為2,2-偶氮二(2-甲 基丁腈)；DMSO為二曱亞石風；DOTA為1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷 -1，4，7，10-四乙酸；PMAA為聚(曱基丙烯酸)；DTPA為二亞乙基三 胺五乙酸(或二乙烯三胺五乙S臾)；PDMAEMA為聚(曱基丙烯酸二 曱氨基乙酯)；Fmoc為氨基甲酸9-芴基甲酯；DTT為二硫蘇糖醇； TMS為三曱代曱硅烷基，TCEP為三(2-羧乙基)膦。術(shù)語Mn、 Mw和PDI(多分散指凄丈)分別為Mw/Mn用 于分別表示數(shù)量和平均分子量，而多分散指數(shù)描述分子量分布。"螯合"為配體、螯合4務蔽劑、螯合劑或螯合用試劑結(jié) 合于金屬離子，形成金屬復合物、螯合物的方法。與簡單的單齒配 體如H20或NH3相反，多齒螯合劑與金屬離子形成多重鍵。"過渡元素，，是指具有以下原子序數(shù)21-30、 39-48、 57-80 和89-92之一的元素。過渡元素包括稀土金屬、鑭系元素和貴金屬。"鑭系元素"為具有57-71的原子序數(shù)的過渡金屬，包
括La、 Ce、 Pr、 Nd、 Pm、 Sm、 Eu、 Gd、 Tb、 Dy、 Ho、 Er、 Tm、 Yb、 Lu。"金屬，，是指具有以下原子序數(shù)之一的元素3、 4、 11-
13、 19-33、 37-52、 55-84、 87-102。
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發(fā)明內(nèi)容
優(yōu)化用于包括(但不限于)ICP-MS應用的元素分析的一 類標簽之前還沒有開發(fā)。必須利用目前用于完全不同目的的標簽進 行初步研究1;3;4;7。本發(fā)明的元素標簽不是先前技術(shù)中的那些，并特 別i殳計用于元素分析。為了實現(xiàn)最充分的元素標記，需要開發(fā)新類 別的標簽。感應耦合等離子體質(zhì)語分析(ICP-MS)具有大量獨特性 能，其可用來形成理想的元素標簽儀器組合。最重要的優(yōu)點是這個 事實大量重金屬和它們的同位素才是供了可以同時^皮4企測的特4i信 號。因此，可以開發(fā)許多例如大于50個的元素標簽；獲得的標簽 元素的強度用作樣品中分析物濃度的信號。其次，ICP-MS的豐度 靈敏度(相鄰同位素的信號重疊的量度)很大(例如對于四極分析儀 大于106)，這確保了檢測頻道在寬動態(tài)范圍上的獨立性。第三個關 鍵性質(zhì)是MS非常靈敏；在每個細胞的給定抗原的100個分子級別 上的檢測可以是可行的，很大程度上獨立于多重的級別，對目前的 焚光細胞計數(shù)儀的實質(zhì)改進。最后，ICP-MS作為檢測儀提供了很 大程度上獨立于分析物分子形式或樣品基質(zhì)的絕對定量。對于將元 素分析的這些關鍵性質(zhì)與生物分析方法整合存在明確的需求。這 里，我們提供了元素標簽的新型設計，其顯著地確保了較高的多重 能力和生物測定的靈敏度。聚合物基元素標簽的新類別適于利用常規(guī)ICP-MS儀器 在希望在樣品群上的平均測定(即全分析)的情況下的測定。例如， 當組織足夠均一時，或者it斷允許在活組織;險查上平均化時，^=羊品 可以用金屬標記的親和性試劑染色，并且在沖洗后，可以;波酸化以 裂解組織的細胞，并4是供可以才艮據(jù)長期存在的標準ICP-MS方案進
行分析的均一溶液。大量測定方案仍允許大量地多重分析，其中對 于每個標記物的檢測限與單個放射免疫測定相當。細胞生物學家可
以將這個視為蛋白質(zhì)印跡的定量高通量類似物。
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聚合物基元素標簽的新類別適于利用新型流式細胞4義 ICP-MS基儀器的測定，并提供高達50或更多個用于能夠同時測定 (大量地多重化的)許多生物標記物的免疫學分析的可區(qū)別才艮告標 簽，最終在粒子元素分析中提供患者樣品中的患病細胞(或感興趣的 其他細胞)的敏銳區(qū)別和鑒定。聚合物基元素標簽的新類別適于親和性試劑的雙標記-在相同親和性試劑上的熒光標記和元素標簽。先前，雙標記的抗 體用于定位組織切片中的特定細胞類型(熒光顯微鏡檢查)，然后利 用電子顯樣"彭險查鑒定細胞的特定結(jié)構(gòu)。因此，抗體用作為電子致 密物質(zhì)的熒光異石克氰酸酯(isothiocyonate) (FITC)和4夾蛋白加以標記 9。最近地，組合熒光標記和小金簇的免疫探針已經(jīng)通過與Fab'片段 共價結(jié)合進行制備。這些新的免疫結(jié)合物允許從單一標記的實驗1Q， 從熒光和電子顯微鏡，收集兩組互補數(shù)據(jù)。試劑如鋱-熒光素和鋱-綠色熒光蛋白熒光共振能量轉(zhuǎn)移對的另 一 進展被實現(xiàn)以利用時間 分多爭畫焚光共才展肯fe量專爭^多(Time Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer) (TR陽FRET)11研究激酶反應。申請人:的教導包括雙標記的親和性試劑以促進通過 ICP-MS流式細胞儀在混合樣品中稀有細胞的預分類以及隨后的元 素分析。細胞生物學要求細胞表面上或細胞內(nèi)的生物標記物的顯微 鏡定位。同時，標記物豐度的定量信息是必需的。通過將熒光標記 和元素標簽共價附著于相同的親和性試劑(例如抗體)并利用這個親 和性試劑，以首先經(jīng)由熒光顯微鏡將該信號定位到特定亞細胞結(jié)構(gòu) (膜、核、細胞質(zhì)、細胞骨架等)，其次，通過ICP-MS定量結(jié)合的 親和性試劑的數(shù)量，將顯著提高研究下的過程的生物學理解。本發(fā)明的 一個方面提供了 一種包括聚合物的元素標簽， 其中聚合物包括至少 一個結(jié)合金屬的側(cè)基，該側(cè)基包括至少 一個金 屬原子或能夠結(jié)合至少一個金屬原子。元素標簽可以進一步包括允
21許聚合物附著于連接物、間隔物、或生物分子之一的官能團。元素 標簽可以為水溶性的。它還可以帶負電荷的。能夠結(jié)合至少一個金
屬原子的結(jié)合金屬的側(cè)基的數(shù)量可以為約1到1000之間，最典型 地約10到250之間。至少一個金屬原子可以結(jié)合于結(jié)合金屬的側(cè) 基的至少一個。聚合物可以具有約1到1000之間的聚合度，最典 型地10到250之間的聚合度。聚合物可以選自由線性聚合物、共聚物、支化聚合物、 接枝共聚物、嵌段聚合物、星形聚合物、和高支化聚合物組成的組。 聚合物的骨架可以源自取代的聚丙烯酰按、聚甲基丙烯酸酯、或聚 曱基丙烯酰胺，并且可以為丙烯酰胺、曱基丙烯酰胺、丙烯酸酯、 曱基丙烯酸酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的均聚物或共聚物的取^書亍生 物。結(jié)合金屬的側(cè)基可以通過酯或通過酰胺附著于聚合物。 官能團可以為石克醇反應性基團。金屬原子可以為過渡元素或其同位 素，或者鑭系元素或鑭系元素的同位素。元素標簽可以進一步包括 附著于聚合物的官能團的連接物，其中連接物能夠共價附著于生物 分子。元素標簽可以進一步包^^附著于連4妄物的間隔物，其中間隔 物能夠附著于生物分子。間隔物可以為聚乙二醇(PEG)間隔物。間 隔物可以包括能夠經(jīng)由聚合物上的間隔物反應性官能團將間隔物 結(jié)合于聚合物的官能團。而且，間隔物可以包括能夠?qū)⑦B接物結(jié)合 于間隔物的官能團。上述元素標簽，可以共〗介附著于生物分子。生物分子可 以為親和性試劑，并且親和性試劑可以為抗體。本發(fā)明的另 一方面"l是供了 一種元素標記的親和性試劑， 其中親和性試劑用上述元素標簽標記，并且其中側(cè)基中的至少 一個 結(jié)合或能夠結(jié)合至少一個金屬原子。
本發(fā)明的另 一 方面提供了 一種制備上述元素標簽的方 法，包括(i)提供聚合物；以及(ii)將包括至少一個金屬原子或者能 夠結(jié)合至少 一個金屬原子的至少 一個結(jié)合金屬的側(cè)基共價附著于 該共聚物。提供聚合物的步驟可以包括聚合物的合成，其中合成選 自由可逆加成斷裂(鏈轉(zhuǎn)移)聚合(RAFT)、原子轉(zhuǎn)移自由基聚合 (ATRP)和陰離子聚合組成的組。提供聚合物的步驟可以包括從選自 由以下組成的組中的化合物合成聚合物N-烷基丙烯酰胺、N，N-二烷基丙烯酰胺、N-芳基丙烯酰胺、N-烷基曱基丙烯酰胺、N,N畫 二烷基曱基丙烯酰胺、N-芳基曱基丙烯酰胺、曱基丙烯酸酯、丙烯 酸酯及其其功能等價物。能夠結(jié)合至少一個金屬原子的結(jié)合金屬的 側(cè)基可以包括二亞乙基三胺五乙酸西旨(DTPA)酉己體或1,4,7， 10-四氮雜 環(huán)十二烷-1,4，7，10-四乙酸(DOTA)配體。所述方法可以進一步包括-官能化所述聚合物，其中的官能團能夠共價結(jié)合生物分子。所述方 法可以進一步包括將連接物附著于聚合物的官能團，其中連接物能 夠結(jié)合生物分子。所述方法可以進一步包括將生物分子共〗介結(jié)合于 連接物。最后，所述方法可以進一步包括將至少一個金屬原子結(jié)合 于至少一個結(jié)合金屬的側(cè)基。本發(fā)明的另 一方面提供了 一種制備上述元素標簽的方 法，包括(i)提供包括至少一個聚合物，其包括至少一個金屬原子 或能夠結(jié)合至少 一個金屬原子的結(jié)合金屬的側(cè)基，并包括允許該聚 合物共價結(jié)合連接物的官能團；(ii)將連接物附著于所述聚合物的官 能團，其中該連接物能夠結(jié)合生物分子；(iii)將生物分子共價結(jié)合 于所述連接物；以及(iv)將至少一個金屬原子結(jié)合于至少一個結(jié)合 金屬的側(cè)基。將至少一個金屬原子結(jié)合于至少一個結(jié)合金屬的側(cè)基 的步4t可以在步艱《(ii)之前進4于。將至少一個金屬原子結(jié)合于至少一 個結(jié)合金屬的側(cè)基的步驟可以在步驟(iii)之前進行。將至少一個金 屬原子結(jié)合于至少一個結(jié)合金屬的側(cè)基的步驟可以在步驟(iii)之后 進行。所述方法可以進一步包括將間隔物附著于連接物的步驟，其
