專利名稱：一種用于篩查血清中不規(guī)則抗體的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外診斷試劑，更具體地，本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫吸附測定(以下縮寫為 ELISA)試劑盒，它能同時篩査血清中是否含有血型不規(guī)則抗體。
背景技術(shù)：
血清中不規(guī)則抗體是指不符合ABO血型系統(tǒng)Landsteiner法則的血型抗體，也就是抗A、 抗B以外的血型抗體。ABO系中的亞型、變異型抗A1或某種抗B等抗體，也稱為不規(guī)則抗體， 其多為IgG類抗體。這些抗體主要是經(jīng)輸血或妊娠等免疫刺激產(chǎn)生，在鹽水介質(zhì)中不能凝集 而只能致敏相應(yīng)抗原的紅細胞，必須通過特殊方法(抗人球蛋白法、凝聚胺法等)檢測，才 能使致敏紅細胞出現(xiàn)凝集反應(yīng)。臨床上通常所稱的"同型血"實際上是指ABO血型系統(tǒng)和Rh 血型系統(tǒng)D抗原相同，其它紅細胞血型系統(tǒng)未必相同。如果交叉配血不仔細，或者只用鹽水 介質(zhì)配血，則有可能檢査不出ABO血型系統(tǒng)之外的不規(guī)則抗體，而此抗體與相應(yīng)抗原發(fā)生免 疫反應(yīng)，可導致溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生。
由于有臨床意義的不規(guī)則抗體會導致溶血性輸血反應(yīng)，破壞輸入的不配合的紅細胞或縮 短其壽命，產(chǎn)生溶血性輸血反應(yīng)，輕則影響治療效果，重則危機病人生命；此外，對孕婦而
言，不規(guī)則抗體會引起新生兒溶血病，影響新生兒臟器的發(fā)育，并使其智力發(fā)育受到傷害， 嚴重者則會危及新生兒的生命安全。因此，不規(guī)則抗體篩査是很必要而且必須的。其篩査的 意義主要在于三個方面
1、 獻血者的血清或血漿進行抗體篩查，可以防止含有不規(guī)則抗體的血液輸注給病人，避免由 于獻血者血液中的不規(guī)則抗體引起病人紅細胞的破壞而引起的溶血性輸血反應(yīng)，同時可以減 少血液浪費，可將有不規(guī)則抗體的血液制備成抗體血清，用于稀有血型的檢測。
2、 對需要輸血治療的患者，進行不規(guī)則抗體篩查，可以有助于血液選擇，從而有充分的時間 來選擇不含有針對某抗體的響應(yīng)抗原的血液，從而防止因為輸注含有某抗體相應(yīng)抗原的血液 而引起溶血性輸血反應(yīng)，保證輸血安全。
3、 孕婦進行不規(guī)則抗體篩查，可以盡早發(fā)現(xiàn)不規(guī)則抗體，可以在孕期進行新生兒溶血病的預(yù) 防和治療，減少不規(guī)則抗體對胎兒或新生兒帶來的傷害，減少新生兒溶血病的性病程度，提 高胎兒或新生兒的身體素質(zhì)。
雖然不規(guī)則抗體篩查陽性率僅為0. 37%，但是該項陽性的患者一旦輸入具有相應(yīng)抗原的 紅細胞，抗原、抗體發(fā)生免疫性結(jié)合，在補體的參與下，使輸入的紅細胞發(fā)生溶解，即發(fā)生 溶血性輸血反應(yīng)?；颊叱霈F(xiàn)發(fā)熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿，嚴重時甚至危及其生命。因此，
在輸血中要經(jīng)常警惕這種輸血反應(yīng)發(fā)生的可能性。當不規(guī)則抗體篩查陽性時，必須進一步作 抗體鑒定，確定其特異性后，再輸入無相應(yīng)抗原的紅細胞，才能達到安全輸血之目的。
新生兒溶血病(HDN)也是由于母親體內(nèi)存在著與其胎兒紅細胞不配合的IgG類的不規(guī)則 抗體，引起的同種被動免疫性疾病。凡是以IgG性質(zhì)出現(xiàn)的不規(guī)則抗體，理論上都可以引起 HDN，因為IgG性質(zhì)抗體能通過胎盤進入胎兒血循環(huán)，破壞胎兒紅細胞，引發(fā)胎兒水腫、黃疸、 貧血和肝脾腫大，甚至并發(fā)核黃疸。因此對有輸血史或妊娠史的孕婦也應(yīng)作不規(guī)則抗體篩查， 若檢測出不規(guī)則抗體，應(yīng)做出相應(yīng)的預(yù)防和治療。Rh血型中D抗原的抗原性強于E抗原的抗 原性，因此產(chǎn)生抗一D抗體的幾率大于抗一E抗體。
