專利名稱：犬、貓科動物重要疫病病原膠體金銀聯(lián)合檢測試紙及其制備技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種犬、貓科動物重要疫病病原膠體金銀聯(lián)合檢測試紙及其制備方法，用于犬、貓科動物狂犬病、犬瘟熱、貓瘟熱和犬細小病毒病等重要疫病的快速檢測、診斷，屬于動物疫病檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
犬狂犬病、犬瘟熱、貓瘟熱和犬細小病毒病等犬、貓科動物重要疫病不僅嚴重危害我國毛皮經(jīng)濟動物產(chǎn)業(yè)，而且嚴重威脅著虎、獅、狼等多種珍希野生動物的健康，有的還可導(dǎo)致人的發(fā)病死亡。要從根本上控制這些疫病，首要的是對上述疫病的發(fā)生、流行作出及時、準確的監(jiān)測。對于犬貓科動物重要疫病，目前國際上常用的病原檢測方法有病毒分離、電鏡觀察、PCR或RT-PCR等方法，但這些方法都需要一定的儀器設(shè)備和較高的操作技術(shù)，影響了其在流行病學(xué)監(jiān)測方面的應(yīng)用。
膠體金是近年來發(fā)展起來的一種檢測技術(shù)，由Faulk和Taylor(1971)首先用于免疫電鏡，現(xiàn)在成了熒光素、放射性同位素和酶標記以外的一大補充。膠體金試紙是利用抗原抗體反應(yīng)及免疫層析原理，將抗原或抗體以膠體金標記，當(dāng)待檢樣品中含有與抗原或抗體特異結(jié)合的抗體或抗原時，就會發(fā)生聚集而產(chǎn)生肉眼可見的色帶，具有簡便、快速，結(jié)果直觀、準確等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種犬、貓科動物重要疫病病原膠體金銀聯(lián)合檢測試紙，能夠簡便、快速、準確地對犬、貓科動物體內(nèi)含有的狂犬病病毒(RV)、犬瘟熱病毒(CDV)、貓瘟熱病毒(FPV)和犬細小病毒(CPV)等病原作出檢測。
本發(fā)明還公開了上述檢測試紙的制備工藝，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的解決方案是根據(jù)抗原抗體能特異結(jié)合的免疫學(xué)基本原理，利用膠體金免疫層析技術(shù)和銀染加強技術(shù)，將膠體金標記的鼠源RV、CDV、FPV和CPV等單抗混合包被在玻璃纖維素膜上，制成結(jié)合墊；分別將純化的犬抗RV、CDV、FPV和CPV等的IgG包被在硝酸纖維素膜(NC)的檢測線R、D、F、P處，將兔抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜的質(zhì)控線C處，制成檢測膜；當(dāng)被檢樣品中含有相應(yīng)病毒時，可先與相應(yīng)金標鼠源單抗結(jié)合，然后在層析作用下與相應(yīng)檢測線上的二抗結(jié)合并富集，再經(jīng)銀染液加強染色后形成肉眼可見的色帶，進而根據(jù)顯色結(jié)果進行判定。
本發(fā)明的具體制備工藝如下是按附圖1所示位置分別將相應(yīng)試劑與材料噴點或包被于玻璃纖維素膜和硝酸纖維素膜，組成犬、貓科動物重要疫病病原聯(lián)合檢測試紙。將由玻璃纖維素膜制成的樣品墊置于加樣孔下；樣品墊連接由玻璃纖維素膜制成的結(jié)合墊，結(jié)合墊上包被有膠體金標記的鼠源抗RV、CDV、FPV和CPV等單克隆抗體；結(jié)合墊后連接由NC膜制成的檢測膜，檢測膜上可有根據(jù)需要設(shè)置多條檢測線和1條質(zhì)控線，其中檢測線R、D、F、P等分別為純化的犬抗RV、CDV、FPV和CPV等IgG包被而成，質(zhì)控線(C)為兔抗鼠二抗；檢測膜后面連接有吸收墊；最后再按金標層析試紙制備要求，進行粘連、壓制和裁切，制成該抗體聯(lián)合檢測試紙。
本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比較具有如下優(yōu)點檢測試紙簡便、適用、快速、經(jīng)濟、無污染、易操作和判讀，不需要借助其它儀器設(shè)備，并可同時對多種犬、貓科動物重要疫病病原進行檢測，特別適用于現(xiàn)場檢測和流行病學(xué)調(diào)查等。本發(fā)明的制備方法科學(xué)、成本低、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，易于制造、保存和運輸。