23中所述間隔物位于所述連4妻物和生物分子之間，和/或?qū)㈤g隔物附著 于所述聚合物的步驟，其中所述間隔物位于所述聚合物和所述連才妄
物之間。所述間隔物可以在步驟(ii)前加入。所述間隔物可以為聚乙 二醇(PEG)間隔物。所述間隔物可以包4舌能夠經(jīng)由聚合物上的間隔 物反應性官能團將間隔物結(jié)合于聚合物的官能團。間隔物可以包括-能夠?qū)㈤g隔物結(jié)合于連接物的官能團。所迷方法可以包括使硫醇與 馬來酰亞胺附著基團反應的步驟。本發(fā)明的另 一 方面提供了 一種通過上述方法制備的元
素標簽。本發(fā)明的另一方面是一種用于分析物的分析的方法，包 4舌(i)將上述元素標記的親和性試劑與分片斤物反應(incubating ),其 中親和性試劑與分析物結(jié)合；(ii)分離未結(jié)合的標記親和性試劑與結(jié) 合的親和性試劑；以及(iii)通過元素分析來分析結(jié)合于附著于分析 物的親和性-汰劑的元素。本發(fā)明的另 一 方面l是供了一種用于兩個或多個分析物 的多重分析的方法，包4舌(i)將上述兩個或多個差別元素標記的親 和性試劑與兩個或多個分析物反應，其中所述親和性試劑與分析物 結(jié)合，產(chǎn)生兩個或多個差異標記的分析物；(ii)分離未結(jié)合的親和性 試劑與結(jié)合的親和性試劑；以及(iii)通過元素分析來分析結(jié)合于兩 個或多個分析物的差異標簽。本發(fā)明的另 一 方面4是供了 一種用于分析物的分析的方 法，包括(i)將上述元素標簽與分析物反應，以便所述元素標簽與 分析物結(jié)合；(ii)分離未結(jié)合的元素標簽與結(jié)合的元素標簽；以及(iii) 通過元素分析來分析結(jié)合的元素標簽。
上述方法4壬4可一種中的親和性試劑可以用突光標i己進 一步標i己。分一斤物可以^立于細月包內(nèi)或細月包(例如患病的細月包，以及 另外的白血病細胞)上。分析的步驟可以包括全分析，其中原子組 成在樣品的整個體積上進行平均，和/或單一粒子的分析。所述粒子 可以為細月包。上述方法可以通itf昔助ICP-MS的元素分坤斤或通過基于 流式細胞儀的質(zhì)i普儀進行。本發(fā)明的另 一方面4是供了 一種用于上述元素標簽的制 備的試劑盒，包括下述中的至少一個聚合物，包括至少一個結(jié)合 金屬的側(cè)基(其包括至少 一個金屬原子或能夠結(jié)合至少 一個金屬原 子)并進一步包括允許聚合物附著于連接物、間隔物、或生物分子 之一的官能團；金屬溶液；用于將連接物、間隔物或生物分子附著 于聚合物的試劑；用于將官能團附著于連接物或間隔物的試劑；用 于將金屬附著于聚合物的試劑；包括抗體的親和性試劑；緩沖劑； 用于制備元素標簽的說明書；用于將元素標簽附著于親和性試劑的 說明書；以及用于將金屬附著于元素標簽的說明書。本發(fā)明的另 一方面才是供了 一種用于才艮據(jù)上述方法的分 析物分析的試劑盒，包括下述中的至少一個聚合物，包括至少一 個結(jié)合金屬的側(cè)基(其包括至少一個金屬原子或能夠結(jié)合至少一個 金屬原子)并進一步包括允許聚合物附著于連接物、間隔物、或生 物分子之一的官能團；金屬溶液；用于將連接物、間隔物或生物分 子附著于聚合物的試劑；用于將官能團附著于連接物或間隔物的試 劑；用于將金屬附著于聚合物的試劑；包括抗體的親和性試劑；緩 沖劑；用于制備元素標簽的說明書；用于將元素標簽附著于親和性 試劑的i兌明書；用于將金屬附著于元素標簽的i兌明書；以及4吏用元 素標簽通過元素分析用于分析物的分析的說明書。
上述試劑盒的4壬4可一個中的聚合物可以選自由丙烯酰 胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酸、和曱基丙 烯酸的均聚物或共聚物《且成的組。所述試劑可以包4舌以下中的至少 一個TCEP(三(2-羧乙基)膦)、配體-聚合物-連接物-間隔物結(jié)合物、 磷酸鹽緩沖劑、TBS (tris (三羥曱基氨基甲烷)緩沖鹽水)、EDTA (乙二胺四乙酸)、乙酸銨緩沖劑、抗體、金屬鹽溶液、鑭系元素鹽 溶液、阻斷緩沖劑(或封端緩沖劑，blocker buffer )、沖洗緩沖劑、 FBS (月臺牛血清)、DMEM (達爾伯克改良4尹才各爾培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) )、 BSA(牛血清白蛋白)、二石克蘇沖唐醇、 雙馬來酰亞胺、以及DMF(二曱基曱酰胺)。所述聚合物可以附著于 連接物或者它可以;陂附著于連4妾物和間隔物。申請人:的教導的這些和其他特征在本文中陳述。


本發(fā)明在附圖中的圖示中舉例說明，這些附圖是示例性 的而非限制性的，并且其中相同的參考符號用于指代相同或相應的 部分(部4牛)。圖1:用于4全測生物分子的元素標簽的示意圖，其才艮據(jù) 本發(fā)明具有通用結(jié)構(gòu)I。提出的聚合物金屬螯合物11=有機基團， L-金屬配體。在結(jié)構(gòu)"a"中，聚合物的每個重復單元具有配位的 Ln3+,以(L)表示。在結(jié)構(gòu)"b"中，這些重復單元的部分具有才艮據(jù) 本發(fā)明的有機基團R。星號(*)代表聚合物的起始端。NAS為N-丙 烯酰氧基琥珀酰亞胺的示意圖。NMAS為N-曱基丙烯酰氧基琥珀 酰亞胺的示意圖。圖2:可以用于將元素/金屬"L"附著于聚合物的功能 性配體的合成的實例的示意圖。)附著于RAFT聚合物(圖解3)和 ATRP聚合物(圖解4)的示意圖。圖4:將配體(側(cè)基)附著于通過陰離子聚合(圖解5)和 PDMAEMA (圖解6)產(chǎn)生的聚合物的示意圖。圖5:將偶聯(lián)基團(連接物)附著于RAFT聚合物(圖解 7a)、 ATRP聚合物(圖解7b)、和通過陰離子聚合產(chǎn)生的聚合物(圖 解7c)的示意圖。圖6:根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)化學(反應)的可替換實例的 示意圖。在圖解8b中，術(shù)語"端基"用于指偶耳關基團。圖7:單體的結(jié)構(gòu)的示意圖。圖8:對于二噁烷中的DMA和NAS的無規(guī)共聚物在 80 QC的實驗條件和分子量lt據(jù)。圖9:配體-聚合物結(jié)合物的制備的示意圖。圖10: DOTA基配體-聚合物結(jié)合物的制備的示意圖。圖11:元素標簽的合成的示意圖。圖12:產(chǎn)生具有用于附著DTPA配體的氨基側(cè)基的聚 合物方法和采用基于胱胺的新型引發(fā)劑的方法的示意圖。圖13為實驗6的結(jié)果的條形圖。生長的K562細胞(非分 化的)用攜帶鑒別性鑭系元素的配體-聚合物結(jié)合物(如圖解11中所 描述的)標i己的初級抗體染色抗-CD38單克隆抗體用La標"i己；抗 -CD110用Eu標記；抗國CD61用Dy標記；抗畫CD45用Ho標i己； 抗-CD54用Nd標i己；CD49d用Pr標記。細月包與標i己的抗體，單獨
27地與每個抗體，或同時與全部抗體(全部；6-叢))反應。注意高表達的 普遍有核血細月包標i己物CD45 (Ho)平均為細月包粘附標i己物(CD54, Cd38, CD49d)的10 4咅，為巨核細月包(megakaryocyte)分4匕標i己物 CD61和CD110(細胞沒有被誘導沿著巨核細胞路徑分化)的100倍。圖14a為三維條形圖，示出了利用流式細胞儀從用 CD33-FITC或雙標記的CD33-FITC-Pr染色的細胞獲得的熒光的直 才姿比4交，b為三維條形圖，示出了利用ICP-MS從用CD33-Pr或雙 標記的CD33-FITC-Pr染色的細胞獲得的標準化應答的直接比較。圖15為RAFT聚合過程的流程圖I。圖16為聚合物-DTPA-連接物附著過程的流程圖II。
具體實施例方式對于元素標簽的總要求比對于熒光標簽12的嚴格性低，
標簽應當包括可再現(xiàn)的，并且優(yōu)選大量給定元素或同位素組合物的 原子。所述標簽可以包括一個元素或同位素，或由超過一個元素或 同位素的組合物組成。它還可以包括同位素的天然混合物。而且， 有可能該元素標簽可以包括一個包括某一金屬或同位素的側(cè)基以 及包括另 一金屬或同位素的第二側(cè)基。并入的相同金屬的數(shù)量的可 再現(xiàn)性是定量分析的基礎，那些原子的數(shù)量的增加線性提高了靈敏 度。另一關鍵特性是對濾去(leaching)的抗性，這將本發(fā)明與 DELFIA產(chǎn)物區(qū)別開。螯合金屬的移動性在DELFIA產(chǎn)物(DELFIA⑧ Assays and Reagents, PerkinElmer, USA)中是必需的。才示簽原子可以 為區(qū)別所述標簽與樣品中其他原子的元素或同位素的任何原子，包 括來自與區(qū)別元素標簽相關的其他標簽原子。典型地，標簽原子為 金屬，尤其是過渡金屬，最典型的為鑭系元素。
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用于才全測分析物的標簽具有圖1的通用結(jié)構(gòu)I。聚合物可以為本領域技術(shù)人員已知的任何聚合物。聚合 物的實例在圖1到4中示出。此外，聚合物骨架可以源自取代的聚 丙烯酰胺、聚曱基丙烯酸酯、或聚曱基丙烯酰胺。此外，聚合物的 骨架可以為取代的丙烯酰胺、曱基丙烯酰胺、丙烯酸酯、曱基丙晞 酸酯、丙烯酸或曱基丙烯酸的均聚物或共聚物的4汙生物。聚合物可 以通過本領域技術(shù)人員已知的許多方法合成。例如，合成可以借助 化合物如N-烷基丙烯酰胺、N，N-二烷基丙燁酰胺、N-芳基丙烯酰胺、 N-烷基曱基丙烯酰胺、N,N-二烷基甲基丙烯酰胺、N-芳基曱基丙烯 酰胺、曱基丙烯酸酯、丙烯酸酯及其功能等〗介物完成。所述配體或側(cè)基可以為本4頁i或:汰術(shù)人員已知的4壬4可配 體。配體的在圖2到4中示出。連接物可以為本領域技術(shù)人員已知的任何連接物。連接 物的實例在圖5和6中示出。連4妄物是可選的。間隔物是可選的。間隔物的實例包4舌PEG嵌^殳間隔物， 以及本領域4支術(shù)人員已知的其他間隔物。本發(fā)明主要但不是排他地涉及以下方面 (i)聚合物金屬標簽載體合成。功能上，金屬標記的聚合 物在通常分析條件下是穩(wěn)定的，其包括結(jié)合的金屬非常低的動力學 不穩(wěn)定性和聚合物之間的金屬交換率； (ii)與聚合物金屬標簽載體組合的附著(連接物)基團的 合成和表4i;
