專利名稱：人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/心肌鈣蛋白i診斷試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/心肌鈣蛋白I診斷試紙技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/心肌鈣蛋白I診斷試紙，屬于免疫層析快速 檢測(cè)領(lǐng)域。
技術(shù)背景肌紅蛋白是存在于肌肉組織中的一種亞鐵血紅素蛋白，它在肌肉細(xì)胞間傳輸氧氣。由于 分子量較小，當(dāng)肌肉細(xì)胞損傷后，肌紅蛋白迅速釋放到血液中，24小時(shí)后，開始在血液中升 高。肌紅蛋白靈敏度很高但不夠特異，所以肌紅蛋白作為心肌梗死早期標(biāo)志物之一，具有很 高的陰性排除價(jià)值。肌酸激酶同工酶是存在于心肌組織中的一種二聚體酶，參與肌肉組織的新成代謝。當(dāng)心 肌損傷后，肌酸激酶同工酶釋放到血液中，3-8小時(shí)后，開始在血液中升高。肌酸激酶同工酶是最重要的心肌梗死標(biāo)志物之~"o肌鈣蛋白由肌鈣蛋^1、 T、 C三亞基構(gòu)成，它們和原肌球蛋白一起通過調(diào)節(jié)C^+對(duì)橫紋 肌動(dòng)蛋白ATP酶的活性來調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白相互作用。當(dāng)心肌損傷后，心肌肌鈣蛋白 復(fù)合物釋放到血液中，4-6小時(shí)后，開始在血液中升高，升高的肌鈣蛋白I能在血液中保持 很長(zhǎng)時(shí)間(6-10天)，這樣就提供了較長(zhǎng)的檢測(cè)期。并且心肌肌鈣蛋白I具有高度的心肌特異 性和靈敏度，所以心肌肌鈣蛋白I己成為目前最理想的心肌梗死標(biāo)志物。常用的測(cè)定方法有放射性免疫法(RIAs)、高壓液相色譜分析法、生化分析儀、蛋白分析 儀及各種診斷試劑盒。這些方法需要特殊防護(hù)設(shè)備、嚴(yán)苛的條件、價(jià)格昂貴的儀器和訓(xùn)練有 素的人員，而且操作費(fèi)時(shí)、樣本存儲(chǔ)困難，不易于推廣應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的一些問題，提供了一種利用快速免疫層析法，定性地檢 測(cè)臨床標(biāo)本(全血/血清/血漿)中人肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶和心肌鈣蛋白I的診斷試紙， 是對(duì)急性心肌梗塞檢測(cè)的一種輔助手段，僅用于體外診斷。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/心肌鈣蛋白I診斷試紙是由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、 顏色顆粒固定墊、樣品吸液層、MAX線組成，底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有 一條人肌紅蛋白單抗試驗(yàn)線、 一條肌酸激酶同工酶單抗試驗(yàn)線、 一條心肌^蛋白I單抗試驗(yàn) 線和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，在底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層， 硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板與顏色顆粒固定墊相互交疊連接，在顏色顆粒固定墊上壓有 樣品吸液層。其中顏色顆?？梢允且环N金屬膠體顆粒，可包括膠體金顆粒、銀顆粒、鐵顆粒、磁性顆 粒等， 一種標(biāo)記顆粒，可包括染料顆粒、乳膠顆粒、熒光頓粒等，當(dāng)釆用磁性顆粒時(shí)可實(shí)現(xiàn) 半定量或全定量檢測(cè)。樣品吸液層由三層材料疊加組成，第一層為一定規(guī)格無紡布層、第二層為玻璃纖維層、 第三層為一定規(guī)格無紡布層，上述物質(zhì)均需經(jīng)過表面活性劑緩沖液浸泡處理，干燥后備用。檢測(cè)時(shí)，把試紙的取樣端放入檢測(cè)樣本中(液面不得超過MAX線)由于毛細(xì)管作用檢測(cè) 樣品將沿著試紙條向吸水層端移動(dòng)，樣品中肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶、心肌鈣蛋白I抗原 可與各自相應(yīng)標(biāo)記探針發(fā)生特異結(jié)合后繼續(xù)移動(dòng)與包被在硝酸纖維素膜上的抗體結(jié)合，從而 被抗肌紅蛋白、抗肌酸激酶同工酶、抗心肌鈣蛋白I單克隆抗體識(shí)別，即發(fā)生雙抗夾心的特 異結(jié)合。