不規(guī)則抗體產(chǎn)生大多為Rh血型系統(tǒng)，除抗一D外，其他如抗一E、抗一e、抗一C和抗一c 檢出率占他系統(tǒng)67.8%，提示Rh陽性患者輸血也可引起溶血反應(yīng)，且機率較高。根據(jù)我國 漢族人群Rh抗原分布特點，E抗原陽性比D抗原陽性低，產(chǎn)生抗E抗體的機率高于抗D抗體， 故Rh血型系統(tǒng)D抗原陽性E抗原陰性者輸血不容忽視。Rh陰性個體免疫后產(chǎn)生抗D的機率 為70.9%，產(chǎn)生的抗體其效價在體內(nèi)會逐漸下降，甚至常規(guī)試驗會漏檢，若以后作為受血者 輸入Rh(D)陽性血刺激時，會很快出現(xiàn)免疫性回憶反應(yīng)?？贵w效價會在1 2周內(nèi)達到高峰， 引起遲發(fā)性血管外溶血，且發(fā)生在輸血后幾天。造成的輸血無效以及溶血，易被臨床忽視。 溶血反應(yīng)的強度與抗體效價成正比關(guān)系，抗體產(chǎn)生的強度增加溶血反應(yīng)愈嚴重?？筂、抗Le8、 抗P1均較少見，但抗Lea抗體可引起嚴重的溶血性輸血反應(yīng)，所以不能作為供血者，如為受 血者時應(yīng)給LE(a-b-)血液輸入?？挂籑抗體只有37t)或抗球蛋白試驗出現(xiàn)陽性時才具有臨床 意義?？筆1最理想的反應(yīng)溫度為4X:，偶可在37-C查出。抗P1抗體很少在體內(nèi)造成溶血， 幾乎總是IgM型抗體，所以不能通過胎盤，不會造成HDN。冷凝集素在配血時可忽略。自身 抗體在自身溶血性貧血時出現(xiàn)較多， 一直以來是輸血的一大難題，目前無法鑒定出自身抗體 以外的不規(guī)則抗體，輸血只能遵循選擇較弱凝集的血液輸注的輸血原則。
美國、日本、澳大利亞等國家均已將不規(guī)則抗體篩查列入常規(guī)檢測，而我國衛(wèi)生行政部
門目前尚未要求對獻血者進行抗體篩査，在臨床也只有少數(shù)醫(yī)院對患者進行抗體篩査。我國 目前大多數(shù)臨床醫(yī)院輸血科(或血庫)的配血水平比較落后， 一直沿用室溫鹽水方法配血， 此方法只能檢出不配合的IgM類抗體，不能檢出不配合的IgG抗體，而ABO血型系統(tǒng)以外的 其他血型系統(tǒng)的絕大多數(shù)抗體是IgG性質(zhì)的抗體，因此，含有不規(guī)則抗體(抗一A、抗一B或 抗-AB以外的其他抗體，如抗-D)的血液給病人輸用后，此不規(guī)則抗體會引起急或遲發(fā)性輸 血反應(yīng)，往往給病人生命帶來危險。為提高血液質(zhì)量，保證輸血患者的輸血安全，提高輸血 治療效果，避免患者輸用含有不規(guī)則抗體引起的輸血反應(yīng)，使我國輸血事業(yè)與世界接軌，應(yīng) 該對獻血者或輸血者進行不規(guī)則抗體篩査。
目前檢測不規(guī)則抗體的主要方法為將O型紅細胞與待檢血漿(清)混合，用抗人球蛋白法和 凝聚胺法檢出，不足之處如下
1、 目前檢測血清中不規(guī)則抗體是利用標準譜細胞來完成的。由于譜細胞的保存期短，如果不 及時應(yīng)用，產(chǎn)品就會過期而浪費；
2、 操作復雜，尤其對于樣本數(shù)較多是，工作量太大，結(jié)果判讀困難；
3、 由于譜細胞的細胞譜有限，目前的譜細胞不能完全區(qū)分紅細胞血型不規(guī)則抗體，所以無法 準確檢出抗體；
4、 不能鑒定某些疾病(如自身免疫性溶血性貧血)體內(nèi)的不規(guī)則抗體組成；
5、 檢出結(jié)果無法保存，不利于實驗數(shù)據(jù)保存；
6、 檢出費用過高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服上述缺點，提供一種能篩查血清中的不規(guī)則抗體，并且保存期 長的試劑盒。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于篩查血清中不規(guī)則抗體的試劑盒的制備方法。 為達到上述目的，本發(fā)明包括
a) 、酶聯(lián)板，之上己經(jīng)包被了O型混合紅細胞膜蛋白，這種膜蛋白包含了所有紅細胞抗
原；
b) 、陰性血清，與上述O型混合紅細胞無凝集反應(yīng)的人血清作為陰性對照；和