(iii)標記的親和性試劑的合成，其功能上包括與聚合物 金屬標簽載體結(jié)合的附著(連接物)基團。所述標記的親和性試劑可 以為標記的抗體或其4也標i己的親和性試劑；以及 (iv)采用親和性試劑作為多重性工具的方法。更一般地，本發(fā)明涉及用于標記生物有機分子(包括親 和性試劑如抗體)的含金屬標簽的合成和;f企測。特別i殳計用于元素分 析，這樣的標簽通常為(i)水溶性的；(ii)非毒性的；(iii)通過已 知的層析、離心、過濾、或透析法易于與標記的物質(zhì)分離；此外， 可以具有三或四個部分附著基團(連4妾物)、可能的間隔物(例如， PEG間隔物)、聚合物骨架(載體)、以及標簽原子(盡可能多的(相 同金屬或同位素的，或不同金屬和/或同位素的)標簽原子)。對于不 同的元素分析儀，元素標簽的特征可以可以是類似的。雖然本發(fā)明的實施方式例舉了利用抗體作為親和性試 劑，但是可以理解，可以使用其他親和性試劑，并落入本發(fā)明的范 圍。聚合物載體本發(fā)明的一個重要方面是聚合物的合成， 其可附著大量的標簽原子。通常標簽原子為金屬原子。聚合物可以 為水i^性的。該部分不受化學含量限制。然而，如果所述骨架具有 相對可再現(xiàn)的大小(例如，長度、標簽原子的數(shù)量、可再現(xiàn)的樹形化 合物性質(zhì)等)，則簡化了分析。還要考慮對于穩(wěn)定性、可溶性、非毒 性的要求。因此，通過合成策略(將許多官能團沿骨架i丈置)，加上 在可以用于經(jīng)由連4妻物將聚合物附著于生物分子(例如親和性試劑 的 一端的不同基團的功能性水溶性聚合物的制備和表征是本發(fā)明 的一部分。
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要用于才企測分析物的標簽具有圖1的通用結(jié)構(gòu)。要4企測 的信號為聚合物的信號，其包括作為其結(jié)構(gòu)的一部分的元素(例如， 鑭系元素(Ln)原子)的約1到1000個(或更多個)原子。在聚合物一端 的柔性連接物/間隔物可以包括硫醇反應性官能團如馬來酰亞胺，通 過該基團可以連接到用于特異性靶分析物的親和性試劑(例如抗 體)。變形方式包括附著于生物分子的伯胺或本領域技術(shù)人員已知的 其他附著方法。用于連接臂的官能團的選擇的實例可以從關于PEG 4匕4元體(PEGylated antibody )的文獻獲4f，最近由Chapman13綜述。 作為金屬原子標簽的載體的聚合物具有與PEG聚合物(其在不喪失 結(jié)合親和性的情況下附著于各種抗體)類似數(shù)量的骨架原子。例如， PEG2000 (2 KDa)具有7于應于140個骨架原子的45的平均聚合度， PEG5000具有340個骨架原子。為了將這些標簽正確放置，IgG抗 體從Fc端到Fab端的平均大小為約11 nm14。聚合物構(gòu)建體的回轉(zhuǎn) 半徑應當盡可能小，有些情況下在約2nM到llnM之間。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及包括作為側(cè)基的取代基 的Ln3+原子的聚合物以及它們的合成。在圖1的結(jié)構(gòu)"a"中，聚 合物的每個重復單元具有配^f立的Ln3+，用(L)指示。每個側(cè)基具有 (L)取代基既不可能也不必要。在圖1的結(jié)構(gòu)b中，重復單元的一部 分具有有機基團R。在這些結(jié)構(gòu)中，星號(*)代表聚合物的起始端。 考慮下面的因素l)聚合物可以為水溶性的。因為水解穩(wěn)定性，所 以可以使用N-烷基丙烯酰胺、N-烷基曱基丙烯酰胺、以及曱基丙烯 酸酯或功能等價物。2)包括約1到1000(1到2000骨架原子)的聚合 度(DP)涵蓋大多數(shù)感興趣的聚合物。具有相同功能性的較大的聚合 物在本發(fā)明的范圍內(nèi)并且本領域技術(shù)人員理解是可能的。通常聚合 程度在10到250之間。3)聚合物可以通過導致相對狹窄的多分散性 的途徑合成。聚合物可以通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)或可逆加 成-斷裂(RAFT)聚合來合成，其應當導致Mw/Mn的^f直在1.1到1.2 的范圍內(nèi)?？商鎿Q的策略涉及陰離子聚合，其中可獲得具有約1.02到1.05的Mw/Mn的聚合物。通過選才奪起始劑或終止劑，兩種方法 允許控制端基。這允許合成可以附著連4妻物的聚合物。4)可以采用 制備重復單元中包括功能性側(cè)基的聚合物的策略，其中配位的過渡 金屬單元(例如Ln單元)可以附著于所述重復單元。這個實施方式具 有多個優(yōu)點。它避免了可能源自進行包括配體的單體聚合的復雜 化。此外，該聚合物骨架已知是可以適于大多數(shù)(如果不是全部)的 含Ln聚合物的骨架。因此，所述聚合物可以具有共同的平均鏈長 和鏈長分布。5)類型"a"的靶聚合物可以為帶負電荷的聚合電解質(zhì) 或具有兩性離子側(cè)基。為了最小化側(cè)基之間的電荷排斥，對于(Ln3+) 的革巴配體應當在螯合物上提供為-1的凈電荷。對于類型"b"的聚 合物，R基大部分是不帶電的，雖然在一個實施例中，發(fā)明人教導 了其中R基的小部分x具有正電荷的聚合物。最后，能夠使具有硫 醇反應性基團的連接物基團附著于聚合物的各種化學是熟知的。大 量側(cè)基可以加入到聚合物。實踐上，所述數(shù)量可以為l到1000,更 典型地為10到250。結(jié)合金屬的側(cè)基可以通過本領域技術(shù)人員已知 的方法附著于聚合物，例如，所述側(cè)基可以通過酯或通過酰胺附著。用于將(L)附著于聚合物的功能性配體的合成實例在圖 2中示出(圖解1和2)。這些實例是示例性的而不用于限制本發(fā)明的范圍。螯合物(標簽原子)選才奪和合成鑭系元素的〗吏用在這里 可4亍地建立，然而，對于不同的元素可以實現(xiàn)類似的結(jié)果。系列鑭 系元素》見察到非常類似的配位化學。所有鑭系元素有利于+3氧化 態(tài)，并優(yōu)先與石更氧(hard oxygen)配體配位。鑭系元素沒有表現(xiàn)出限 定的配位幾何結(jié)構(gòu)并且在該系列上配位數(shù)在7到IO之間變化。因 此，相同螯合-衍生的聚合物可以用于所有的Ln金屬，這有利于在 多重試驗15中所用的包括不同鑭系元素的標簽生產(chǎn)。利用不同金屬 的不同實施方式可以利用與它們的化學性質(zhì)相關的類似考慮獲得。 已經(jīng)開發(fā)了用作放射性藥物和成像劑的大量Ln復合物16。但是本領域沒有披露附著于聚合物骨架的側(cè)基上的金屬原子。開發(fā)用于這
些應用的多齒螯合物形成熱力學穩(wěn)定的和動力學惰性的Ln復合物， 這對于最小化游離鑭系元素在體內(nèi)的毒性是重要的。并入這些最優(yōu) 化的鑭系元素螯合物，作為聚合結(jié)構(gòu)上的側(cè)基，似乎是首次在這里 進行描述。作為實例，描述了作為聚合骨架上共價鏈接的螯合物的 功能性實例的兩個配體框架。對于這個實施方式的選擇標準包括已 知的合成、七齒或八齒配位以促進針對金屬離子解離的動力學穩(wěn)定 性、用于將螯合物附著于聚合物的伯胺側(cè)官能團、用于配位的螯合 物的-1凈電荷。二亞乙基三胺五乙酸酯(DTPA)(無環(huán)螯合劑)可以 容易地衍生作為胺官能化配體(圖解1,圖2)。偶聯(lián)單保護的二胺與 商業(yè)上可獲得的DTPA酐，隨后脫保護，纟是供了待偶聯(lián)到聚合物活 性酯的^f夷選配體。所述4匕合物一旦復合到鑭系元素，其凈電4肓為-l。 這個螯合劑的容易合成使得它成為用于最優(yōu)化具有附著螯合劑的 聚合骨架的有吸引力的起始點。 DTPA配體比基于環(huán)蹄才匡架(cyclen framework )的大環(huán) 配體本身動力學更不穩(wěn)定。環(huán)烯基配體的大環(huán)性質(zhì)預先建立了金屬 結(jié)合位點，導致更大的熱力學和動力學穩(wěn)定性。已知這些螯合物在 體內(nèi)數(shù)天內(nèi)是穩(wěn)定的17。商業(yè)上可獲得的三詐又丁基曱基環(huán)烯(大環(huán)配 體(Macrocylics ))與容易獲得的高絲氨酸衍生物的反應提供了正交 保護的DOTA衍生物(圖解2,圖2)18。 Fmoc保護基可以被去除以 接近胺并使它可用于偶聯(lián)聚合物骨架。在一些情況下，在DOTA螯 合物和聚合物之間采用間隔物可能是必需的。各種選^^性地保護的 不同長度氨基酸在商業(yè)上可獲纟尋并可以容易；也偶聯(lián)和脫4呆護以形 成連接物。這種螯合物的鑭系元素復合物帶有-1的凈電荷?；诠?能性，這些具有反應性-NH2基團的Ln螯合物被稱為(L)-NH2。
