專利名稱：兔抗大沙鼠免疫血清的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 一 種生物制品，特別是兔抗大沙鼠免疫血清。
技術(shù)背景自1877年R.克勞斯發(fā)現(xiàn)血清學(xué)反應(yīng)，1899年J.博爾代發(fā)現(xiàn)免疫學(xué)交叉反 應(yīng)以來，利用這種抗原與抗體的特異性免疫學(xué)反應(yīng)進(jìn)行疾病的診斷、生物鑒定 的技術(shù)方法得到廣泛的應(yīng)用和飛速發(fā)展，但這一技術(shù)方法需要開發(fā)研制特異性 的抗血清或特異性的抗體，以此作為特異性診斷試劑。同時(shí)，這種制劑可作為 進(jìn)行進(jìn)一步免疫學(xué)檢測(cè)，如酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、分子標(biāo)記等的基礎(chǔ)制劑。目前 國(guó)內(nèi)和國(guó)際多家生物制劑公司開發(fā)出了較多的常規(guī)科學(xué)試驗(yàn)和醫(yī)學(xué)檢測(cè)用特異 性免疫血清，如羊抗人免疫血清、羊抗鼠免疫血清、兔抗人免疫血清、兔抗鼠 免疫血清等等。由于免疫學(xué)反應(yīng)是一種種屬特異性非常高的特異性反應(yīng)，因此， 上述這些巿售的免疫血清制劑均有非常強(qiáng)的針對(duì)性，羊抗人或兔抗人的免疫血 清主要針對(duì)人類感染疾病的研究、診斷等，而羊抗鼠或兔抗鼠的免疫血清則主 要用于實(shí)驗(yàn)鼠類的疾病感染、模型和生物鑒定等的科學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)室診斷。如 果用上述制劑檢測(cè)和研究其它物種，則會(huì)由于種屬差異性的原因造成免疫交叉 反應(yīng)和非特異性等問題，引起研究結(jié)果和檢測(cè)結(jié)果的偏差，如假陽性或假陰性 等。鑒于此，對(duì)于大沙鼠感染性疾病的研究就需要專門研制相應(yīng)的抗血清。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種兔抗大沙鼠免疫血清，用于大沙鼠感染性疾病、 病原體和非致病性微生物感染的研究和實(shí)驗(yàn)室的特異性檢測(cè)診斷，使用方便。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的 一種兔抗大沙鼠免疫血清，它是由下列兩個(gè) 工藝步驟制得的a、大沙鼠血清IgG抗原的制備(l)釆集大沙鼠血液，靜置 待血清析出后以至少2000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度用離心機(jī)分離獲取大沙鼠血清； (2)再以至少5000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度用離心機(jī)去除步驟(1)大沙鼠血清中 的顆粒狀物；(3)將上述離心后的血清與等量生理鹽水混合，逐滴加入飽合硫 酸銨溶液至20%濃度，滴加時(shí)邊加邊搖，然后將其放置于4。C的冰箱內(nèi)保持至少 20分鐘，再以至少8000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度進(jìn)行離心操作5-15分鐘，去除血清 中的雜物及纖維蛋白；(4)取上清液再補(bǔ)加飽合硫酸銨至35%濃度，然后將其放 置于4T的冰箱內(nèi)保持至少20分鐘，再以至少8000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度進(jìn)行離 心操作5-15分鐘，棄上清液留取沉淀物，即為大沙鼠血清中的粗提IgG; (5) 將所述沉淀物重新用生理鹽水溶解，重復(fù)(3 )和(4 )步驟進(jìn)行進(jìn)一步純化；(6 ) 將純化后的大沙鼠IgG用生理鹽水溶解后，裝入透析袋用0. 