專(zhuān)利名稱(chēng)：一種種子活力快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及種子檢測(cè)技術(shù)，特別涉及一種種子活力快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
種子活力是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，高活力種子具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和生產(chǎn)潛力。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，種子活力測(cè)定是保證田間出苗率和生產(chǎn)潛力的必要手段，是保障農(nóng)業(yè)豐產(chǎn)豐收的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
傳統(tǒng)種子活力檢測(cè)主要是測(cè)量發(fā)芽率(亦稱(chēng)發(fā)芽勢(shì))，如高滲發(fā)芽法，或檢測(cè)種子的抗逆性，如冷凍發(fā)芽法。高滲發(fā)芽法的原理是種子在高滲溶液中的發(fā)芽能力與其活力呈顯著正相關(guān)，據(jù)此來(lái)檢測(cè)種子活力。冷凍發(fā)芽法能夠較準(zhǔn)確的反映出種子活力和田間表現(xiàn)，但對(duì)于休眠的種子不能檢測(cè)其潛在的活性；同時(shí)這兩種方法都存在耗時(shí)費(fèi)力的缺陷，如用高滲發(fā)芽法測(cè)量種子活力需要7天左右的時(shí)間。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的同功酶譜分析法以及種子還原力分析法，雖然能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出包括休眠種子的活性，但是這兩種方法都需要破壞種子。同期出現(xiàn)的電導(dǎo)率分析法和X射線(xiàn)自顯影技術(shù)，雖然能夠快速無(wú)損的檢測(cè)種子活力，但是由于檢測(cè)指標(biāo)單一，也不能很好的反映種子活力。
專(zhuān)利號(hào)為00117133.X的發(fā)明專(zhuān)利“水稻種子的鑒定方法”中公開(kāi)了一種通過(guò)測(cè)量水稻種子吸水后的超微弱發(fā)光強(qiáng)度來(lái)鑒定水稻種子的新與舊、真與偽的方法。但這種鑒定水稻種子的測(cè)量時(shí)間較長(zhǎng)，所需時(shí)間約1小時(shí)左右；而且測(cè)量的是水稻種子吸水后所發(fā)出的超微弱光，這種超微弱光的發(fā)光機(jī)制本身就很不清楚，是否與水稻種子活力有關(guān)還有待研究。另外，由于種子含水量的不同會(huì)很大程度上影響這種超微弱發(fā)光，因此這種方法從原理上講測(cè)量準(zhǔn)確性較差、靈敏度也較低、容易造成假象。同時(shí)這種方法只是針對(duì)水稻這種單一品種，應(yīng)用范圍極其有限，不能推廣應(yīng)用到其它種子活力的檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)，提供一種測(cè)量需要樣品量少、適用范圍廣、無(wú)損、快速、簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確的種子活力的檢測(cè)方法。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種種子活力快速檢測(cè)方法，其特征在于同一溫度及黑暗條件下，測(cè)量待測(cè)種子吸脹初期的種子浸出液在化學(xué)發(fā)光探針試劑介導(dǎo)下的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的平均值，比較其大小，從而實(shí)現(xiàn)待測(cè)種子活力大小的檢測(cè)。
測(cè)量種子吸脹初期的種子浸出液在化學(xué)發(fā)光試劑介導(dǎo)下化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的平均值具體可包括下述步驟(1)將待測(cè)種子用升汞溶液浸泡然后用蒸餾水或純凈水清洗。
(2)將清洗后的種子放入透光容器，置于暗箱中。
(3)用CaCl2的水溶液對(duì)所述種子浸種一段時(shí)間。
(4)然后將化學(xué)發(fā)光探針試劑加入所述種子浸泡液中，測(cè)量種子浸泡液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。
所述種子指的是具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的所有種子(例如糧食類(lèi)作物種子如玉米、水稻、大豆、經(jīng)濟(jì)類(lèi)作物種子棉花、煙草、蔬菜水果類(lèi)種子如西瓜、花卉類(lèi)種子蝴蝶蘭等)。
所述化學(xué)發(fā)光探針試劑可采用魯米諾、光澤精、海螢熒光素類(lèi)似物(CLA)或其衍生物(MCLA、FCLA)；優(yōu)選海螢熒光素類(lèi)似物或其衍生物；更優(yōu)選海螢熒光素衍生物。海螢熒光素類(lèi)似物(CLA)或其衍生物(MCLA、FCLA)只與超氧陰離子(·O2-)或者單線(xiàn)態(tài)氧(1O2)發(fā)生特異性的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，不與生物機(jī)體內(nèi)的過(guò)氧化氫(H2O2)或者羥自由基(OH)發(fā)生反應(yīng)，而且1O2產(chǎn)生的機(jī)會(huì)和量都很小，并且1O2的壽命很短。有效降低酶、1O2，·OH等干擾物質(zhì)的影響，而且海螢熒光素衍生物的化學(xué)發(fā)光效率更高。