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聚合物合成和螯合物附著下文中，將描述候選聚合物 的合成、功能性螯合物附著于聚合物骨架、以及包括金屬的聚合物 的表征。這些用于舉例，并不限制權(quán)利要求的范圍?？梢岳帽绢I i或4支術(shù)人員已^口的其^也實例。無規(guī)共聚物聚(DMA-共-NAS): —篇最近的報道19描述 了 N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺(NAS)與N，N-二甲基丙烯酰胺(DMA) 的75/25摩爾比無失見共聚物(3,圖3 )通過RAFT的合成，具有高 轉(zhuǎn)化率，在5000到130000范圍內(nèi)的優(yōu)異摩爾質(zhì)量控制，并且 Mw/Mn l.l。在這個實施方式(圖解3，圖3)中，圖3的圖解3的 活性NHS酯與具有反應性氨基的配位鑭系元素(L)反應，產(chǎn)生圖3 的共聚物4。圖15為示出了 RAFT聚合中涉及的步驟的流程圖。聚(NMAS):另一方法已經(jīng)由Ml)ller2G報道，用于將藥 物結(jié)合物附著于聚合物骨架。在這種方法中，MlMler通過ATRP聚 合NMAS(圖解4，圖3)，獲得的聚合物具有范圍在12到40Kda的 平均摩爾質(zhì)量，Mw/Mn為約1.1。在他們的實驗中，限制量的具有 間隔物和伯胺的各種藥物或藥物4莫擬物與圖3的圖解5的NHS酯 基反應，隨后殘余位點與過量Me2NH反應。它們的引發(fā)劑為溴代 異丁酸的羥乙基酯；因此，所有聚合物鏈均具有作為端基的伯醇。 這里，圖3的圖解5的樣品與過量(L)-NH2反應，最大化可以被附 著于聚合物的(L)基團的數(shù)量。聚(MAA):申請人的教導的另 一方面涉及具有非常狹窄 的摩爾質(zhì)量分布的聚合物標簽的特定功能性優(yōu)點。聚甲基丙烯酸 (PMAA)可以通過其叔丁基或三甲基甲硅烷基(TMS)酯的陰離子聚 合制備。如果該反應在酯水解前用環(huán)氧乙烷終止(圖4),那么聚合 物將具有-CH2CH2-OH作為功能性端基。將(L)附著于聚合物的一種 途徑涉及聚合物的四丁基銨羧酸鹽與(L)-NH2的溴代乙酰胺衍生物 的反應(圖解5,圖4)。
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聚(DMAEMA):最近，聚(甲基丙烯酸二甲氨基乙酉旨) (PDMAEMA)的樣品21通過ATRP制備。這是一種熟知的方便地制 備的聚合物，具有2到35Kda范圍的平均Mn值，Mw/Mn為約1.2。 這個聚合物也可以通過具有較窄大小分布的陰離子聚合合成22。這 個聚合物可以與(L)-NH2的溴代乙酰胺衍生物反應。這產(chǎn)生了兩性 離子聚合物8(圖解6，圖4)，其具有合適的水溶性。未反應二甲氨 基乙基基團在中性pH下被質(zhì)子化，并對聚合物貢獻小的正電荷。間隔物具有金屬的聚合物標簽和親和性試劑活性之 間的干擾的潛在來源是在附著于親和性試劑時大量聚合物的緊密 4妻近。間隔物，例如，PEG間隔物，可以位于連接物和聚合物之間 或聚合物和連接物之間。用于加入間隔物的方法是本領域技術(shù)人員 已知的。間隔物也可以為聚合物骨架的組成部分以幫助減輕這 個問題。在申請人的教導中，合成(例如參見圖解4-6，圖3和4)可以 被改良以形成PEG嵌段共聚物。該嵌段共聚物的PEG部分用作PEG 間隔物，并且該合成策略可以如在響應于表明具有結(jié)合歲丈率或靈每文 度問題的生物測定結(jié)構(gòu)中需要時而改變PEG間隔物長度，。間隔物 可以為本領域技術(shù)人員已知的任何間隔物。例如，它可以為圖解12 中示出的最小間隔物和化合物12。這個特定"i殳定似乎是新穎的，因 為我們沒有看到其在先申請。端基控制和偶聯(lián)化學根據(jù)Chapman對PEG化抗體 13的綜述，經(jīng)由與賴氨酸的自由氨基反應的PEG附著的方法是成功 的，但是獲得的PEG化抗體表現(xiàn)出降低的抗原結(jié)合效率。似乎與抗 體中各種賴氨酸基團化學反應的隨機性質(zhì)導致在干擾結(jié)合的位點 的PEG附著。對于其中PEG鏈特異性地附著于FC片羊殳(其通過位 點-特異性突變被引入抗體)中的單一半胱氨酸的情況，獲得更良性 的結(jié)果，這里描述了抗體的FC片段內(nèi)的二好u4定的還原，隨后聚合物共Y介附著于形成的-SH基團的一個或兩個。因此，可以在聚合物 的一個末端使用硫醇反應基。 RAFT聚合物RAFT聚合物的^fu代苯曱酸酯(鹽)端 基方便地轉(zhuǎn)變?yōu)槟┒?SH基團。這個化學反應在圖5的圖解7a中示 出，用于圖3的聚合物4。對于本領域技術(shù)人員，用于交聯(lián)硫醇是 多種方法是已知的，類似于對于-SH封端聚乙二醇(PEG-SH)"描述 的反應，并允i午聚合物經(jīng)由混合的二好"匕物附著于抗體或其4也親和 性試劑的自由-SH(表示為"蛋白-SH")。可替換地，雙馬來酰亞胺 衍生物是商業(yè)上可獲得的，并且聚合物用這些試劑的烷基化，隨后 通過GPC(凝月交f參透色i普，Gel Permeation Chromatography)纟屯4b和與 抗體或其他親和性試劑的自由硫醇反應，提供了希望的結(jié)合物24。 ATRP聚合物由M13ller團隊25報道的圖3中結(jié)構(gòu)5 的聚合物具有末端-CH2CH2-OH基團。在這里描述了用于聚合反應 的不同引發(fā)劑。2,6-亞萘基(napthalene)衍生物是容易獲得的，并 提供正交保護的胺。在脫保護后，胺與雙官能NHS-馬來酰亞胺(硫 醇-胺交聯(lián)劑)的反應，將提供用于抗體結(jié)合的聚合物標記試劑。這 種引發(fā)劑還提供了用于聚合物定量的方便生色團。這也在圖5的圖 解7b中示出。陰離子聚合(圖解5，圖4):陰離子聚合通?？梢酝ㄟ^ 與功能性親電試劑反應而終止，以對聚合物引入端基26。烯醇化物 有效地與烯丙基和苯曱基卣化物反應。利用表氯醇猝滅苯乙烯的聚 合已經(jīng)表明是有問題的28。用于猝滅活性聚(曱基丙烯酸叔丁酯)的 烯醇化物端以產(chǎn)生末端環(huán)氧化物的條件描述在這里。雖然曱基丙烯 酸縮水甘油酯可以在低溫下在LiCI存在下進行陰離子聚合，其使得 擴散陰離子親核性較低，但是預期曱基丙烯酸^又丁酯的烯醇化物應 當在較高溫度下使環(huán)氧基開環(huán)3G。環(huán)氧化物借助疊氮化物的打開提 供了在酯水解條件下穩(wěn)定的鄰位(或正交，orthogonal)官能團。在Cu(I)鹽存在下用炔處理疊氮化物高產(chǎn)率地產(chǎn)生三唑31。通過利用這
個偶聯(lián)反應，硫醇反應性馬來酰亞胺裝配到聚合物的末端。這也在
圖5的圖解7c中示出。附著(連接物)基團附著基團提供了生物有機(蛋白、 肽、寡核苷酸)分子如親和性試劑與元素標簽之間的共價4建。例如， 該鍵接可以利用馬來酰亞胺附著基團經(jīng)由碌u醇實現(xiàn)；；通過N-末端 或堿性側(cè)鏈(賴氨酸、精氨酸、組氨酸)(參見圖解8c，圖6),利用 p-(氯曱基)苯乙烯(參見圖解8c,圖6)通過C-末端或酸性側(cè)《連(天冬 氨酸、谷氨酸)，或經(jīng)由抗體或其他親和性試劑上的糖部分的氧化和 經(jīng)由肼基團的偶聯(lián)。人們可以利用通過抗體FC片,殳中的二碌J建的 還原所形成的硫醇基團。這個組合"生物有機分子-附著基團-元素 標簽，，纟皮認為在這里是首次描述。偶聯(lián)化學的功能性實例存在四個通常用于將聚合物 (如PEG)附著于蛋白的自由硫醇的主要偶聯(lián)化學。最近已經(jīng)綜述 了這些反應的優(yōu)點和缺點32。 一個方法涉及圖5的圖解7a中的二硫 化物交換。三個其他的常見反應涉及-SH加成到馬來酰亞胺或乙烯 基砜以及從碘乙酰胺置換碘化物(圖解8a-c,圖6)。為了避免在水中 的緩慢水解(其對于馬來酰亞胺和碟乙酰胺基團是典型的)，其中硫 醇反應試劑在標記親和性試劑前加入到具有(L)的聚合物的末端的 策略是可能的。這個策略利用最近由Sharpless33開發(fā)的"點擊(鏈 接，click)"化學(圖解8b，圖6),涉及疊氮化物1，3-二極加成到乙 炔，Sharpless已經(jīng)證實在溫和條件下具有定量產(chǎn)率的反應。為了在 具有末端-NH2基團的聚合物的末端引入乙炔單元，它們與4-戊炔酸 的活性酯衍生物反應。然后聚合物設置用于與X-R-N3形式的衍生 物的反應，其中R為間隔物，X代表石危醇反應基。聚合物偶聯(lián)到抗體或其他親和性試劑作為實例，抗 體或其他親和性試劑中的二碌u4建的還原可以利用共1"介連4妻到珠形
37瓊脂糖支持物(Pierce)的固定三烷基膦TCEP(三[2-羧乙基]膦鹽酸鹽) 進行。已知TCEP為寬pH范圍上烷基二硫化物的有效還原劑，并 且不干擾通常使用的巰基反應試劑如馬來酰亞胺交聯(lián)劑。使用珠粒 允許通過從還原性試劑的簡單離心以及隨后從J朱的分離而回收還 原的抗體或其〗也親和性試劑。聚合物修飾的抗體的純化由于IgG抗體的大尺寸(150 KDa), —種選擇是利用凝膠過濾色譜從抗體分離過量金屬化的標記 聚合物(20-40 KDa)。可替換地，蛋白A和蛋白G已經(jīng)用于純化抗體。如本領域技術(shù)人員已知的，元素或金屬原子可以在標 記的生物分子產(chǎn)生期間的不同步驟加入到聚合物。有利的是，在抗 體或其他親和性試劑與配體-聚合物結(jié)合后加入標簽的元素(金屬)。 這個策略具有多個優(yōu)點i)抗體-配體-聚合物結(jié)合物轉(zhuǎn)化為抗體-金 屬-聚合物結(jié)合物可以在生物測定前直接進行；ii)在相同的條件下， 大量親和性分子可以用相同的配體-聚合物結(jié)合物標記。使用的金屬 (或同位素)的選擇可以在多重試驗前由試劑使用者直接確定，顯 著提高實驗靈活性；iii)兩個標記階段的脫偶聯(lián)允許系列重要的獨立 控制實-驗，其中相同的抗體可以用不同的金屬標記；iv)內(nèi)標物的選 4奪不受阻礙，并且元素分析4義的相對靈壽文度可以有效地控制。可以采用許多形式的用于合成標記的生物分子的步驟 的順序。下面提供了三個實例，但是應當理解，其他的步驟順序也 是可以的
ABC
合成聚合物 合成聚合物 合成聚合物
金屬結(jié)合于聚合物 連接物結(jié)合于聚合物連接物結(jié)合于聚合物 連接物結(jié)合于聚合物金屬結(jié)合于聚合物 連接物結(jié)合于抗體
