專利名稱：拉米夫定用藥評估試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測個體對拉米夫定藥物敏感性的試 劑盒。
背景技術(shù)：
乙型病毒性肝炎(簡稱乙型肝炎)是由乙型肝炎病毒(簡稱乙肝病毒)引起的肝臟炎性損害，是我國 當(dāng)前流行最廣泛、危害最嚴(yán)重的一種傳染病。臨床表現(xiàn)為乏力、食欲減退、惡心、嘔吐、厭油、腹瀉及齒 脹，部分病例有發(fā)熱、黃疸,約有半數(shù)患者起病隱匿。大部分乙型肝炎在急性期經(jīng)治后能痊愈，很多病例 病程遷延或轉(zhuǎn)為慢性，其中一部分可發(fā)展為肝炎后肝硬變甚至肝癌；極少數(shù)病例病程發(fā)展迅猛，肝細(xì)胞出 現(xiàn)大片壞死，成為重型肝炎；另有一些感染者則成為無癥狀的病毒攜帶者。
乙肝病毒是己知最小的部分雙鏈的環(huán)形DNA病毒，長3.2kb,有高度重疊的4個基因區(qū)，編碼至少8 種蛋白。即S基因編碼的大、中、小HBs; C基因的前C、 HBc、 HBe; P基因的聚合酶和X基因的HBx。乙 肝病毒有高復(fù)制率和高突變率，高突變是由于基因組復(fù)制，需先轉(zhuǎn)錄為RNA中間體，但聚合酶缺乏校正功 能所致。乙肝病毒這種高突變性造成乙肝病毒在診斷和治療是產(chǎn)生種種困難。
拉米夫定(Lamivudine, LAM，商品名為賀普丁))是當(dāng)前乙肝病毒治療廣泛應(yīng)用的核苷類似物，它能 顯著降低乙肝病毒DNA水平，并可使ALT正常化和肝組織改善。其作用機(jī)理是抑制乙肝病毒的逆轉(zhuǎn)錄和復(fù) 制。
但在拉米夫定長期治療中，乙肝病毒發(fā)生變異，產(chǎn)生耐藥。其機(jī)理是拉米夫定作用位點(diǎn)YMDD發(fā)生突 變。YMDD變異包括第552位蛋基酸(M),被纈氨酸(V)或異亮氨酸(I)所取代，即M552V與M552I (即 rtM204VI變異)，兩者可單獨(dú)存在或混合存在，也可伴第528位亮氨酸(L)被蛋氨酸(M)所取代的變異， 即L528M (即rtL180M)變異。野生株YMDD部位呈緩和口袋型，有利于核苷酸和拉米夫定結(jié)合，552位點(diǎn) 的變異使側(cè)鏈變短，柔性降低，并在HBV聚合酶和拉米夫定三磷酸鹽之間形成空間位阻，導(dǎo)致與拉米夫定 三磷酸鹽的結(jié)合力下降，從而不可繼續(xù)合成HBV DNA。
YMDD變異后，拉米夫定結(jié)合靶點(diǎn)失去了 YMDD的正?；?，對該藥結(jié)合的敏感性大大降低，使拉米夫 定對HBV前基因RNA逆轉(zhuǎn)錄及負(fù)鏈DNA復(fù)制為正鏈DNA的酶促過程不能抑制，從而造成耐藥。迅速及時的 檢測乙肝病毒的YMDD突變，特別是能檢測少量YMDD突變，可以幫助醫(yī)生及時改變用藥，防止拉米呋啶出 現(xiàn)嚴(yán)重的耐藥性，減少由YMDD突變株引起的癥狀惡化。同時，還能避免拉米夫定可能對患者造成的毒副 作用。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)國家生物基因檢測技術(shù)應(yīng)用評估認(rèn)證中心頒布的《中國人口健康服務(wù)基因位點(diǎn)認(rèn)證規(guī)程》，對與 拉米夫定藥物敏感性相關(guān)基因位點(diǎn)的支持文獻(xiàn)、分子生物學(xué)機(jī)理研究、中國人群適用性等進(jìn)行綜合分析評 估后，確定檢測病人體內(nèi)乙肝病毒DNA的YMDD區(qū)域基因型可用于評估被檢者對拉米夫定藥物敏感性。
基于檢測病人體內(nèi)乙肝病毒DNA的YMDD區(qū)域基因型可用于評估被檢者對拉米夫定藥物敏感性的基礎(chǔ) 上，本發(fā)明提供一種檢測個體對拉米夫定藥物敏感性的試劑盒。
該試劑盒包括
檢測病人體內(nèi)乙肝病毒DNA的YMDD區(qū)域基因型的特異性引物對及DNA測序引物； PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCL溶液、反應(yīng)緩沖液、去離子水等)； PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、Exo I酶、去離子水等);
DNA測序反應(yīng)組件(包括BigDye mix, EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、去離子 水等)。
本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對病人體內(nèi)乙肝病毒DNA的YMDD區(qū)域基因型，能特異性擴(kuò)增 出包含YMDD區(qū)域的DNA片段的引物對。設(shè)計這類引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。特異性引物
對可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。
本試劑盒中所述的DNA測序引物是指針對病人體內(nèi)乙肝病毒DNA的YMDD區(qū)域而設(shè)計，能通過DNA測 序技術(shù)特異性檢測出YMDD區(qū)域基因型的DNA測序引物。設(shè)計這類引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。 DNA測序引物可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。
本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括-
1. PCR反應(yīng)套裝
10X PCR反應(yīng)緩沖液2.5u1,
25mM dNTP混合液0.2u1，
25mM MgCh溶液1. 5u1，
5units/(il T叫DNA聚合酶0. 125u1，
20nM特異性引物對毎條引物各0.25h1,
去離子水19. 175nl。
2. PCR產(chǎn)物純化套裝 lunits/Vl SAP酶0.75u1， lOunits/nl Exol酶0. 375pl， 去離子水3.875nl。
3. 測序反應(yīng)套裝 25% BigDye mix
3. 2nM DNA測序引物lpl， 125mM EDTA溶液1u1， 100%乙醇溶液15nl， 70%乙醇溶液30nl, HIDI溶液8u1， 去離子水2nl。
本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-2(TC。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。
實(shí)施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取
用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。
