專利名稱：用于定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的引物及熒光探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于硫酸鹽功能菌定量檢測(cè)的引物及探針。
背景技術(shù)：
硫酸鹽還原功能菌是一類與硫酸鹽還原反應(yīng)相關(guān)的細(xì)菌的總稱，是一個(gè)基于功能角度的對(duì)微生物的分類，在油田生產(chǎn)的過程中，硫酸鹽還原功能菌的繁殖會(huì)造成很多危害，如地面系統(tǒng)中腐蝕產(chǎn)物-不溶于水的金屬硫化物，導(dǎo)致污水發(fā)黑、懸浮固體含量增加，使處理后水中懸浮固體含量超標(biāo)；硫酸鹽還原功能菌的快速定量檢測(cè)，對(duì)于油田水質(zhì)檢測(cè)和地面系統(tǒng)中合理殺菌濃度的確定，及時(shí)指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的意義。目前，油田系統(tǒng)內(nèi)硫酸鹽功能菌菌的計(jì)數(shù)主要執(zhí)行中國(guó)石油天然氣行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，“油田注入水細(xì)菌分析方法-絕跡稀釋法”(部頒標(biāo)準(zhǔn))、SY-T0532-93。上述的這種方法存在的問題是檢測(cè)需要14天的時(shí)間，由于檢測(cè)周期較長(zhǎng)，不能有效的和即時(shí)的指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐，在實(shí)際操作過程中有些嚴(yán)格的厭氧硫酸鹽功能菌無(wú)法生存，導(dǎo)致硫酸鹽功能菌的記數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確，不能真實(shí)的反映生產(chǎn)實(shí)際情況，檢測(cè)結(jié)果無(wú)意義，同時(shí)檢測(cè)費(fèi)用較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有的油田水質(zhì)SRB菌檢測(cè)周期長(zhǎng)、不能真實(shí)全面的反應(yīng)水中的SRB菌的數(shù)量、不能即時(shí)的指導(dǎo)生產(chǎn)、檢測(cè)費(fèi)用較高的問題，而提供一種用于定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的引物及熒光探針。用于定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的引物上游引物5’-TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT-3’，下游引物5’-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3’。用于定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的熒光探針為FAM5’-CAACGAGCGCAACC-3’MGB；Tag Man-MGB探針的5’端標(biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM，3’端標(biāo)記的淬滅熒光基團(tuán)為TAMRA-MGB。本發(fā)明采用Tag Man-MGB探針，通過收集具有硫酸鹽鹽還原功能菌株的16SrDNA基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)保守的特意性引物和一條特意的MGB探針，能夠準(zhǔn)確的診斷，記數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確、有效的縮短計(jì)數(shù)時(shí)間，從樣本DNA提取到熒光定量PCR最后獲得檢測(cè)結(jié)果僅僅需要6個(gè)小時(shí)、能真實(shí)的反映生產(chǎn)實(shí)際情況，減少檢測(cè)成本。


圖1是具體實(shí)施方式
三中以pGEM-T-SRB為底物的擴(kuò)增曲線，其中①為1.496×107、②為1.496×106、③為1.496×105、④為1.496×104、⑤為1.496×103、⑥為1.496×102、⑦為水對(duì)照；圖2是具體實(shí)施方式
三中硫酸鹽還原菌熒光定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式中用于定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的引物上游引物5’-TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT-3’，下游引物5’-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3’。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式中用于定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的熒光探針為FAM5’-CAACGAGCGCAACC-3’MGB；Tag Man-MGB探針的5’端標(biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM，3’端標(biāo)記的淬滅熒光基團(tuán)為TAMRA-MGB。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式具體說(shuō)明本發(fā)明是如何實(shí)施的，本實(shí)施方式通過以下步驟實(shí)現(xiàn)一、設(shè)計(jì)引物和探針采用Tag Man-MGB探針，通過收集具有硫酸鹽鹽還原功能菌株的16SrDNA基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)保守的特意性引物和一條特意的MGB探針。
上游引物(Forward Primer)為5’-TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT-3’；下游引物(Reverse Primer)為5’-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3’熒光探針為FAM5’-CAACGAGCGCAACC-3’MGB；熒光定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的探針(Tag Man-MGB探針)的5’端標(biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記的淬滅熒光基團(tuán)TAMRA-MGB。