38連接物結(jié)合于抗體 連接物結(jié)合于抗體 金屬結(jié)合于聚合物此外，連4妄物可以在連4妾物附著于聚合物之前附著于 生物分子。最常見地，金屬在標記的親和性試劑結(jié)合于分析物前的 任何時間附著?？梢栽趯⒂H和性試劑附著于分析物后加入金屬，但 是背景預期是提高的，因為許多分析物，尤其是細胞，將非特異性 結(jié)合金屬。因此，較不可能在親和性試劑結(jié)合于分析物后成功地進 行。此外，聚合物元素標簽可以附著于不同于親和性試劑 的生物分子。例如，聚合物元素標簽可以直接附著于分析物，例如 但不限于生長因子、細胞因子或趨化因子，用于研究配體-受體相互 作用的動力學。特別地，具有聚合物元素標簽的EGF(表皮生長因 子)可以用作探針，以研究細胞表面上的EGFR(表皮生長因子受體) 的豐度、受體二聚化和內(nèi)在化。這個方面也在申請人教導的范圍內(nèi)。 兩個或多個分沖斤物也可以在多重反應中分沖斤。申請人:的教導的多個方面根據(jù)下面的實施例進一步理 解，其不應以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。
實施例
實施例1: N,N-二曱基丙烯酰胺和N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺的 共聚物通過RAFT聚合的合成。 N,N-二曱基丙蹄酰胺(DMA)和N-丙烯酰氧基琥珀酰 亞胺(NAS)通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)聚合纟支術(shù)進行共聚, 以獲得具有經(jīng)由反應性NAS單元統(tǒng)計地4妄枝的側(cè)基的無規(guī)共聚物 前體19。 DMA和NAS的無規(guī)共聚物、聚(DMA-共-NAS)利用二硫 代苯曱酸叔丁酯(t-BDB)作為鏈轉(zhuǎn)移劑(CTA)來進行制備(圖解9， 圖7)。
二硫代苯曱酸叔丁酯(t-BDB)的制備34。在裝備有磁攪 拌器的500 mL圓底燒瓶中，將150 mL的s-(硫代苯曱酰)巰基乙酸 (0.27 g, 2.4 mmol)的二乙醚溶液加入到100 mL的2-曱基-2畫丙基石克 醇鈉(0.510g, 2,9 mmol)的堿性水溶液(NaOH， 1 mol L")中。這個兩相 混合物在室溫下劇烈4覺拌5小時。隨后，去除紫色醚相，用500 ml 堿性水溶液(NaOH， 1 molL")沖洗兩次，用500 ml的10% NaCI水
溶液沖洗兩次，在無水辟u酸4美上干燥。通過石圭月交色語純化，
(Kiesegel-60),其中利用石油醚/乙酸乙酯(99/1 ， v/v)作為洗脫劑， 產(chǎn)生作為深紫色油的二硫代苯曱酸叔丁酯(t-BDB) (90%產(chǎn)率)。1 H NMR (CDCL3) d (ppm): 1.69 (S, 9H, 3 x CH3), 7.36 (m, 2H，間-ArH): 7.50(m, 1H,對-ArH)和7.88 (m, 2H,鄰畫ArH)。 N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺(NAS)的制備。"N-羥基琥珀 酰亞胺(IO g, 0.086 mol)和三乙胺(13.2 g, 0.129 mol)在(TC溶解在氯 仿(130 mL)中。在2小時期間內(nèi)將丙烯酰氯(8.6 g, 0.094 mol)逐滴加 入到攪拌的反應混合物。反應圖2的圖解1中描述。在0。C攪拌另 外的30分4中后，溶液用60 mL的々包和NaCI水〖容液沖洗兩次，在 MgS04上干義喿，過濾并濃縮以獲礙-30 mL的殘余體積。加入乙酸 乙西旨/戊烷混合物(14 ml, 1:3 v/v),并將溫度維持在0°C ，以誘導NAS 結(jié)晶過夜(70%產(chǎn)率)。1H NMR (CDC13) d (ppm): 2.95(S, 4H, CH2CH2)， 6.20 (m, 1 H， CH=CH2), 6.4 (m, 1H, CH《H2)和6.75 (m, 1H， CH=CH2)。 DMA和NAS的無規(guī)共聚物的制備。 一般實驗條件使 用前DMA在減壓下蒸餾。將單體(t-BDB)、引發(fā)劑2,2'-偶氮二(2-曱基丁腈)(AMBN)和溶劑二噁烷引入裝備有磁攪拌器的schlenk管 中。'混合物通過三個〉水凍-真空-解凍循環(huán)進4亍脫氣，隨后在氬下在 80 GC恒溫油浴中加熱。百分比產(chǎn)率重量分析地進行計算。
通過應用合適的色i普和光"i普方法確i人共聚物的結(jié)構(gòu)。 凝膠滲透色譜(GPC)用于確立共聚物的分子量和分子量分布。使用 裝備有Viscotek VE3210 UV/vis 4企測器和VE3580反射率4企測器以 及Viscotek GMHHR-M ViscogelTM GPC 一主的Viscotek 、液體色i普4義。 利用Viscotek VE1121 GPC泵將流量維持在0.5 mL/min。 l國甲基-2-吡咯烷酮用作洗脫劑。分子量作為聚苯乙烯當量提供。圖15為 RAFT聚合過考呈的流程圖。包括13 mol% NAS單元的共聚物的制備。將NAS (0.81 g, 4.82 mmol)、 DMA (3.2 ml, 31 mmol)、 AMBN (70 mg, 0.36 mmol) 和t-BDB (116 mg, 0.521 mmol)力口入33 ml的1，4-二噁烷中。Schlenk 管中的i^液脫氣并在80GC加熱18小時。隨后溶液冷卻并在300 mL 二乙醚中沉淀。收集的固體在〉容解在1，4-二噁》克中并沉淀在二乙醚 中。干燥后的聚合物的產(chǎn)率為75%。分子量和多分散性在圖8中示 出。包括47mol。/。NAS單元的共聚物的制備。將NAS (2.33 g， 13.9 mmol)、 DMA (N,N畫二甲基丙烯酰胺1.6 mL， 15.5 mmol)、 AMBN (70 mg， 0.36 mmol)和t-BDB (116 mg， 0.521 mmol)力卩入30 mL 1,4-二噁烷中。Schlenk管中的溶液脫氣并在80 GC加熱18小時。 在管中乂見察到 一些沉淀。隨后;容液#1冷卻并在300 mL 二乙醚中沉 淀。收集的固體再溶解在DMF中并沉淀在二乙醚中。干燥后的聚 合物的產(chǎn)率為80%。分子量和多分散性在圖8中示出。包括60mol。/。NAS單元的共聚物的制備。它通過與上 述(47 mol。/。的NAS單元)過程類似的過程制備。加入更多的NAS單 體，溶劑1，4-二噁烷用DMF取代。干燥后的聚合物的產(chǎn)率為80%。 分子量Mn和多分散性Mw/Mn在圖8中示出。
實施例2:配體-聚合物結(jié)合物的制備。
下面的聚合物配體結(jié)合物的制備可與#4居圖解10和 圖解11,圖9的胺官能化的配體使用。向(N，N-二甲基丙烯酰胺(DMA)和N-丙蹄酰琥珀酰亞 胺(NAS))共聚物(包括47 mol%的NAS單元(35 mg, 3.5461 mmol) 和在DMF/H20 (60:40, 1 mL)中的N，N-二異丙基乙胺(300pl))的攪 拌的溶液中加入在相同混合物中的胺側(cè)向配體9 (圖9 (78 mg))的 溶液(2ml)。反應混合物在氮氣下在室溫下4覺4半過夜。在真空下去 除溶劑，固體溶解在H20中。通過在Amicon離心過濾才幾(5K MW CO.)中用去離子水(5x4ml)重復沖洗而滲析溶液。留在過濾裝置中的 溶液濃縮而獲得淡黃色油。固體通過用二乙醚從曱醇沉淀而進一步 純化，獲得黃色粉末(48mg)。將配體-聚合物結(jié)合物(5.5 mg)溶解在1 ml的50 mM磷 酸鹽鄉(xiāng)爰沖劑中(pH 8.5. 2 ml， 20 mM DTT)，并將反應混合物在50 °C 攪拌1小時。反應后，用乙酸使混合物成為酸性(pH4)，在Amicon 離心過濾才幾(5K MW CO.)中用含水乙酸(5mM, 5x 4 ml)沖洗。留在過 濾裝置中的溶液隨后轉(zhuǎn)移到包括2 ml的100 mM磷酸鹽緩沖劑(pH 8.5)的小反應燒瓶中。將在DMF中的1，4-二(馬來酰亞胺)丁烷(50 當量；32 mg)加入所述燒瓶，反應混合物在50 。C攪拌過夜。蒸發(fā) 溶劑得到殘余物，將其溶解在1120中，利用Amicon離心過濾機(5K MWCO.)，利用去離子7K (5x5ml)再次沖洗清液。上清液凍干而獲 得最后的結(jié)合聚合物(4 mg)。
實施例3:配體-聚合物結(jié)合物的制備根據(jù)圖10的圖解12的 DOTA基結(jié)合物。向在DMF (3 ml)和三乙胺(l mL)中具有60 mol% NAS 單元(IOO mg)的DMA-NAS共聚物的攪拌溶液中加入在DMF (2 mL)中胺側(cè)配體10 (363mg， 0.590 mmol )的溶液。反應混合物在氮氣
42下在室溫"t覺拌過夜。在真空下去除;容劑，殘余物11 ;容解在純?nèi)?br> 乙酸(3 mL)中并在室溫下攪拌過夜。蒸發(fā)溶液，殘余物在水中收集， 并在Amicon離心過濾才幾(5K MW C. O.)中通過用去離子水(6x5 ml) 重復沖洗進行滲析。殘留物在過濾裝置中的溶液(大約0.8 mL)進行 濃縮而獲得黃色固體12 (179 mg)。聚合物-配體結(jié)合物12的全部樣品溶解在包括20 mM DL-二石克蘇糖醇的50 mM石粦酸鹽鄉(xiāng)爰沖劑(pH 8.5， 2 mL)中，反應混合 物在5(TC攪拌1小時。之后，用乙酸將混合物酸化到pH4，并用 含水乙酸(5 mM, 5x5 mL)在Amicon離心過濾才幾(5 KMW C. O.)中沖 洗。留在過濾裝置中的溶液(0.8 mL)隨后轉(zhuǎn)移到包括"疇酸鹽緩沖 劑(IOO mM, pH 8.5, 5 mL)的小反應燒瓶中。將在DMF ( 2 mL)中的 2,2'-(亞乙二氧基)二(乙基馬來酰亞胺)(191 mg, 0.619 mmol)的溶液 加入到所述燒并瓦中，反應混合物在室溫下攪拌1小時。水(3ml)力口 入所述燒瓶，固體通過過濾去除。利用Amicon離心過濾才幾(5KMW C. 0.)用去離子水(5X5 ml)再次沖洗所獲得的清液，上清液通過具有 HPLC系統(tǒng)的Sephadex G-50柱(利用水作為洗脫劑)純化。收集 餾分并凍干，而獲得最后的結(jié)合聚合物13 (165.0 mg)。