c) 、陽性血清，與上述O型混合紅細胞有凝集反應(yīng)的人血清作為陽性對照。 本試劑盒可以進一步包含封閉液、清洗溶液、第二抗體、底物稀釋緩沖液、底物和終止
溶液。在優(yōu)選的實施方案中，封閉液包含小牛血清、清洗溶液包含磷酸鹽緩沖液(PBS)，第 二抗體包含辣根過氧化物酶標記的抗人IgG的山羊血清，底物是四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，且 該試劑盒進一步包含過氧化氫溶液，終止液包含硫酸。
優(yōu)選地，試劑盒分別包被0型混合紅細胞膜蛋白量是1. 5-2. 5 u g蛋白/孔。 用于篩查血清中不規(guī)則抗體的試劑盒的制備方法，其中，制備酶聯(lián)板包括如下步驟
a) 分離紅細胞抗原
b) 包被紅細胞抗原
本發(fā)明的原理是不用O型譜紅細胞作為檢測試劑，而是提取紅細胞膜蛋白，其中包含 紅細胞表面的抗原，包被在酶聯(lián)板上，利用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)方法來篩査待檢血清中是 否含有不規(guī)則抗體。
本發(fā)明的優(yōu)點保存期長、高通量、結(jié)果易于判定以及檢測方法簡便易行。
具體實施例方式
本發(fā)明提供了一種能篩査血清中的不規(guī)則抗體的ELISA試劑盒。本試劑盒包含一塊包被 了紅細胞膜蛋白的酶標板用來篩査血清中抗體，如果受試驗者的血清經(jīng)檢測后呈陽性，則說 明血清中含有不規(guī)則抗體。
本發(fā)明的一個實施方案是包含作為陰陽對照的人血清、辣根過氧化物酶標記的抗人IgG 山羊血清，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)作為顯色底物的ELISA試劑盒。
試劑盒包含下列內(nèi)容物-
1、 包被了混合O型紅細胞膜蛋白的酶聯(lián)板96孔板或12X8長條
2、 陰性標準血清l瓶
3、 陽性標準血清l瓶
4、 清洗溶液i瓶(ras緩沖液)
5、 第二抗體l瓶
6、 底物緩沖液l瓶
7、 顯色底物(四甲基聯(lián)苯胺)l瓶
8、 過氧化氫l瓶
9、 終止溶液1瓶 上述內(nèi)容物具體描述如下-
1、 包被了混合O型紅細胞膜蛋白的酶標板96孔板或12X8長條
2、 陰性標準血清，正常人血清，不與混合O型紅細胞發(fā)生凝集反應(yīng)l瓶
3、 陽性標準血清，與混合O型紅細胞發(fā)生凝集反應(yīng)的人血清。
4、 清洗溶液(IO倍濃縮的PBS緩沖液)l瓶
成分0. 1MPBS 25ml、 0. 5%的Tween20、 0. 05v/v96的Proclin300
5、 第二抗體溶液 一瓶(使用前稀釋100倍)
成分辣根過氧化物酶標記的抗人IgG山羊血清、使用時用含有適量牛血清白蛋白的PBS 緩沖液稀釋100倍
6、 底物緩沖液 一瓶
成分檸檬酸-磷酸緩沖液100ml、 0.05v/v9&的Proclin300。
7、 底物(四甲基聯(lián)苯胺)l瓶
8、 過氧化氫l瓶，在使用前稀釋在底物緩沖液中至濃度為0.1%
9、 終止溶液l瓶
成分2N硫酸15ml
在上述試劑盒中，下列情況被認為是陽性(陽性對照和樣品的OD450值與空白對照的比 值大于等于40)
本試劑盒的制造方法
1、包被了混合O型紅細胞膜蛋白酶標板的準備
混合0型紅細胞膜蛋白包被在96孔酶標板上，封閉并干燥，然后冷藏。 標準血清的制備
陰性血清的制備取正常人的血清，經(jīng)檢測，與混合0型紅細胞不發(fā)生任何凝集反
應(yīng)；
陽性血清的制備這是一種混合血清，其中含有各種不規(guī)則抗體，與混合O型紅細 胞發(fā)生凝集反應(yīng)
本發(fā)明可以通過下面的實施例更好地理解，所描述的具體材料和結(jié)果只是例子，不是對 權(quán)利要求書中的描述進行限制。
① 低滲法提取紅細胞膜蛋白取5ml混合O型紅細胞加0.01mol/LPBS(pH7.4)，離心3000 r/min， 20 min，棄上清和上清下的白細胞、血小板層。用相當于紅細胞壓積3倍的預(yù)冷 PBS(pH7.4)洗滌3次(4。C， 5 000 r/min， 15 min)。加預(yù)冷的0.01 mol/LTric-HCl(pH7.4)與紅 細胞(V : V=40 : l)混合，4。C放置2 h。再以9 000 r/min離心20 min，棄上清(重復3~5次) 至無肉眼可見的紅細胞為止。沉淀物加lml的0.01 mol/LPBS(pH7.4)溶解，利用BCA蛋白濃 度測定試劑盒測定膜蛋白的濃度1. 5mg/mL。