引物和探針由生物工程公司完成。
二、操作方法A、核酸DNA的提取1)將1mL污泥震蕩5min，然后3000轉(zhuǎn)離心，留上清液；2)加入2倍體積的10×PBS進(jìn)行洗滌，震蕩5min，然后12000轉(zhuǎn)離心5min，去掉上清液；3)加入10×PBS緩沖液100μl，然后超聲40s；4)用華舜DNA小量細(xì)菌提取試劑盒進(jìn)行后續(xù)的DNA提取。
B、real time PCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備1、對(duì)上一步中提取出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增建立PCR反應(yīng)體系(20μl)模板(上一步中提取出的DNA)20ng，TagDNA聚合酶(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)0.3U，4種dNTP各0.3mmol/L，上游引物(Forward Primer)和下游引物(Reverse Primer)各0.1μmol/L；PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)熱5min，94℃變性30s，58℃復(fù)性45s，72℃延伸90s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物用1.0％的瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)。
2、連接、轉(zhuǎn)化、菌落PCR檢測(cè)PCR產(chǎn)物用用膠回收試劑盒(寶泰克)切膠回收，后與pGEM-T(Promega)載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞(天為時(shí)代)。LB固體培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素Amp(5μg/mL)和X-gal，藍(lán)白斑篩選轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒(華舜)，用載體引物T7和SP6檢測(cè)，測(cè)序由上海生物工程有限公司完成，獲得序列長(zhǎng)度為130bp。
＞SRB165’-TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCCTTTAGTTGCCATCAGTTCGGCTGGGCACTCTAAAGGGACTGCCGGTGTCAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGT-3’。
3、pGEM-T-SRB的濃度測(cè)定采用美國(guó)采用MJ公司生產(chǎn)的MJResearch Opticon TM 2實(shí)時(shí)熒光系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR。
提取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒(含目的片斷的質(zhì)粒)pGEM-T-SRB，測(cè)定其濃度并換算為拷貝數(shù)。
換算成拷貝數(shù)，然后做10×稀釋。分別以稀釋后的質(zhì)粒溶液為模板，以FP、RP為引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)。
計(jì)算結(jié)果為1.496×107copies·μl-1，然后做10×稀釋。圖1為以-pGEM-T-SRB為底物的擴(kuò)增曲線，從左到右的7條曲線依次為1.496×107、1.496×106、1.496×105、1.496×104、1.496×103、1.496×102copies·μl-1、水對(duì)照。在實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的40個(gè)循環(huán)結(jié)束后，計(jì)算機(jī)利用分析軟件Opticon Monitor2.02根據(jù)輸入的模板量和產(chǎn)生的熒光信號(hào)，計(jì)算出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2y＝-0.32x+10.67，相關(guān)系數(shù)為r2＝1.000。結(jié)果表明，至少在1.496×100～1.496×107拷貝范圍之內(nèi)，樣品拷貝數(shù)與其相應(yīng)的CT值具有良好的相關(guān)性。因此，本實(shí)驗(yàn)可對(duì)1.496×100～1.496×107拷貝范圍之內(nèi)的模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
三、檢測(cè)1、將1mL待測(cè)樣注入離心管中后，在超聲儀中震蕩5min，然后在3000rpm/min離心機(jī)中離心2min，取上清液；向上清液中加入2倍體積的10×PBS進(jìn)行洗滌，在超聲儀中震蕩5min，然后在12000rpm/min的離心機(jī)中離心5min，去掉上清液；向離心管中加入100μl的10×PBS緩沖液，在超聲儀中震蕩5min；用華舜DNA小量細(xì)菌提取試劑盒提取DNA，得到待測(cè)樣的DNA；2、對(duì)待測(cè)樣的DNA進(jìn)行熒光RT-PCR測(cè)定建立RT-PCR反應(yīng)體系(25μL)5×real time buffer 5.0μL，dNTP(10mmol/L)0.75μL，Mg2+(250mmol/L)0.5μL，上游引物(Forward Primer)和下游引物(Reverse Primer)(10mmol/L)各0.5μL，熒光探針(5mmol/L)0.6μL，Taq DNA酶(5U/μL)0.3μL，待測(cè)樣的DNA 2μL，去離子水15.4μL；real time PCR反應(yīng)參數(shù)95℃預(yù)變性5min，94℃變性5s，60℃退火溫度30s，72℃延伸45s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸2min。溫度轉(zhuǎn)換率為20℃/s，在每個(gè)循環(huán)的60℃時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。