實施例4:配體-聚合物結(jié)合物的制備根據(jù)圖9、 11和圖16 的DTPA基結(jié)合物。向在DMF(30 ml)和三乙胺(4.3 ml)中的具有60 mol% NAS單元(2.0 g)的DMA-NAS共聚物的攪拌溶液中加入在DMF (10 ml)中的2-氨基乙氨基曱酸^又丁酯14 (2.5 g, 15.6 mmol )的;容液。在 氮氣下在室溫4覺4半反應混合物。隨后;昆合物在500 ml 二乙醚中沉^ 淀。收集的固體15(400mg)溶解在純?nèi)宜?3mL)中并在室溫 下攪拌過夜。在真空下去除溶劑，殘余物11溶解在純?nèi)宜?3 mL)中并在室溫下攪拌過j復。蒸發(fā)溶液，在水中收集殘余物，在 Amicon離心過濾才幾(5KMW C.O.)中通過用去離子水(6x5 ml)重復
43沖洗而、滲析。濃縮殘留在過濾裝置中的溶液(大約0.8 mL)而獲得黃 色固體16 (210 mg)。根據(jù)公開的過程制備DTPA琥珀酰亞胺酯36。將16 g DTPA (40.64 mmol)溶解在320 ml乙腈(力口入23 g, 230 mmol三乙胺) 中。在50 。C攪拌溶液以溶解DTPA。在室溫下同時加入3.36 g二 環(huán)己基碳二亞胺(DCC， 16.3 mmol)和1.9 g的N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS， 16.3 mmol)。反應進4亍過4支。7見察到白色沉淀并通過濾紙濾 出，產(chǎn)生溶液(A)。將210 mg固體16 (大約0.8 mmol氨基基團)溶解在80 mL蒸餾水中并在室溫下加入溶液(A)中。加入5 mL三乙胺，在室 溫下-容液4覺4半過J支。隨后蒸發(fā)溶劑(三乙胺，乙腈)，加入100 mL水。 溶液被滲析兩天(l K分離點膜)。隨后濃縮水溶液，力口入乙酸。用相 同的膜再次滲析另外三天。濃縮溶液而獲得固體17(190mg)。將固體17 (110 mg)溶解在2.3 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7.2) 中。隨后在室溫下將三(2-羧乙基)膦(TCEP, 0.18ml0.5M溶液)加入 到緩沖溶液中。在溶液攪拌2小時后，將其在室溫下加入到在2.3 ml DMF中的2，2'-(亞乙二氧基)-二(乙基馬來酰亞胺)(0.36 mmol, 106 mg)中。2小時后力。入100 ml蒸4留水，〉容液通過5k截止(cut-off)月莫 利用5% DMSO/水(2次)過濾，隨后用蒸餾水過濾(3次)。收集餾分 并凍干，獲得最后的結(jié)合聚合物18(90 mg)。
實施例5:配體-聚合物結(jié)合物的制備聚(MAA)或聚(AA)。本發(fā)明的一個方面涉及具有非常狹窄的摩爾質(zhì)量分布 的聚合物標簽的特定功能性優(yōu)點。聚曱基丙烯酸[聚(MAA)]或聚丙 烯酸[聚(AA)]可以通過其叔丁基或三甲硅烷基(TMS)酯的陰離子聚 合制備37。如果在酯水解之前(參見下文)，反應用叔丁基二曱硅烷基3-氯丙基硫化物終止38,則聚合物將具有被保護的-SH末端官能 團。它們與2-氨乙基氨基甲酸叔丁酯反應而形成具有被保護的氨基 基團的聚合物，其隨后水解為聚合物19(圖12,圖解13)。在聚合物 19的主鏈上的自由氨基基團提供了用于螯合物附著的位點。用于附 著螯合物的途徑涉及利用DTPA琥珀酰亞胺酯的之前過程(圖11 )。聚(NMAS)。另一方法已經(jīng)由M13ller39凈艮道并用于將藥 物結(jié)合物附著于聚合物骨架。在這個方法中，NMAS通過ATRP聚 合，獲得具有從12到40Kda的平均摩爾質(zhì)量，Mw/Mn為約l丄 使用的引發(fā)劑為溴代異丁酸的羥乙基酯；因此，所有聚合物鏈均具 有作為端基的伯醇。這里，基于胱胺20的新引發(fā)劑可以被制備(圖 12,圖解14)。隨后在NMAS的ATRP中使用它來形成具有二石克基 的聚合物21(圖12，圖解14)。聚合物21可以與圖12的圖解13中 所示的2-氨乙基氨基曱酸叔丁酯反應而產(chǎn)生具有用于DTPA配體附 著的側(cè)氨基的聚合物。通過利用三(2-羧乙基)膦(TCEP), 二硫鍵被 還原，并產(chǎn)生硫醇端基用于將連接物附著于抗體(圖12,圖解15)。
實施例6:白血病細月包的多重標i己。 K562細胞( 一種人類慢性骨髓白血病的才莫型細胞系) 在補充有10% FBS (月臺牛血清)、2mM L-谷氨酰胺和抗生素的 DMEM (達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基)中在標準組織培養(yǎng)條件下進 行培養(yǎng)。通過低速離心(500 x g)收集生長細胞，用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)沖洗一次，用附著于金屬-聚合物結(jié)合物的初級抗體(對于每個 抗體分別為Ho、 Dy、 Nd、 Eu、 Pr、或La)免疫標記，如圖解10 和圖解11 (圖9)中所描述的。從試驗選擇六個細胞表面特異的受 體CD38、 CDllO、 CD61、 CD45、 CD54、 CD49d。細i包在三個管 中的等分試樣(0.3xl06)分別用每個抗體或用在一個反應混合物(全 部才羊品)中組合的所有4元體進4亍標i己。作為陰性對照，爿尋小鼠IgGI 同種型免疫j求蛋白附著于攜帶與初級抗體相同的元素-Ho、 Dy 、 Nd、
45Eu、 Pr、或La的金屬-聚合物結(jié)合物。在冰上反應30分鐘后，用 PBS通過離心沖洗細胞3次。最后的細^^沉淀溶解在濃縮的 HCl(35。/o)中，與作為內(nèi)標物等量的1 ppb Ir/HCI溶液混合，并進行 體積分析ICP-MS。結(jié)果在圖13中示出。根據(jù)下面的方案和試劑，將抗體附著于金屬-聚合物結(jié) 合物(才艮據(jù)圖9的圖解IO和圖解11合成)試劑在100 jal PBS/EDTA ( 1 mg/ml)中的至少100-150 嗎(-1 nmol)抗體?？贵w從BD Biosciences, San Jose, CA)購得。來自Pierce #77712的TCEP 二石克化物還原凝月交(4%交 聯(lián)的瓊脂珠)；作為50%糊劑(slurry)供應。以1:1 50%糊劑抗體v/v 使用。配體-聚合物結(jié)合物溶解在雙蒸水(ddH20)中(參見圖解 11，圖9)。予員期MW ll，OOO。 R-緩沖劑為0.1 M磷酸鈉pH 7.2, 2.5mM EDTA C-纟爰沖劑為TBS ， 1 mM EDTA L-緩沖劑為20mM乙酸胺pH 6.0 IgG二碌"定的還原將200^1 R^爰沖劑和50pg抗體'溶液 加入到滲濾膜。 10,000 g離心10分鐘。丟棄流出物(flow-through )。
重復一次。將lOOpL R-纟爰沖劑和0.8(^L 0.5M TCEP ;容液加入到、滲 濾月莫并溫和混合(4mM TCEP)。不形成渦流(vortex)。
46
在37QC反應30分鐘力口入200pl C-纟爰沖劑。10,000 g離心10分4中。丟棄;危 出物。還原的IgG的標記將200(aLC-緩沖劑加入到膜。在C-緩沖劑中制備濃度為1 mM的元素標簽(在50pl C-纟爰沖劑中的1.1 mg元素標簽).將10Ml制備的元素標簽加入到包括200jul還原IgG溶液 的管中并充分混合。不形成渦流。允許反應在37°C進4亍至少1小時。 ^!夸200fi1 L畫纟爰沖劑力口入到膜。10,000 g離心10分4中。 丟棄流出物。重復兩次。將100(alL-緩沖劑加入到膜以再懸浮標記的抗體。將5jal0.1M鑭系元素溶液(在超純水中制備，其是本領 域^支術(shù)人員已知的)加入到與聚合物標簽結(jié)合的抗體。充分混合。 不形成渦5危。在370C反應30-60分鐘。力口入300fiLTBS。 10,000g離心10分4中。丟棄;危出4勿。 重復三次。力口入50jilTBS。溫和地吸液幾次以回收結(jié)合物并轉(zhuǎn)移 到eppendorf (德國艾本德股份公司)管。
雖然在這個分析中使用ICP-MS, ^f旦是可以理解，其他 形式的元素分析也可以使用并包括在申請人教導的范圍內(nèi)。此夕卜，雖然白血病細月包作為分析物輩巴向，^f旦是可以理 解，任何細胞或粒子可以以類似的方式被分析。
實施例7: 7又標i己的抗體的分對斤-萸光標i己和元素標簽。在這個實施例中，雙標記的抗體有利于通過ICP-MS 流式細胞儀在混合樣品中的稀有細胞的預分類和隨后的元素分析。在一種情況下，進4亍通過流式細月包4義(FACS)和用雙標 記抗體(CD33-FITC-Pr)染色的細胞的ICP-MS收集的lt據(jù)一致性的 論證。針對結(jié)合于異硫氰酸熒光素(FITC)的細胞表面抗原 CD33(CD33-FITC; GenTex Inc.)的單克隆抗體用聚合物-DOTA-Pr構(gòu) 建體標記。這個雙標記抗體將進一步稱為CD33-FITC-Pr。多個充分 表;f正的人類白血病細月包系(KGla, THP-l, Kasumi-3; ATCC Inc)在細 胞染色研究中使用。在FACScaliburTM流式細胞儀儀器(BD Biosciences Inc.)上進4亍FACS分沖斤，并利用ELAN DRCPIus (Perkin Elmer SCIEX)獲得ICP-MS凄t據(jù)。通過低速離心沖洗活細胞并與用 于抗原表達對照的CD33-FITC-Pr或CD33-FITC或CD33-Pr進4亍反 應。用小鼠IgG-FITC、 IgG-Pr或雙標記的IgG-FITC-Pr監(jiān)測非特異 性免疫^求蛋白結(jié)合。在圖14a中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明，乂人用雙標記 CD33-FITC-Pr染色的細胞獲得的焚光類似于在測試的所有細胞系 上的CD33-FITC。注意到KGla細月包系不表達CD33。同才羊，當利用元素標i己抗體CD33-Pr和雙標記 CD33-FITC-Pr (圖14b)沖企測CD33表達時，標準化應答類似。實施例8:利用質(zhì)譜流式細胞4義的粒子元素分析。金屬-聚合物結(jié)合物標簽使得能夠進行單 一 細胞形式 中的多重分析來區(qū)別復雜樣品(如血液)中的稀有(例如患病)細胞。通 過采用結(jié)合于特異性抗體(識別存在于白血病細胞上的細胞表面抗 原)的金屬-聚合物標簽，所述方法可以用于鑒定患者血液樣品中的 白血病纟田月包。侈寸^口，禾'J用4十乂于CD33、 CD34、 CD38、 CD13、 CD15、 CD36 (圖14b)的抗體(用不同金屬標記)，對外周血單核樣品中的一 些細胞進行陽性多重染色，并在質(zhì)語流式細胞儀中進行分析，將表 明患者正在形成急性單核細力包白血病(AML-M5)。以類似的方式， 這個方法可以用于鑒定和定量其他細月包或粒子。
