專利名稱：差異反應(yīng)免疫檢測法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)用免疫檢測法，特別是一種用一份標本不同濃度反應(yīng)和 對照顯示反應(yīng)產(chǎn)物的微粒免疫檢測法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的微粒固相檢測法的原理是以微粒為載體，在液相中捕獲待測物，形 成微粒免疫復合物，再使微粒免疫復合物沉降，去掉上清液，洗滌后檢測沉淀物的顯 示值，算出標本中待測物濃度?，F(xiàn)有的磁性酶聯(lián)免疫夾心法用針對待測抗原的一株單 克隆抗體標記酶AKP，另外一株單克隆抗體標記熒光素FITC;檢測時將待測抗原與AKP 標單抗和FITC標單抗混勻結(jié)合形成"夾心三明治"，加入包被有羊抗FITC抗體的磁 性微粒，反應(yīng)后外加磁場沉淀，去掉上清液，洗滌沉淀物，加入底物顯示結(jié)果。以上 兩法檢測高濃度標本時都有hook效應(yīng)(太高濃度待測物呈假陰性)，而且都需反復洗 滌以除去未結(jié)合的標記物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種可減少hook效應(yīng)和可不用常規(guī)洗滌的微粒免疫檢測法。 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，將同一待測標本稀釋成不同濃度，在操作過程中分 別加入反應(yīng)管或孔；反應(yīng)后將部分或全部上清液(或稀釋的上清液)吸入另一孔對照 反應(yīng)顯示，或?qū)⑸锨逡?或稀釋的上清液)和沉集物在同一反應(yīng)孔中分步反應(yīng)顯示， 再算出沉集物的顯示值，査出待測物濃度。 方案分述如下
1.用微量稀釋法在反應(yīng)孔或管(可預(yù)先封閉蛋白結(jié)合位點)中用稀釋液或試劑
稀釋待測標本，加入試劑I (比如標記的抗體)，反應(yīng)后將未稀釋標本加入該反應(yīng)孔； 反應(yīng)后在該孔中加入試劑II(已包被另一株單抗或抗抗體或金葡菌A蛋白等的磁性微 粒)；反應(yīng)后在反應(yīng)孔底側(cè)部或側(cè)面、上側(cè)部外加磁場，使沉集物積于孔底或孔壁的 一側(cè)；取部分或全部上清液(或稀釋上清液)加入另一孔(孔2),去掉原孔(孔l) 上清液(或保留部分上清液在孔l)，分別加入顯示底物，反應(yīng)后加入終止液，測顯示 值，對照孔1和孔2及空白孔顯示值算出沉集物的顯示值，查出待測物濃度。也可 待沉集物沉淀堆積于孔底一側(cè)后，在磁場固定下(或離心固定)，去掉部分或全部上清液，將洗稀液和/或底物液加入該孔，反應(yīng)一定時間后，測顯示值；然后去掉磁場， 使沉淀物重懸混勻，再反應(yīng)一定時間后，再使沉集物沉淀于孔底一側(cè)，再測上、膚液顯 示值，算出待測物濃度。
2. 微量稀釋法在反應(yīng)孔(可預(yù)先封閉蛋白結(jié)合位點)中先加入稀釋液或試劑; 用一尖頭物(比如微量加樣器的吸嘴)置入待稀釋的標本中，使尖頭外面蘸濕(或?qū)?液體吸入再打出，使尖頭里外面都蘸濕)；移出尖頭，在管壁接觸片刻或一紙墊上輕 點一下，除去多余液體；將尖頭置入反應(yīng)孔的液體中，使尖頭所蘸標本微量進入液體 中，再移出尖頭，由此達到高倍數(shù)直接稀釋的目的。
以上方案中也可將標本稀釋成多種濃度分多步加入；標記用的熒光素也可用其他 適合標記的物質(zhì)(比如地高辛、生物素等)替代；磁性微粒也可用血球、膠乳或聚乙 二醇等可用于分離的試劑替代；標記用的酶也可用熒光素、發(fā)光物、同位素、稀土元
素等替代。分配上清液時，可以1比1或其他比例分配。也可標記抗原，檢測相應(yīng)抗 體。
方案特點
1.試劑I、試劑II和標本的適當比例可使標本的各濃度得以充分反應(yīng)顯示，顯示 值可以疊加，使高濃度標本的顯示值大于某一閾值，提示應(yīng)作進一步稀釋定量，從而 減少或排除hook效應(yīng)。取上清液另孔對照測定或原孔對照測定，可算出沉集物的顯 示值，故可省去常規(guī)洗滌。
2微量稀釋法可直接在反應(yīng)孔中作高倍數(shù)稀釋，簡便節(jié)省。
3. 磁性分離時在反應(yīng)孔底側(cè)部或側(cè)面、上側(cè)部放置磁體，可使沉集物積于孔壁一 側(cè)，故可直接在該孔比色。