01M pH7. 2 PBS進(jìn) 行透析過夜，透析后獲得的大沙鼠IgG抗原置于-2(TC的冰箱內(nèi)備用；b、兔抗 大沙鼠IgG抗體的制備(1)選取兩只各2. 5公斤左右的健康新西蘭實(shí)驗(yàn)兔備 用；(2)用lml注射器吸取由a步驟制得的大沙鼠IgG抗原lml，沿兔背脊柱兩 側(cè)行皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行初次免疫；(3)間隔半個(gè)月后進(jìn)行第二次免疫，免疫量 及方法同上；(4)然后再每隔15天免疫一次，劑量及方法同上，共免疫四次； (5)末次免疫15天后，由股靜脈釆集實(shí)驗(yàn)兔血液lmL,分離血清進(jìn)行抗體檢測(cè)， 檢測(cè)方法為免疫環(huán)狀沉淀試驗(yàn)和紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)；(6)當(dāng)抗體滴度已達(dá)到環(huán)狀 沉淀試驗(yàn)要求的1: 32時(shí)，則對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行腹腔加強(qiáng)免疫三天后進(jìn)行頸動(dòng)脈釆 血；(7)釆集的血液，靜置待血清析出后至少2000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度進(jìn)行離 心操作即可獲得兔抗大沙鼠免疫血清。大沙鼠是新疆平原荒漠地區(qū)分布最廣、數(shù)量最多的鼠類之一。不僅對(duì)野生 植被和農(nóng)作物具有巨大的破壞性，而且其自身攜帶和傳播的一些動(dòng)物性疾病的 對(duì)廣大人民群眾的生命健康構(gòu)成巨大威脅，如鼠疫、寄生病等。本發(fā)明兔抗大 沙鼠免疫血清將對(duì)研究大沙鼠感染性疾病、病原體和非致病性微生物起到重要 的作用。為制定有效的疾病預(yù)防措施提供科學(xué)依據(jù)。釆用本發(fā)明工藝步驟制得 的兔抗大沙鼠免疫血清可以用于大沙鼠感染性疾病、病原體和非致病性微生物 感染的研究和實(shí)驗(yàn)室的特異性檢測(cè)診斷，也可用于以大沙鼠為模型的疾病研究， 并可作為與其它鼠種的進(jìn)行特異性生物鑒定和鑒別診斷的免疫血清制劑。同時(shí)， 本制劑可作為進(jìn)一步制備酶標(biāo)記免疫血清、熒光標(biāo)記免疫血清制劑的基礎(chǔ)制劑， 廣泛用于大沙鼠、相關(guān)疾病和生物鑒別的研究和生產(chǎn)活動(dòng)中。本發(fā)明工藝步驟 簡(jiǎn)單，易于制造，使用方便。
具體實(shí)施方式
一種兔抗大沙鼠免疫血清，它是由下列兩個(gè)工藝步驟制得的 a、大沙鼠血清IgG抗原的制備(1) 采集大沙鼠血液，靜置待血清析出后以4000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度用 離心機(jī)分離獲取大沙鼠血清；(2) 再以6000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度用離心機(jī)去除步驟(1)大沙鼠血清中 的顆粒狀物；(3) 將上述離心后的血清與等量生理鹽水混合，逐滴加入飽合硫酸銨溶液 至20%濃度，滴加時(shí)邊加邊搖，然后將其放置于4'C的冰箱內(nèi)保持30分鐘，再 以10000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度進(jìn)行離心搡作10分鐘，去除血清中的雜物及纖維 蛋白；(4) 取上清液再補(bǔ)加飽合硫酸銨至35%濃度，然后將其放置于4。C的冰箱 內(nèi)保持30分鐘，再以10000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度進(jìn)行離心操作10分鐘，棄上清