測(cè)量種子的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度可采用自制或市售的單光子計(jì)數(shù)測(cè)量裝置，比如日本“HAMAMATSU”公司制造的單光子計(jì)數(shù)儀、美國(guó)“EG&G”公司制造的單光子計(jì)數(shù)儀。
所述步驟(1)中種子用升汞溶液浸泡，指的是用1～10‰的升汞溶液浸泡種子1～10min。
所述步驟(3)中用CaCl2的水溶液對(duì)所述種子浸種一段時(shí)間，指的是用體積為100μL～1L濃度為1～10mM的CaCl2的水溶液對(duì)所述種子浸種1～30min。
所述步驟(4)中將化學(xué)發(fā)光探針試劑加入所述種子浸泡液中，指的是加入最終濃度為100μM～10mM的化學(xué)發(fā)光探針試劑，其優(yōu)選濃度為1～2mM；此優(yōu)選濃度有較好的靈敏度，又經(jīng)濟(jì)節(jié)約。
所述步驟(4)中種子浸泡液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度測(cè)量，指的是測(cè)量30s～10min種子的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，此優(yōu)選時(shí)間段的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度特異性最明顯。
所述步驟(4)中種子浸泡液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度測(cè)量，指的是在20～32℃下測(cè)量種子化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，此優(yōu)選測(cè)量溫度下測(cè)量的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的準(zhǔn)確性較高。
本發(fā)明的原理種子細(xì)胞膜上存在著NADPH氧化酶，因?yàn)镹ADPH氧化酶能直接被鈣離子激活，催化NADPH與氧氣反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子，超氧陰離子在自發(fā)或超氧化物歧化酶的作用下歧化為過(guò)氧化氫，而過(guò)氧化氫又能激活細(xì)胞膜上的鈣離子通道，從而實(shí)現(xiàn)NADPH氧化酶活性的自循環(huán)放大，在短時(shí)間內(nèi)NADPH氧化酶就被激活。因此在含有鈣里的水溶液浸泡后的種子中，由NADPH氧化酶催化NADPH產(chǎn)生超氧陰離子并釋放到細(xì)胞外，在這個(gè)過(guò)程中這種酶能充當(dāng)NADPH的天然傳感器 而NADPH是種子活力的一個(gè)重要檢測(cè)指標(biāo)，因此超氧陰離子的含量可以作為替代還原氫N(xiāo)ADPH的一個(gè)檢測(cè)種子活力的重要指標(biāo)。因此這種反映種子的活性氧含量的化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度可作為檢測(cè)種子活力的指標(biāo)，從而實(shí)現(xiàn)種子活力的快速無(wú)損檢測(cè)。
同一品種但新舊程度不同的種子，種子活力不同，其化學(xué)發(fā)光探針試劑介導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度不同，即活力不同的同品種種子的經(jīng)有鈣離子的溶液浸泡后化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的平均值不同，依據(jù)這一特異性可判斷種子的新舊；種子愈新，活力越高，種子種還原氫和NADPH氧化酶的活性也就越高，因此由NADPH氧化酶催化產(chǎn)生的超氧陰離子的就越多，其經(jīng)鈣離子激活后化學(xué)發(fā)光探針試劑介導(dǎo)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度越大。
化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度平均值Iavr=1t∫0tptdt]]>，pt為化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(單位為計(jì)速率即cps)，t為時(shí)間。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)及有益效果1、本發(fā)明利用了吸脹初期種子在化學(xué)發(fā)光探針試劑介導(dǎo)下化學(xué)發(fā)光的明顯特異性，簡(jiǎn)便、快速、早期、定量地測(cè)定種子活力；與同樣是檢測(cè)種子內(nèi)還原氫含量來(lái)檢測(cè)種子活力的TTC檢測(cè)過(guò)程要30min左右相比，本發(fā)明檢測(cè)過(guò)程僅需30s～5min，可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。
2、本發(fā)明所使用的化學(xué)發(fā)光測(cè)定法，靈敏度很高；而且由于本方法所選用的化學(xué)發(fā)光探針試劑只發(fā)生特異性的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，所以測(cè)量的準(zhǔn)確性也很高。
3、測(cè)量種子產(chǎn)生的超氧陰離子介導(dǎo)的MCLA化學(xué)發(fā)光是用種子的浸出液，從而消除了種子中其他的發(fā)光物質(zhì)的影響；同時(shí)無(wú)需破壞種子，徹底實(shí)現(xiàn)了無(wú)損傷種子活力檢測(cè)。
4、種子含水量不同也會(huì)對(duì)超氧陰離子介導(dǎo)的MCLA化學(xué)發(fā)光有嚴(yán)重影響，本發(fā)明測(cè)量體系建立在種子的浸出液基礎(chǔ)上，從而使測(cè)量不用嚴(yán)格考察種子含水量差異，從而簡(jiǎn)化操作，并且極為精確。