檢測(cè)過程中，當(dāng)上行液面即滯留于此區(qū)域的標(biāo)記探針將顯示相應(yīng)的紅色，出現(xiàn)兩條 或以上紅線為陽(yáng)性，僅出現(xiàn)一條紅線表示為陰性結(jié)果。于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明所提供的人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/心肌鈣蛋白I診斷 試紙具有這樣的有益效果即特異性強(qiáng)，靈敏度高，易儲(chǔ)存，無須專門技術(shù)人員操作，不需要儀器設(shè)備，而且結(jié)果易讀。

圖1為人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/心肌鈣蛋白I診斷試紙的主視結(jié)構(gòu)圖。圖2為人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/心肌鈣蛋白I診斷試紙的俯視結(jié)構(gòu)圖。 圖3為人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/心肌鈣蛋白I診斷試紙的陽(yáng)性結(jié)果圖。 圖4為人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/心肌鈣蛋白I診斷試紙的陰性結(jié)果圖。 圖中1、吸水板，2、硝酸纖維素膜，3、羊抗鼠多克隆抗體控制線，4、試驗(yàn)線，5、顏 色顆粒固定墊，6、樣品吸液層，7、底板，8、 MAX線。具體實(shí)施例1 合成免疫原口( 1)用^fi學(xué)合成方法合成兩種不同結(jié)合位點(diǎn)的肌紅蛋白合成免疫原；(2) 用化學(xué)合成方法合成兩種不同結(jié)合位點(diǎn)的肌酸激酶同工酶合成免疫原；(3) 用化學(xué)合成方法合成兩種不同結(jié)合位點(diǎn)的心肌鈣蛋白I合成免疫原。2. 單克隆抗體的制備(1) 將制備的兩種不同結(jié)合位點(diǎn)的肌紅蛋白合成免疫原免疫BALB/c小鼠。細(xì)胞融合建 立瘤株進(jìn)行篩選，取瘤細(xì)胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產(chǎn)生腹水。提取小鼠腹水 純化篩選，獲得與肌紅蛋白分子不同位點(diǎn)結(jié)合的兩種肌紅蛋白單克隆抗體I 、肌紅 蛋白單克隆抗體II;(2) 將制備的兩種不同結(jié)合位點(diǎn)的肌酸激酶同工酶合成免疫原分別免疫BALB/c小鼠。 用SP20細(xì)胞融合建立瘤株進(jìn)行篩選，取瘤細(xì)胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產(chǎn)生 腹水。提取小鼠腹水純化篩選，獲得與肌酸激酶同工酶分子不同位點(diǎn)結(jié)合的兩種肌 酸激酶同工酶單克隆抗體I 、肌酸激酶同工酶單克隆抗體II;(3) 將制備的兩種不同結(jié)合位點(diǎn)的心肌鈣蛋白I合成免疫原分別免疫BALB/c小鼠。用 SP20細(xì)胞融合建立瘤株進(jìn)行篩選，取瘤細(xì)胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產(chǎn)生腹水。 提取小鼠腹水純化篩選，獲得與心肌鈣蛋白I分子不同位點(diǎn)結(jié)合的兩種心肌鈣蛋白I 單克隆抗體I、心肌鈣蛋白I單克隆抗體II;3. 顏色顆粒與單克隆抗體的結(jié)合把肌紅蛋白單克隆抗體II、肌酸激酶同工酶單克隆抗體II、心肌鈣蛋白i單克隆抗體n標(biāo)記的顏色顆粒分別吸附到纖維材料上，干燥后備用。4. 制膜機(jī)制膜肌紅蛋白單克隆抗體I 、肌酸激酶同工酶單克隆抗體I 、心肌鈣蛋白I單克隆抗體I包被試驗(yàn)線，控制線由羊抗鼠多克隆抗體包被。5. 試紙條組合按公知技術(shù)組合。6. 使用方法采集全血(靜脈血或指尖血)、血清或血漿。如使用全血標(biāo)本，請(qǐng)立即使用。不 應(yīng)將標(biāo)本在室溫條件下長(zhǎng)時(shí)間放置。如使用血清/血漿標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)盡快分離出血清或血槳，避免溶血。已經(jīng)溶血的標(biāo)本不能使用。靜脈血標(biāo)本在2-8'C條件下可以保存兩天，不能冷 凍。