液留取沉淀物，即為大沙鼠血清中的粗提IgG;(5) 將所述沉淀物重新用生理鹽水溶解，重復(fù)(3)和(4)步驟進(jìn)行進(jìn)一 步純化；(6) 將純化后的大沙鼠IgG用生理鹽水溶解后，裝入透析袋用0. 01MpH7.2 PBS進(jìn)行透析過夜，其間至少換液三次以除去IgG中的NH/及S(V離子；透析后 獲得的大沙鼠IgG抗原置于-2(TC的冰箱內(nèi)備用。b、兔抗大沙鼠IgG抗體的制備(1) 選取兩只各2. 5公斤的健康新西蘭實(shí)驗(yàn)兔備用；(2) 用lml注射器吸取由a步驟制得的大沙鼠IgG抗原lml,沿兔背脊柱 兩側(cè)行皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行初次免疫；(3) 間隔半個(gè)月后進(jìn)行第二次免疫，免疫量及方法同上；(4) 然后再每隔15天免疫一次，劑量及方法同上，共免疫四次；(5) 末次免疫15天后，由股靜脈采集實(shí)驗(yàn)兔血液lmL分離血清進(jìn)行抗體 檢測(cè)，檢測(cè)方法為免疫環(huán)狀沉淀試驗(yàn)和紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)；(6) 若抗體滴度已達(dá)到環(huán)狀沉淀試驗(yàn)要求的1: 32,則對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行腹腔 加強(qiáng)免疫三天后進(jìn)行頸動(dòng)脈采血，若抗體滴度未達(dá)到環(huán)狀沉淀試驗(yàn)要求的1: 32, 則繼續(xù)按步驟(4)進(jìn)行免疫直至抗體達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)后再進(jìn)行頸動(dòng)脈釆血；(7) 采集的血液，靜置待血清析出后以4000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度進(jìn)行離 心搡作獲取血清，本血清即為兔抗大沙鼠免疫血清；(8) 用免疫環(huán)狀沉淀試驗(yàn)和紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)，按20mL/每袋 分裝，置于-2(TC冰箱內(nèi)保存?？勾笊呈驣gG免疫血清檢測(cè)。1、 環(huán)狀沉淀試驗(yàn)1) 將環(huán)狀試驗(yàn)管排列到小試管架上并編號(hào)；2) 用移液器將大沙鼠IgG抗原置于環(huán)狀試驗(yàn)管中，每管0.1ml;3) 將抗大沙鼠IgG免疫血清行1: 4、 1: 8、 1: 16、 1: 32、 1: 64稀釋后，分別吸取各稀釋度的抗大沙鼠二抗血清用移液器沿環(huán)狀試驗(yàn)管壁緩慢加入到相 應(yīng)小試管大沙鼠IgG抗原液上，每管O. lml;4) 靜放l小時(shí)后觀察結(jié)果；5) 陽性則在兩液界面上出現(xiàn)環(huán)狀沉淀帶，陰性則不出現(xiàn)環(huán)狀沉淀帶；6) —般情況下，環(huán)狀沉淀試驗(yàn)免疫效價(jià)在1: 32或1: 64為可使用效價(jià)。2、 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) 雙醛化血球制備1)用大三角燒瓶配制3. 8%的檸檬酸三鈉抗凝液100ml,至冰箱冷卻到4'C左右；2) 用大號(hào)釆血針頸靜脈釆集新鮮綿羊血液150ml加入到已加好抗凝劑的三角燒瓶中，其間輕微搖動(dòng)三角燒瓶以防血液凝固；3) 用100ml大號(hào)離心管將上述含綿羊紅細(xì)胞溶液以3000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速 度進(jìn)行離心操作，20分鐘后輕輕倒去上清液；4) 用O. 01M pH7. 2 PBS緩沖液清洗綿羊紅細(xì)胞5遍以去除血液中的蛋白；5) 用1%戊二醛和洗凈的綿羊血球混勻，邊加戊二醛邊搖動(dòng)血球，血球戊二 醛溶液比例大約為l: 5左右，作用30分鐘進(jìn)行初步醛化；6) 將初步醛化后的綿羊紅細(xì)胞再用0. 