圖1是本發(fā)明檢測試紙的結(jié)構(gòu)示意圖圖2是本發(fā)明檢測試紙剖面圖。
1-塑料夾、2-加樣孔、3-觀察孔、4-樣品墊、5-結(jié)合墊(由玻璃纖維素膜制成，上包被有金標RV、CDV、FPV和CPV等鼠源單抗)、6-檢測膜(由硝酸纖維素膜制成，上噴點有多條檢測線和1條質(zhì)控線，其中R、D、F、P等為檢測線，分別包被有純化犬抗RV、CDV、FPV和CPV等IgG；C為質(zhì)控線，包被有兔抗鼠二抗)、7-吸收墊、8-襯板。
具體實施例方式
通過以下實施例進一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實現(xiàn)的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
實施例1根據(jù)圖1所示，本發(fā)明檢測試紙結(jié)構(gòu)如下襯板8封套在塑料夾1內(nèi)，塑料夾1的表面開設(shè)有加樣孔2和觀察孔3，襯板8的表面上組裝有經(jīng)過處理的樣品墊4、結(jié)合墊5、檢測膜6和吸收墊7。其中，結(jié)合墊5由玻璃纖維素膜制成，上包被有金標RV、CDV、FPV和CPV等鼠源單抗；檢測膜6由硝酸纖維素膜制成，上噴點有多條檢測線和1條質(zhì)控線，R、D、F、P等為檢測線，分別包被有純化犬抗RV、CDV、FPV和CPV等IgG；C為質(zhì)控線，包被有兔抗鼠二抗；檢測膜與吸收墊7連接。
實施例21)RV、CDV、FPV與CPV等病原單抗和多抗IgG的制備分別用RV、CDV、FPV與CPV等病原接種各自敏感細胞，培養(yǎng)增殖各病毒，經(jīng)濃縮提純后分別免疫Balb/c小鼠和家犬，制備各病毒的單抗和多抗血清，并以此進一步制備其單抗與多抗IgG，于-30℃保存?zhèn)溆谩?br> 2)RV、CDV、FPV與CPV等病原固相免疫吸附載體的制備應(yīng)用所制備的RV、CDV、FPV與CPV等病原多抗IgG包被磁珠、乳膠顆粒等固相載體，分別制備上述病原的高效免疫吸附載體，并按適當(dāng)比例混合，制成聯(lián)合病原固相免疫吸附載體，加入防腐劑，于4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ跇悠非疤幚頃r，取待檢樣品3-5ml，加入適量固相免疫吸附載體，室溫作用20-30分鐘，離心或置于磁珠架沉淀磁珠，棄去上清，于所留免疫吸附載體中加50-100ml抗原抗體解離液用于檢測。
3)金標RV、CDV、FPV與CPV單抗IgG的制備采用膠體金蛋白標記技術(shù)，分別用膠體金標記所制備的RV、CDV、FPV與CPV單抗IgG，制得上述病毒的金標IgG，按一定比例混合，制成抗原捕捉劑，加防腐劑，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4)兔抗鼠IgG制備以Balb/c小鼠IgG免疫家兔制備兔抗鼠血清，并從中提取IgG，制備兔抗鼠IgG，加防腐劑，于-30℃保存?zhèn)溆谩?br> 5)結(jié)合墊制備將所制金標抗原捕捉劑噴涂于玻璃纖維素膜上，制成反應(yīng)膜。4℃干燥保存?zhèn)溆谩?br> 6)檢測膜制備將所制備的RV、CDV、FPV與CPV多抗IgG和兔抗鼠IgG，分別噴點于硝酸纖維素膜(NC)的檢測線R、D、F、P處和質(zhì)控線C處，制成檢測膜。4℃干燥保存?zhèn)溆谩?br> 7)檢測試紙組裝按膠體金層析檢測試紙制備要求，如圖將上述所制備和選購的材料進行粘連、壓制和裁切成檢測試紙條，裝入塑料夾內(nèi)制成的檢測卡，加干燥劑并分裝、封閉于的塑料小袋，4℃干燥保存。
8)銀加強法相應(yīng)試劑的配制活化液的配制以去離子水配制0.05mol/L、PH3.8的檸檬酸鹽緩沖液。
銀染液的配制將乙酸銀、對苯二酚、阿拉伯樹膠溶于去離子水中，使其終濃度分別為0.11％、0.35％-1.7％和7％-10％。
定影液的配制20％的硫代硫酸鈉水溶液。
權(quán)利要求