3、檢測(cè)結(jié)果的判定與標(biāo)準(zhǔn)樣比較，陽(yáng)性對(duì)照中CT值應(yīng)當(dāng)小于28，陽(yáng)性樣品中擴(kuò)增曲線明顯；陰性對(duì)CT值照應(yīng)該大于35，陰性對(duì)照中無(wú)擴(kuò)增曲線。不同模板具有不同的數(shù)量的目標(biāo)片斷，在定量檢測(cè)的熒光定量的曲線，就會(huì)有相應(yīng)的CT值，通過系統(tǒng)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，系統(tǒng)會(huì)根據(jù)CT值最后給出模板中目標(biāo)片段的數(shù)量，即硫酸鹽還原功能菌的數(shù)量。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式取15個(gè)待測(cè)樣本進(jìn)行了熒光RT-PCR檢測(cè)，提取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒(含目的片斷的質(zhì)粒)-pGEM-T-ADNB，分別以稀釋后的質(zhì)粒溶液為模板，以FP、RP為引物，和被檢測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，各樣品的初始拷貝數(shù)由分析軟件Opticon Monitor 2.02根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本的CT值自動(dòng)計(jì)算得出，檢測(cè)的15個(gè)樣本的結(jié)果見表1，其中設(shè)置水對(duì)照和純菌(大腸桿菌)，同時(shí)用絕跡稀釋法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果14個(gè)待測(cè)樣本中檢測(cè)到硫酸鹽功能細(xì)菌，檢測(cè)結(jié)果同常規(guī)檢測(cè)方法絕跡稀釋法(mostprobable number，MPN)-Griess法的檢測(cè)結(jié)果完全吻合，但從檢測(cè)的精度上看，要比常規(guī)的絕跡稀釋法提高兩個(gè)數(shù)量級(jí)。
表1 檢測(cè)樣品CT值與拷貝數(shù)(細(xì)菌數(shù))和絕跡稀釋法

序列表<110>哈爾濱工業(yè)大學(xué)<120>用于定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的引物及熒光探針<160>4<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于檢測(cè)硫酸鹽功能菌的上游引物。
<400>1tcagctcgtg tcgtgagatg tt 22<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于檢測(cè)硫酸鹽功能菌的下游引物。
<400>2acgtcatccc caccttcctc 20<210>3<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測(cè)硫酸鹽功能菌的探針基因序列。
<400>3
caacgagcgc aacc 14<210>4<211>130<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>陽(yáng)性質(zhì)粒中插入的基因序列。
<400>4tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgcctttag 60ttgccatcag ttcggctggg cactctaaag ggactgccgg tgtcaaaccg gaggaaggtg 120gggatgacgt130
權(quán)利要求
1.用于定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的引物，其特征在于用于定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的引物上游引物5’-TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT-3’，下游引物5’-ACGTCATCCCCACCTTCCTC-3’。
2.用于定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的熒光探針，其特征在于用于定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的熒光探針為FAM5’-CAACGAGCGCAACC-3’MGB；熒光定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的探針的5’端標(biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM，3’端標(biāo)記的淬滅熒光基團(tuán)為TAMRA-MGB。
全文摘要
用于定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的引物及熒光探針，本發(fā)明涉及用于硫酸鹽功能菌定量檢測(cè)的引物及探針。它為解決現(xiàn)有油田水質(zhì)SRB菌檢測(cè)周期長(zhǎng)、不能真實(shí)全面反映水中SRB菌的數(shù)量、不能即時(shí)指導(dǎo)生產(chǎn)、檢測(cè)費(fèi)用較高的問題。用于定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的引物上游引物5′－TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT－3′，下游引物5′－ACGTCATCCCCACCTTCCTC－3′。用于定量檢測(cè)硫酸鹽功能菌的熒光探針為FAM5′－CAACGAGCGCAACC－3′MGB；Tag Man－MGB探針的5′端標(biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM，3′端標(biāo)記的淬滅熒光基團(tuán)為TAMRA－MGB。本發(fā)明能夠準(zhǔn)確的診斷，記數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確、有效的縮短計(jì)數(shù)時(shí)間，從樣本DNA提取到熒光定量PCR最后獲得檢測(cè)結(jié)果僅僅需要6個(gè)小時(shí)，有效的縮短了檢測(cè)的周期，能真實(shí)的反映生產(chǎn)實(shí)際情況，降低檢測(cè)成本。
文檔編號(hào)G01N33/52GK101086022SQ20071007233
公開日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2007年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日
發(fā)明者馬放, 魏利, 李維國(guó) 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)