01M pH7. 2 PBS緩沖液洗綿羊紅細(xì)胞3遍57) 將洗凈的綿羊紅細(xì)胞用0. 01M pH7. 2 PBS緩沖液配成10%綿羊紅細(xì)胞溶 液與甲醛溶液混勾，甲醛溶液與綿羊紅細(xì)胞溶液混合比例約為1: 5左右，混合 液在搖床上搖動(dòng)過液；8) 將甲醛處理過的綿羊紅細(xì)胞再用0. 01M pH7. 2 PBS緩沖液洗血球5遍； 單寧酸處理雙醛化血球1)將雙醛化處理的血球用0. 01M pH6. 4 PBS配成10%濃度與1/2萬單寧酸 溶液等量混合，室溫作用30分鐘后用0. 01M pH5. 0 PBS洗血球3遍； 大沙鼠IgG抗原致敏血球的制備 1. 1大沙鼠IgG抗原致敏濃度的選擇1. 1. 1將中號(hào)試管排在試管架上并編號(hào)，用0. 01M pH5.0 PBS將大沙鼠 IgG抗原稀釋成l: 10、 1: 20、 1: 40、 1: 80、 1: 160、 1: 320等不同稀釋度， 將經(jīng)單寧酸處理的雙醛化血球加入上述各管中，綿羊紅細(xì)胞終濃度為5%，搖床 上搖動(dòng)過液使大沙鼠IgG抗原致敏到綿羊紅細(xì)胞上；1. 1. 2次日將上述不同稀釋度大沙鼠IgG抗原致敏的綿羊血球，以4000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度進(jìn)行離心操作后棄上清液；1. 1. 3各濃度致敏的綿羊紅細(xì)胞血球用10%兔血清鹽水飽和30分鐘以減少血球非特異性凝集；1. 1. 4用1%兔血清鹽水將上述各濃度致敏的綿羊紅細(xì)胞血球洗5遍以去 除綿羊血球上多余的兔蛋白；1. 2將不同濃度致敏的血球配成ly。血球用于兔抗大沙鼠免疫血清的檢測(cè)，選擇凝集相好、敏感性高的為兔抗大沙鼠免疫血清檢測(cè)的使用濃度。 結(jié)果兔抗大沙鼠免疫血清環(huán)狀沉淀試驗(yàn)效價(jià)l: 32,血凝效價(jià)l: 8192。 兔抗大沙鼠免疫血清的用途1.建立ELISA檢測(cè)大沙鼠鼠疫F1抗體的方法1. 1用0. 05M pH9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋兔抗大沙鼠免疫血清包被酶標(biāo)板； 1. 2加入大沙鼠被檢血清； 1. 3 37。C溫箱反應(yīng)l小時(shí)；1. 4沖洗反應(yīng)板后，加HRP-F1(鼠疫Fl抗原酶標(biāo)記物)，37。C溫箱反應(yīng)1 小時(shí)；1. 5沖洗反應(yīng)板后，加顯色液；1. 6出現(xiàn)顏色者為陽性，反之則為陰性。本發(fā)明兔抗大沙鼠免疫血清為國(guó)內(nèi)外免疫學(xué)生物制劑的新品種。其發(fā)明工 藝中采用的大沙鼠血清IgG抗原為本發(fā)明的特有產(chǎn)品，并在生產(chǎn)工藝中采用了 雙醛化方法處理血球技術(shù)，增加了試劑的穩(wěn)定性，檢測(cè)結(jié)果凝集相好且敏感性 高，便于結(jié)果觀察，也彌補(bǔ)了一般檢測(cè)試劑特異性高，敏感性差的不足。
權(quán)利要求
1、一種兔抗大沙鼠免疫血清，其特征在于它是由下列兩個(gè)工藝步驟制得的a、大沙鼠血清IgG抗原的制備(1)采集大沙鼠血液，靜置待血清析出后以至少2000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度用離心機(jī)分離獲取大沙鼠血清；(2)再以至少5000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度用離心機(jī)去除步驟(1)大沙鼠血清中的顆粒狀物；(3)將上述離心后的血清與等量生理鹽水混合，逐滴加入飽合硫酸銨溶液至20％濃度，滴加時(shí)邊加邊搖，然后將其放置于4℃的冰箱內(nèi)保持至少20分鐘，再以至少8000