1.一種犬、貓科動物重要疫病抗原膠體金銀聯(lián)合檢測測試紙，其特征在于襯板8封套在塑料夾1內(nèi)，塑料夾1的表面開設(shè)有加樣孔2和觀察孔3，襯板8的表面上組裝有經(jīng)過處理的樣品墊4、結(jié)合墊5、檢測膜6和吸收墊7。其中，結(jié)合墊5由玻璃纖維素膜制成，上包被有金標RV、CDV、FPV和CPV等鼠源單抗；檢測膜6由硝酸纖維素膜制成，上噴點有多條檢測線和1條質(zhì)控線，R、D、F、P等為檢測線，分別包被有純化犬抗RV、CDV、FPV和CPV等IgG；C為質(zhì)控線，包被有兔抗鼠二抗；檢測膜與吸收墊7連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測試紙的制備方法，包括下述步驟1)RV、CDV、FPV與CPV等病原單抗和多抗IgG的制備分別用RV、CDV、FPV與CPV等病原接種各自敏感細胞，培養(yǎng)增殖各病毒，經(jīng)濃縮提純后分別免疫Balb/c小鼠和家犬，制備各病毒的單抗和多抗血清，并以此進一步制備其單抗與多抗IgG，于-30℃保存?zhèn)溆茫?)RV、CDV、FPV與CPV等病原固相免疫吸附載體的制備應(yīng)用所制備的RV、CDV、FPV與CPV等病原多抗IgG包被磁珠、乳膠顆粒等固相載體，分別制備上述病原的高效免疫吸附載體，并按適當(dāng)比例混合，制成聯(lián)合病原固相免疫吸附載體，加入防腐劑，于4℃保存?zhèn)溆?；在樣品前處理時，取待檢樣品3-5ml，加入適量固相免疫吸附載體，室溫作用20-30分鐘，離心或置于磁珠架沉淀磁珠，棄去上清，于所留免疫吸附載體中加50-100ml抗原抗體解離液用于檢測；3)金標RV、CDV、FPV與CPV單抗IgG的制備采用膠體金蛋白標記技術(shù)，分別用膠體金標記所制備的RV、CDV、FPV與CPV單抗IgG，制得上述病毒的金標IgG，制成抗原捕捉劑，加防腐劑，于4℃保存?zhèn)溆茫?)兔抗鼠IgG制備以Balb/c小鼠IgG免疫家兔制備兔抗鼠血清，并從中提取IgG，制備兔抗鼠IgG，加防腐劑，于-30℃保存?zhèn)溆茫?)結(jié)合墊制備將所制金標抗原捕捉劑噴涂于玻璃纖維素膜上，制成反應(yīng)膜，干燥保存?zhèn)溆茫?)檢測膜制備將所制備的RV、CDV、FPV與CPV多抗IgG和兔抗鼠IgG，分別噴點于硝酸纖維素膜(NC)的檢測線R、D、F、P處和質(zhì)控線C處，制成檢測膜，干燥保存?zhèn)溆茫?)檢測試紙組裝按膠體金層析檢測試紙制備要求，如圖將上述所制備和選購的材料進行粘連、壓制和裁切成檢測試紙條，裝入塑料夾內(nèi)制成的檢測卡，加干燥劑并分裝、封閉于的塑料小袋，干燥保存；8)銀加強法相應(yīng)試劑的配制活化液的配制以去離子水配制0.05mol/L、PH3.8的檸檬酸鹽緩沖液；銀染液的配制將乙酸銀、對苯二酚、阿拉伯樹膠溶于去離子水中，使其終濃度分別為0.11％、0.35％-1.7％和7％-10％；定影液的配制20％的硫代硫酸鈉水溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種犬、貓科動物重要疫病病原膠體金銀聯(lián)合檢測試紙及其制備方法，將膠體金標記的鼠源RV、CDV、FPV和CPV等單抗混合包被在玻璃纖維素膜上，制成結(jié)合墊；分別將純化的犬抗RV、CDV、FPV和CPV等的IgG包被在硝酸纖維素膜(NC)的檢測線R、D、F、P處，將兔抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜的質(zhì)控線C處，制成檢測膜；當(dāng)被檢樣品中含有相應(yīng)病毒時，可先與相應(yīng)金標鼠源單抗結(jié)合，然后在層析作用下與相應(yīng)檢測線上的二抗結(jié)合并富集，再經(jīng)銀染液加強染色后形成肉眼可見的色帶，進而根據(jù)顯色結(jié)果進行判定。本發(fā)明不需要借助其它儀器設(shè)備，并可同時對多種犬貓科動物重要疫病抗體進行檢測，特別適用于現(xiàn)場檢測和流行病學(xué)調(diào)查。
文檔編號G01N33/569GK101074959SQ200710055759
公開日2007年11月21日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者夏咸柱, 楊松濤, 黃耕, 王承宇, 高玉偉, 王鐵成, 侯小強, 高明華, 蘇建青 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所