實施例9:試劑盒本發(fā)明涵蓋用于制備元素標簽和用于實施本發(fā)明的方 法的試劑盒。所述試劑盒可以包括以下項目中的至少一個
聚合物，其包括至少一個結(jié)合金屬的側(cè)基(包括至少一個金屬 原子或能夠結(jié)合至少一個金屬原子)并進一步包括允許聚合物附著 于連4妄物、間隔物、或生物分子之一的官能團；金屬溶液；用于連 接物、間隔物或生物分子附著于聚合物的試劑；用于官能團附著于 連接物或間隔物的試劑；用于金屬附著于聚合物的試劑；包括抗體 的親和性試劑；緩沖劑；用于制備元素標簽的說明書；用于元素標 簽附著于親和性試劑的說明書；用于金屬附著于元素標簽的說明
書。例如，聚合物可以為丙烯酰胺、曱基丙烯酰胺、丙烯酸酯、曱 基丙烯酸酯、丙烯酸、和曱基丙烯酸的均聚物或共聚物。所述試劑 可以選自下面中的至少一種TCEP(三(2-羧乙基)膦)、配體-聚合物 -連接物-間隔物結(jié)合物、磷酸鹽緩沖劑、TBS (tris-緩沖鹽水)、EDTA (乙二胺四乙酸)、乙酸銨緩沖劑、抗體、金屬鹽溶液、鑭系元素鹽溶液、封閉劑緩沖劑、沖洗緩沖劑、FBS(胎牛血清)、DMEM(達爾 伯克改良伊格爾培養(yǎng)基)、BSA(牛血清白蛋白)、二硫蘇糖醇、雙馬 來酰亞胺、以及DMF(二曱基曱酰胺)。聚合物可以附著于連接物或 者附著于連4妄物和間隔物加以4是供。所有列出的參考文獻以引用方式并入。雖然結(jié)合多種實施方式描述了申請人的教導，但是不
意味著申請人的教導限于這樣的實施方式。相反，申請人的教導涵 蓋如本領域才支術(shù)人員理解的多種^^換方式、改變、和等同方式。參考文獻列表
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5權(quán)利要求
1.一種包括聚合物的元素標簽，其中，所述聚合物包括至少一個結(jié)合金屬的側(cè)基，所述結(jié)合金屬的側(cè)基包括至少一個金屬原子或能夠結(jié)合至少一個金屬原子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的元素標簽，進一步包括一官能團，所述 官能團允許所述聚合物附著于連接物、間隔物、或生物分子中 的一個。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的元素標簽，其中，所述聚合物為水溶性 的。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的元素標簽，其中，所述聚合 物帶負電荷。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的元素標簽，其中，能夠結(jié)合 至少一個金屬原子的所述結(jié)合金屬的側(cè)基的數(shù)量在約1到 1000之間。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的元素標簽，其中，能夠結(jié)合 至少一個金屬原子的所述結(jié)合金屬的側(cè)基的^t量在約10到 250之間。
7. 才艮據(jù)前述4又利要求中任一項所述的元素標簽，其中，至少一個 金屬原子結(jié)合于所述結(jié)合金屬的側(cè)基中的至少 一個。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的元素標簽，其中，所述聚合 物選自由線性聚合物、共聚物、支化聚合物、接枝共聚物、嵌 段聚合物、星形聚合物、和高支化聚合物組成的組。
9. 根據(jù)前述片又利要求中任一項所述的元素標簽，其中，所述聚合物的骨架來源于取代的聚丙烯酰胺、聚曱基丙烯酸酯、或聚甲 基丙烯酰胺。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的元素標簽，其中，所述聚合 物的骨架為丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸 酉旨、丙烯酸或甲基丙烯酸的均聚物或共聚物的取^^亍生物。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的元素標簽，其中，所述結(jié)合 金屬的側(cè)基通過酯附著于所述聚合物。
12. 4艮據(jù)前述片又利要求中任一項所述的元素標簽，其中，所述結(jié)合 金屬的側(cè)基通過酰胺附著于所述聚合物。
13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的元素標簽，其中，所述聚合 物具有在約1到IOOO之間的聚合度。
14. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的元素標簽，其中，所述聚合 物具有在約10到250之間的聚合度。
15. 根據(jù)權(quán)利要求2至14中任一項所述的元素標簽，其中，所述官能團為好u醇反應基。
16. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的元素標簽，其中，所述金屬 原子為過渡元素或該過渡元素的同位素。
17. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的元素標簽，其中，所述金屬 原子為鑭系元素或鑭系元素的同4立素。
18. 根據(jù)權(quán)利要求2至17中任一項所述的元素標簽，進一步包括 附著于所述聚合物的官能團的連接物，其中所述連接物能夠共 價附著于生物分子。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的元素標簽，進一步包括附著于所述連 接物的間隔物，其中所述間隔物能夠附著于生物分子。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的元素標簽，其中，所述間隔物為聚乙 二醇(PEG)間隔物。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1至17所述的元素標簽，進一步包括間隔物， 其中所述間隔物包括官能團，所述官能團能夠經(jīng)由所述聚合物 上的間隔物反應性官能團將所述間隔物結(jié)合于所述聚合物。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的元素標簽，其中，所述間隔物包括能 夠?qū)⑦B接物結(jié)合于所述間隔物的官能團。
23. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的元素標簽，共價附著于生物 分子。
24. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的元素標簽，其中，所述標簽 為水溶性的。
25. 才艮據(jù)^又利要求23或24任一項所述的元素標簽，其中，所述生 物分子為親和性試劑。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的元素標簽，其中，所述親和性試劑為 抗體。
27. —種元素標記的親和性試劑，其中，所述親和性試劑利用4又利 要求1至22中4壬一項所述的元素標簽標記，并且其中所述側(cè) 基中的至少之一結(jié)合或能夠結(jié)合至少一個金屬原子。
28. —種制備權(quán)利要求1所述的元素標簽的方法，包括(i) 提供聚合物；以及(ii) 將包含至少一個金屬原子或者能夠結(jié)合至少一個金 屬原子的至少 一個結(jié)合金屬的側(cè)基共價附著于所述聚合物。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，提供所述聚合物的步驟 包括合成所述聚合物，其中所述合成選自由可逆加成斷裂聚合 (RAFT)、原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)和陰離子聚合組成的組。
30. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，提供所述聚合物的步驟 包括用選自以下組成的組中的化合物合成所述聚合物N-烷 基丙烯酰胺、N,N-二烷基丙烯酰胺、N-芳基丙烯酰胺、N-烷 基曱基丙烯酰胺、N，N-二烷基甲基丙烯酰胺、N-芳基甲基丙 烯酰胺、曱基丙烯酸酯、丙烯酸酯以及它們的功能性等價物。
31. 才艮據(jù)片又利要求28至30中任一項所述的方法，其中，能夠結(jié)合 至少一個金屬原子的所述結(jié)合金屬的側(cè)基包括二亞乙基三胺 五乙酸(DTPA)配體或1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7，10-四乙 酸(DOTA)酉己體。
32. 才艮據(jù)權(quán)利要求28至31中任一項所述的方法，進一步包括官能 化所述聚合物，其中所述官能團能夠共價結(jié)合生物分子。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，進一步包括將連接物附著于所 述聚合物的所述官能團，其中所述連接物能夠結(jié)合生物分子。
34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，進一步包括將生物分子共價結(jié) 合于所述連接物。
35. 4艮據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，進一步包括將至少一個金屬原 子結(jié)合于至少 一個結(jié)合金屬的側(cè)基。