步驟2: PCR擴(kuò)增反應(yīng) 使用檢測試劑盒中的PCR反應(yīng)套裝。
反應(yīng)的體系為總體積25nl,包含濃度為12.5ng/nl的DNA模板lpl、10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5u1，25mM dNTP混合液0.2u1， 25mMMgC12溶液1.5u1, 5units/pl Taq DNA聚合酶0.125u1, 20nM特異性引物對每 條引物各0,25nl，去離子水19.175nl。
在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為94°C 、 12分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)的94°C 、 30秒，60 。C、 30秒，72°C、 30秒，然后進(jìn)行72。C、 IO分鐘。
步驟3: PCR產(chǎn)物純化
使用檢測試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化套裝，反應(yīng)體系為總體積25nl，包含PCR產(chǎn)物20jal， lunits/pl SAP 酶0.75u1, 10units/nl Exol酶0. 375|n，去離子水3.875u1。
在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37。C、 15分鐘，72°C、 20分鐘。 步驟4: DNA測序反應(yīng)
使用檢測試劑盒中的測序反應(yīng)套裝，反應(yīng)的體系為總體積5pl，包含PCR純化產(chǎn)物1^1,25% BigDye mix lpl， 3.2nMDNA測序引物lpl，去離子水2fi1。
在ABI2720型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98'C 、2分鐘，進(jìn)行25個循環(huán)的％°C 、30秒，55°C 、 30秒,60°C、 4分鐘。
反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液lpl和100%乙醇溶液15pl，于室溫下沉淀15分鐘；在4°C以3650 轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30pl，以3650轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心15分鐘， 輕輕倒去上清液；室溫放置20分鐘后加入HIDI溶液8pl，放入測序儀中。
步驟5:基因型分析
熟悉DNA測序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點(diǎn)的基因型。
實(shí)施例2.對病人進(jìn)行拉米夫定藥物敏感性評估的服務(wù) 步驟l: DNA提取
由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)病人使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮細(xì) 胞的DNA抽提。
步驟2:基因分型檢測
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對病人體內(nèi)乙肝病毒DNA的YMDD區(qū)域進(jìn)行DNA測序檢測，確定YMDD區(qū)域 的基因型。
步驟3:個體拉米夫定藥物敏感性的評估分析
通過對病人乙肝病毒DNA的YMDD區(qū)域基因型的分析，出具個體拉米夫定藥物敏感性的評估分析報告 單。報告中詳細(xì)說明了病人對拉米夫定藥物的敏感性，可供醫(yī)師參考調(diào)整病人的用藥方式和劑量。
權(quán)利要求
1.一種檢測個體對拉米夫定藥物敏感性的試劑盒，其特征在于包括檢測病人體內(nèi)乙肝病毒DNA的YMDD區(qū)域基因型的特異性引物對及DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、SAP酶、Exo I酶、BigDye mix，EDTA溶液、70％乙醇溶液、100％乙醇溶液、HIDI溶液、去離子水等。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對是指針對病人體內(nèi)乙肝病毒DNA 的YMDD區(qū)域基因型，能特異性擴(kuò)增出包含YMDD區(qū)域的DNA片段的引物對。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的DNA測序引物是指針對病人體內(nèi)乙肝病毒DNA 的YMDD區(qū)域而設(shè)計，能通過DNA測序技術(shù)特異性檢測出YMDD區(qū)域基因型的DNA測序引物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括1) PCR反應(yīng)套裝:10X PCR反應(yīng)緩沖液2. 5W， 25mM dNTP混合液0.2(4， 25mM MgC12溶液1.5W， 5unitsM Taq DNA聚合酶0. 125W， 20PM特異性引物對每條引物各0.25W，去離子水19. 175W。2) PCR產(chǎn)物純化套裝:lunits/WSAP酶0. 75W， 10units/rt Exol酶0. 375W,去離子水3. 875W。3) 測序反應(yīng)套裝25% BigDye mix 1W， 3. 2PM DNA測序引物11^1， 125rnM EDTA溶液1W， 100%乙 醇溶液70%乙醇溶液30W， HIDI溶液8W，去離子水2W。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-2(TC。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測個體對拉米夫定藥物敏感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測病人體內(nèi)乙肝病毒DNA的YMDD區(qū)域基因型的特異性引物對及DNA測序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測序反應(yīng)組件等。通過檢測病人體內(nèi)乙肝病毒DNA的YMDD區(qū)域基因型，來分析評估病人對拉米夫定藥物的敏感性。
文檔編號G01N33/50GK101363840SQ200710044699
公開日2009年2月11日 申請日期2007年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月9日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司