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度進(jìn)行離心操作5-15分鐘，去除血清中的雜物及纖維蛋白；(4)取上清液再補(bǔ)加飽合硫酸銨至35％濃度，然后將其放置于4℃的冰箱內(nèi)保持至少20分鐘，再以至少8000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度進(jìn)行離心操作5-15分鐘，棄上清液留取沉淀物，即為大沙鼠血清中的粗提IgG；(5)將所述沉淀物重新用生理鹽水溶解，重復(fù)(3)和(4)步驟進(jìn)行進(jìn)一步純化；(6)將純化后的大沙鼠IgG用生理鹽水溶解后，裝入透析袋用0.01M pH7.2 PBS進(jìn)行透析過夜，透析后獲得的大沙鼠IgG抗原置于-20℃的冰箱內(nèi)備用；b、兔抗大沙鼠IgG抗體的制備(1)選取兩只各2.5公斤左右的健康新西蘭實(shí)驗(yàn)兔備用；(2)用1ml注射器吸取由a步驟制得的大沙鼠IgG抗原1ml，沿兔背脊柱兩側(cè)行皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行初次免疫；(3)間隔半個(gè)月后進(jìn)行第二次免疫，免疫量及方法同上；(4)然后再每隔15天免疫一次，劑量及方法同上，共免疫四次；(5)末次免疫15天后，由股靜脈采集實(shí)驗(yàn)兔血液1mL，分離血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，檢測(cè)方法為免疫環(huán)狀沉淀試驗(yàn)和紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)；(6)當(dāng)抗體滴度已達(dá)到環(huán)狀沉淀試驗(yàn)要求的1∶32時(shí)，則對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行腹腔加強(qiáng)免疫三天后進(jìn)行頸動(dòng)脈采血；(7)采集的血液，靜置待血清析出后至少2000轉(zhuǎn)/分鐘的離心速度進(jìn)行離心操作即可獲得兔抗大沙鼠免疫血清。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的兔抗大沙鼠免疫血清，其特征在于將純化后的大 沙鼠IgG用生理鹽水溶解后，裝入透析袋用0. 01M pH7. 2 PBS進(jìn)行透析過夜， 其間至少換液三次以除去IgG中的NH/及S(V離子。
全文摘要
一種兔抗大沙鼠免疫血清，包括a.大沙鼠血清IgG抗原的制備采集大沙鼠血液，離心分離大沙鼠血清；將血清中加入飽合硫酸銨溶液，冷藏，再高速離心操作去除血清中的雜物及纖維蛋白；取上清液再補(bǔ)加飽合硫酸銨，冷藏，再進(jìn)行高速離心棄上清液留取沉淀物，即為大沙鼠血清中的粗提IgG；經(jīng)純化后的大沙鼠IgG裝入透析袋透析過夜；b.兔抗大沙鼠IgG抗體的制備選取實(shí)驗(yàn)兔；吸取上述大沙鼠IgG抗原，沿兔背脊柱兩側(cè)行皮下多點(diǎn)注射免疫四次；采集實(shí)驗(yàn)兔血液，分離血清進(jìn)行抗體檢測(cè)；當(dāng)抗體滴度達(dá)到1∶32時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行頸動(dòng)脈采血；靜置待血清析出后進(jìn)行離心操作即可獲得兔抗大沙鼠免疫血清。本發(fā)明工藝步驟簡(jiǎn)單，使用方便。
文檔編號(hào)G01N33/531GK101210921SQ20071018005
公開日2008年7月2日 申請(qǐng)日期2007年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月24日
發(fā)明者張渝疆, 翔 戴, 王信惠, 阿布利米提, 阿扎提 申請(qǐng)人:新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心