36. —種制備權(quán)利要求23所述的元素標簽的方法，包括(i) 提供聚合物，所述聚合物包括至少一個結(jié)合金屬的側(cè) 基、并包括允許所述聚合物共價結(jié)合連接物的官能團，其中所 述結(jié)合金屬的側(cè)基包含至少一個金屬原子或能夠結(jié)合至少一 個金屬原子；(ii) 將連接物附著于所述聚合物的所述官能團，其中所述 連接物能夠結(jié)合生物分子；(iii) 將生物分子共價結(jié)合于所述連接物；以及(i v) 將至少 一 個金屬原子結(jié)合于至少 一 個結(jié)合金屬的側(cè)基。
37. 才艮據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述將至少一個金屬原 子結(jié)合于至少一個結(jié)合金屬的側(cè)基的步驟在步驟(ii)之前進行。
38. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述將至少一個金屬原 子結(jié)合于至少一個結(jié)合金屬的側(cè)基的步驟在步驟(iii)之前進行。
39. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述將至少一個金屬原 子結(jié)合于至少 一個結(jié)合金屬的側(cè)基的步驟在步驟(iii)之后進行。
40. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，進一步包括將間隔物結(jié)合于所 述連4妄物的步驟，其中所述間隔物位于所述連4妻物和所述生物 分子之間。
41. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，進一步包括將間隔物結(jié)合于所 述聚合物的步驟，其中所述間隔物位于所述聚合物和所述連接 物之間。
42. 根據(jù)權(quán)利要求40或41的任一項所述的方法，其中，所述間隔 物在步-驟(ii)之前力口入。
43. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述間隔物為聚乙二醇 (PEG)間隔物。
44. 才艮l居4又利要求41至43所述的方法，其中，所述間隔物包4舌官 能團，所述官能團能夠經(jīng)由所述聚合物上的間隔物反應性官能 團將所述間隔物結(jié)合于所述聚合物。
45. 根據(jù)權(quán)利要求40至43所述的方法，其中，所述間隔物包括能 夠?qū)⑺鲩g隔物結(jié)合于所述連4妄物的官能團。
46. 才艮據(jù)權(quán)利要求28至45中任一項所述的方法，其中，至少一個 金屬原子結(jié)合于至少一個所述結(jié)合金屬的側(cè)基。
47. 根據(jù)權(quán)利要求28至45中任一項所述的方法，其中，所述金屬 原子為過渡元素或過渡元素的同位素。
48. 根據(jù)權(quán)利要求28至45中任一項所述的方法，其中，所述金屬 原子為4闌系元素或4闌系元素的同4立素。
49. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，將所述連接物附著于所 述聚合物的步驟涉及硫醇反應基。
50. 根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中，所述硫醇與馬來酰亞胺 基附著基團反應。
51. —種通過權(quán)利要求28至50中任一項所述的方法制備的元素標簽。
52. —種用于分4斤物分析的方法，包括(i) 將權(quán)利要求27所述的元素標記的親和性試劑與分析 物溫育，其中所述親和性試劑與所述分析物結(jié)合；(ii) 將未結(jié)合的標記的親和性試劑與結(jié)合的親和性試劑 分離；以及(iii) 通過元素分析來分析結(jié)合于所述親和性試劑的元 素，所述親和性試劑附著于所述分析物。
53. —種用于兩個或多個分析物的多重分析的方法，包括(i) 將權(quán)利要求27所述的兩個或多個差異元素標記的親 和性試劑與兩個或多個分析物反應以產(chǎn)生兩個或多個差異標 記的分析物，其中所述親和性試劑與所述分析物結(jié)合；(ii) 將未結(jié)合的親和性試劑與結(jié)合的親和性試劑分離；以及(iii) 通過元素分析來分析結(jié)合于所述兩個或多個分析物 的所述差異標簽。
54. —種用于分析物的分析的方法，包括(i)將權(quán)利要求1至24中任一項所述的元素標簽與分析物 反應，以-使所述元素標簽結(jié)合所述分析物；(ii) 將未結(jié)合的標簽元素與結(jié)合的標簽元素分離；以及(iii) 通過元素分析來分析所述結(jié)合的標簽元素。
55. 根據(jù)權(quán)利要求52至54中任一項所述的方法，其中，所述親和 性試劑利用熒光標記物進一步標記。
56. 4艮據(jù)權(quán)利要求52至54中任一項所述的方法，其中，所述分析 物^立于細月包內(nèi)或細月包上。
57. ^f艮據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中，所述細胞為患病細胞。
58. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中，所述患病細胞為白血病 細月包或白血病細l包的^且細月包。
59. 根據(jù)權(quán)利要求52至58中任一項所述的方法，其中，所述分析 步驟包括全分析，其中所述原子組成在樣品的整個體積上是平 均的。
60. 根據(jù)權(quán)利要求52至58中任一項所述的方法，其中，所述分析 步驟包括單個粒子的分析。
61. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中，所述粒子為細胞。
62. 才艮才居片又利要求52至61中4壬一項所述的方法，其中，所述元素 分析為ICP-MS。
63. 才艮才居沖又利要求52至62中4壬一項所述的方法，其中，所述元素 分析通過基于流式細胞4義的質(zhì)譜儀進4亍。
64. —種用于制備權(quán)利要求1至26中任一項所述的元素標簽的試 劑盒，包4舌以下中的至少之一聚合物，所述聚合物包括至少一個結(jié)合金屬的側(cè)基，所 述結(jié)合金屬的側(cè)基包括至少 一個金屬原子或能夠結(jié)合至少一 個金屬原子，并進一步包括允許所述聚合物與連4妄物、間隔物、或生物分子中之一結(jié)合的官能團；金屬溶液；用于將所述連接 物、間隔物或生物分子附著于所述聚合物的試劑；用于將官能 團附著于所述連4妾物或所述間隔物的試劑；用于將金屬附著于 所述聚合物的試劑；包括抗體的親和性試劑；緩沖劑；用于制 備所述元素標簽的說明書；用于將所述元素標簽附著于親和性 試劑的說明書；以及用于將金屬附著于所述元素標簽的說明 書。
65.—種用于根據(jù)權(quán)利要求52到63中的任何一項所述的方法分析 分析物的試劑盒，包括下列中的至少之一聚合物，所述聚合物包括至少一個結(jié)合金屬的側(cè)基，所 述結(jié)合金屬的側(cè)基包括至少一個金屬原子或能夠結(jié)合至少一 個金屬原子，并進一步包括允許所述聚合物與連〗妻物、間隔物、 或生物分子中之一結(jié)合的官能團；金屬溶液；用于將所述連接 物、間隔物或生物分子附著于所述聚合物的試劑；用于將官能 團附著于所述連接物或所述間隔物的試劑；用于將金屬附著于 所述聚合物的試劑；包括抗體的親和性試劑；緩沖劑；用于制 備所述元素標簽的說明書；用于將所述元素標簽附著于親和性 試劑的說明書；以及用于將金屬附著于所述元素標簽的說明 書。
66.才艮據(jù)權(quán)利要求64至65的任一項所述的試劑盒，其中，所述聚 合物選自由丙烯酰胺、曱基丙烯酰胺、丙烯酸酯、曱基丙烯酸 酉旨、丙烯酸和曱基丙烯酸的均聚物或共聚物組成的組。
67. 根據(jù)權(quán)利要求64到66的任何一項所述的試劑盒，其中，所述試劑包括以下中的至少之一TCEP (三(2-羧乙基)膦)、配體-聚合物-連接物-間隔物結(jié)合物、磷酸鹽緩沖劑、TBS(tris-緩沖鹽水)、EDTA(乙二胺四乙酸)、乙酸銨緩沖劑、抗體、金屬鹽溶液、鑭系元素鹽溶液、阻斷1￡沖劑、沖洗《爰沖劑、FBS(月臺牛血清)、DMEM (達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基)、BSA(牛血清白蛋白)、二石克蘇^f唐醇、只又馬來酰亞胺、以及DMF (二曱基曱酰胺)。
68. 根據(jù)權(quán)利要求64至67中任一項所述的試劑盒，其中，所述聚合物附著于連4妄物。
69. 根據(jù)權(quán)利要求64至68中任一項所述的試劑盒，其中，所述聚合物附著于連4妻物和間隔物。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于分析物元素分析(包括ICP-MS)的基于新型金屬-聚合物結(jié)合物的元素標簽。聚合物骨架被官能化以不可逆地結(jié)合在使用之前由使用者選擇的金屬。所述聚合物被進一步官能化以附著連接物，該連接物允許附著于抗體或其他親和性試劑。聚合物形式允許附著給定同位素的多個拷貝，其線性地提高靈敏度。所述金屬-聚合物結(jié)合物標簽能夠以兩種形式進行多重分析全分析，其中樣品中的平均生物標記物分布是診斷性的，和單細胞形式，以區(qū)分復雜樣品(例如血液)中的少數(shù)(例如患病)細胞。
文檔編號G01N33/53GK101495867SQ200780027791
公開日2009年7月29日 申請日期2007年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月27日
發(fā)明者弗拉迪米爾·巴拉諾夫, 樓旭東, 米切爾·A·溫尼克, 馬克·尼茨 申請人:米切爾·A·溫尼克;馬克·尼茨;弗拉迪米爾·巴拉諾夫;樓旭東