血清或血漿標(biāo)本在2-8'C條件下可以保存兩天。如長(zhǎng)期保存需冷凍(-2(TC)。避免反復(fù) 凍融。收集樣本在干凈的樣杯中，將試紙吸液層端插入樣本中，待測(cè)樣本界面勿超過診斷試紙 上的"MAX"線，10-15分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。顯色區(qū)為兩條或以上紅色線，則檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng) 性；僅出現(xiàn)一條控制線時(shí)為陰性；控制線未出現(xiàn)色帶，表明試紙過期或操作不當(dāng)，請(qǐng)另取 試紙重新檢測(cè)。
權(quán)利要求1. 一種人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/肌鈣蛋白I診斷試紙，其特征在于它是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、顏色顆粒固定墊(5)、樣品吸液層(6)、MAX線(8)組成，底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條人肌紅蛋白單抗試驗(yàn)線(4)、一條肌酸激酶同工酶單抗試驗(yàn)線(4)、一條肌鈣蛋白I單抗試驗(yàn)線(4)和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線(3)，在底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板與顏色顆粒固定墊相互交疊連接，在顏色顆粒固定墊上壓有樣品吸液層。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/肌鈣蛋白I診斷試紙，其特征在于顏色顆粒是一種金屬膠體顆粒o
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/肌鈣蛋白I診斷試紙，其特征在于金 屬膠體顆粒包括膠體金顆粒、銀顆粒、鐵顆粒、磁性顆粒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/肌鈣蛋白I診斷試紙，其特征在于樣 品吸液層由三層材料疊加組成，第一層為一定規(guī)格無紡布層、第二層為玻璃纖維層、第三 層為一定規(guī)格無紡布層。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/肌鈣蛋白I診斷試紙，其特征在于所 述的硝酸纖維素膜上包被有兩條線， 一條試驗(yàn)線， 一條控制線。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/肌鈣蛋白I診斷試紙，其特征在于顏 色顆粒是一種標(biāo)記顆粒。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/肌鈣蛋白I診斷試紙，其特征在于標(biāo) 記顆粒包括染料顆粒、乳膠顆粒、熒光顆粒。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/心肌鈣蛋白I診斷試紙，為通過快速免疫層析法，定性地檢測(cè)臨床標(biāo)本(全血/血清/血漿)中人肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶和心肌鈣蛋白I的診斷試紙。本實(shí)用新型是由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、顏色顆粒固定墊、樣品吸液層、MAX線組成，底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條人肌紅蛋白單抗試驗(yàn)線、一條肌酸激酶同工酶單抗試驗(yàn)線、一條心肌鈣蛋白I單抗試驗(yàn)線和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，在底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板與顏色顆粒固定墊相互交疊連接，在顏色顆粒固定墊上壓有樣品吸液層。
文檔編號(hào)G01N33/577GK201087837SQ20072014093
公開日2008年7月16日 申請(qǐng)日期2007年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者萬志強(qiáng), 萬志靜 申請(qǐng)人:萬華普曼生物工程有限公司