② 膜蛋白包被將紅細胞膜蛋白用包被緩沖液(pH9.6碳酸鹽緩沖液)稀釋為10ng/ml，每孔 100lU，包被酶聯(lián)板(COSTAR)， 4"C， 18-24小時后去除上清液，備用。
包被緩沖液(PH9.6， 0.05M碳酸鹽緩沖液)的配制方法 Na2C03 1.59克 NaHC032.93克 加蒸餾水至1000ml


圖1是96孔平板上抗原的覆蓋，各孔包被都是相同的混合抗原，cutoff值仍以空白的0D值 為計算參考。"+ "為陽性對照，"一"為陰性對照，"0"為空白對照，"？"為待檢樣本加樣 孔。
權(quán)利要求
1、一種用于篩查血清中不規(guī)則抗體的ELISA試劑盒，包含a)、酶聯(lián)板，之上已經(jīng)包被了O型混合紅細胞膜蛋白，這種膜蛋白包含了所有紅細胞抗原；b)、陰性血清，與上述O型混合紅細胞無凝集反應(yīng)的人血清作為陰性對照；和c)、陽性血清，與上述O型混合紅細胞有凝集反應(yīng)的人血清作為陽性對照。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，進一步包含稀釋液和清洗溶液、結(jié)合物溶液、底物緩沖液、底物和終止溶液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述的稀釋和清洗溶液包含磷酸鹽緩沖液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述的結(jié)合物溶液包含辣根過氧化物酶標記的抗人IgG山 羊血清，底物是四甲基聯(lián)苯胺，且該試劑盒進一步包含過氧化氫溶液。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2的試劑盒，其中所述的終止液包含硫酸。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其中所述的0型混合紅細胞膜蛋白的量分別是1.5-2.5yg蛋白/孔。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其中向0型混合紅細胞膜蛋白發(fā)生反應(yīng)的孔中加入25倍稀釋 的血清。
8、 一種制備用于檢測血清中不規(guī)則抗體的試劑盒的方法，其中制備酶聯(lián)板的步驟-a) 分離純化O型混合紅細胞膜蛋白；b) 包被O型混合紅細胞膜蛋白。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中分離O型混合紅細胞膜蛋白的步驟包括低滲法提取紅細 胞膜蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于篩查血清中不規(guī)則抗體的ELISA試劑盒及其制備方法，本試劑盒包含酶聯(lián)板，之上已經(jīng)包被了O型混合紅細胞膜蛋白，這種膜蛋白包含了所有紅細胞抗原；陰性血清，與上述O型混合紅細胞無凝集反應(yīng)的人血清作為陰性對照；和陽性血清，與上述O型混合紅細胞有凝集反應(yīng)的人血清作為陽性對照。本發(fā)明的原理是不用O型譜紅細胞作為檢測試劑，而是提取紅細胞膜蛋白，其中包含紅細胞表面的抗原，包被在酶聯(lián)板上，利用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)方法來篩查待檢血清中是否含有不規(guī)則抗體。本發(fā)明的優(yōu)點保存期長、高通量、結(jié)果易于判定以及檢測方法簡便易行。
文檔編號G01N33/543GK101109755SQ20071012046
公開日2008年1月23日 申請日期2007年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月20日
發(fā)明者周明非, 張建耕, 華 徐, 章?lián)P培, 郁成雨, 鮑國強 申請人:陜西省血液中心;中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所;北京望升偉業(yè)科技發(fā)展有限公司