4. 預(yù)先封閉反應(yīng)孔蛋白結(jié)合位點可減少塑料孔對蛋白的吸附，可先加試劑后加 標本。
以上特點可分別組合使用或與別的方法組合使用。
具體實施例方式
實施例(一)差異夾心法(兩孔)檢測甲胎蛋白(AFP)
取3 50W稀釋液加入反應(yīng)孔中，用一微量加樣器取一干燥潔凈吸嘴，將吸嘴置 入標本中，使吸嘴尖頭外面被標本蘸濕，移出吸嘴，在管壁接觸片刻，再插入反應(yīng)孔 的稀釋液中，再移出吸嘴；加入試劑I (5 50W酶AKP標記單抗、5 5Cmi熒光素FITC標記單抗)，混勻，37'C反應(yīng)后將未稀釋標本加入該孔，混勻，37'C反應(yīng)后加入 試劑II (已包被抗FITC抗體的磁性微粒)10 100W，混勻，37'C反應(yīng)后在孔底側(cè)部 外加磁場，使沉集物堆于孔底的一側(cè)。在磁場中固定沉淀物，去掉原孔(孔1)中全 部上清液，加入洗稀液，再將孔l中洗稀液移入孔2;去掉磁場，在孔1和孔2中分 別加入適量顯示底物，混勻反應(yīng)后分別加入適量終止液，測吸光度A值，對照兩孔A 值及空白孔A值算出沉淀物的顯示值，從標準曲線查出AFP濃度。 實施例(二)差異夾心法(單孔)檢測C肽
取試劑I (10 50W酶HRP標記單抗、10 50W熒光素FITC標記單抗)加入反 應(yīng)孔(已預(yù)封閉)；用一微量加樣器取一干燥潔凈吸嘴，將吸嘴置入標本中，使吸嘴 尖頭外面被標本蘸濕，移出吸嘴，在管壁接觸片刻，再插入反應(yīng)孔的試劑I中并移出 吸嘴，混勻，37'C反應(yīng)后加入試劑n (己包被抗FITC抗體的磁性微粒)20 100W， 混勻，37'C反應(yīng)后在孔底側(cè)部外加磁場，使沉集物沉淀于孔底的一側(cè)。在磁場中固定 沉淀物，去掉孔中上清液，加入底物液，37'C反應(yīng)后，測吸光度A值；然后去掉磁場， 使沉淀物重懸混勻，反應(yīng)一定時間后，再使之沉淀于孔底一側(cè)，再測上清液吸光度A 值，計算A值差并校正沉淀物對上清液A值的影響，査出C肽濃度。
實施例(三)差異競爭法檢測促甲狀腺素(TSH)
取5 50W標本加入反應(yīng)孔中，加入試劑K5 50W抗TSH抗體(兔抗人)和5 酶標記TSH抗原)，混勻，37i:反應(yīng)后加入試劑n (已包被羊抗兔抗體的磁性微 粒)10 10Cmi，混勻，37'C反應(yīng)后在孔底側(cè)部外加磁場，使沉集物堆于孔底的一側(cè)。 在磁場中固定沉淀物，去掉原孔(孔l)中全部上清液，加入洗稀液，再將孔l中洗 稀液移入孔2;在孔1和孔2中分別加入適量顯示底物，混勻反應(yīng)后分別加入適量終 止液，測吸光度A值，對照兩孔A值及空白孔A值算出沉淀物的顯示值，從標準曲線 査出TSH濃度。
權(quán)利要求
1一種微粒免疫檢測法，其特征是將同一待測標本稀釋成不同濃度，分別加入反應(yīng)孔；反應(yīng)后將上清液(或稀釋上清液)吸入另一孔對照反應(yīng)顯示，或?qū)⑸锨逡?或稀釋上清液)和沉集物在同一孔中分步反應(yīng)顯示，再算出沉集物的顯示值，查出待測物濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測法，用磁性分離時在反應(yīng)孔底側(cè)部或側(cè)面、上側(cè)部放 置磁體，使沉集物沉積于孔底或孔壁的一側(cè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測法，微量稀釋法是用一尖頭物蘸取微量標本，置入反 應(yīng)孔的液體中，使尖頭上標本微量進入液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測法，預(yù)先封閉反應(yīng)孔蛋白結(jié)合位點后，可先加試劑后 加標本。
全文摘要
一種微粒免疫檢測法，其特征是將標本稀釋成不同濃度(可用本法在反應(yīng)孔中稀釋)，分別加入反應(yīng)孔，使各濃度反應(yīng)結(jié)果疊加；反應(yīng)后將上清液或稀釋上清液吸入另一孔對照反應(yīng)顯示，或在同一孔中分步反應(yīng)顯示，再算出沉集物的顯示值，查出待測物濃度?？蓽p少hook效應(yīng)，省去洗滌。
文檔編號G01N33/543GK101408543SQ20071018032
公開日2009年4月15日 申請日期2007年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月13日
發(fā)明者陳純美 申請人:陳純美