5、本發(fā)明所利用的測(cè)量裝置簡(jiǎn)單，投資較少，實(shí)現(xiàn)容易，操作簡(jiǎn)便。
6、本發(fā)明種子用量極少。
7、本發(fā)明種子活力檢測(cè)適用范圍廣泛，可以檢測(cè)多種品種的種子活力。


圖1是收獲年份不同的水稻種子在以海螢熒光素衍生物MCLA為化學(xué)發(fā)光試劑介導(dǎo)下的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度比較。
圖2是收獲年份不同的玉米種子在以海螢熒光素衍生物MCLA為化學(xué)發(fā)光試劑介導(dǎo)下的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度比較。
圖3是2006年8月份收獲的大豆種子經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的高溫高濕處理后，在以海螢熒光素衍生物MCLA為化學(xué)發(fā)光試劑介導(dǎo)下的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度比較。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式和檢測(cè)種子的種類(lèi)不限于此。
實(shí)施例1首先選取所要檢測(cè)的收獲年份不同、大小一致、種皮完好的水稻種子，將這些種子分別用1‰升汞溶液浸泡2min，然后用蒸餾水清洗3次；將清洗后的完整種子置于容積為4mL的透光比色皿中，并置于暗箱中；用2mL濃度為3mM的CaCl2溶浸種10min；然后加入海螢熒光素衍生物(MCLA)并使其終濃度為1mM，再用單光子計(jì)數(shù)儀測(cè)量其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度2分鐘；測(cè)量溫度為30(±2)℃；得到圖1中收獲年份不同的水稻種子在以海螢熒光素衍生物MCLA為化學(xué)發(fā)光試劑介導(dǎo)下的化學(xué)發(fā)光平均強(qiáng)度。從圖1可知01年、02年、04年、05年和06年收獲的水稻種子，其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯不同，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而下降；06年收獲的水稻種子其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最大，01年收獲的水稻種子其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最小。
據(jù)此可知水稻種子化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與種子新舊成明顯的正相關(guān)，新收獲的水稻種子其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度高，水稻種子化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨種子貯存時(shí)間而降低；水稻種子化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的大小可以用來(lái)判定種子新舊、種子活力的大小。
實(shí)施例2首先選取所要檢測(cè)的收獲年份不同、大小一致、種皮完好的玉米種子，將這些種子分別用2‰升汞溶液浸泡3min，然后用蒸餾水清洗3次；將清洗后的完整種子置于容積為5mL的透光比色皿中，并置于暗箱中；用3mL濃度為3mM的CaCl2溶浸種10min；然后加入海螢熒光素衍生物(MCLA)并使其終濃度為1mM，再用自制的單光子計(jì)數(shù)儀測(cè)量其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度2分鐘；測(cè)量溫度為30(±2)℃；得到圖2中收獲年份不同的玉米種子在以海螢熒光素衍生物MCLA為化學(xué)發(fā)光試劑介導(dǎo)下的化學(xué)發(fā)光平均強(qiáng)度。從圖2可知01年、02年、04年、05年和06年收獲的玉米種子，其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯不同，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而下降；06年收獲的玉米種子其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最大，01年收獲的玉米種子其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最小。
據(jù)此可知玉米種子化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與種子新舊成明顯的正相關(guān)，新收獲的玉米種子其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度高，玉米種子化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨種子貯存時(shí)間而降低；玉米種子化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的大小可以用來(lái)判定種子新舊、種子活力的大小。
實(shí)施例3首先選取2006年8月收獲的大小一致、種皮完好的大豆種子，用高溫(42℃)、高濕(相對(duì)濕度為100％)處理(目的是使種子活力降低)不同時(shí)間，將處理后的種子分別用3‰升汞溶液浸泡1min，然后用蒸餾水清洗3次；將清洗后的完整種子置于容積為5mL的透光比色皿中，并置于暗箱中；用3mL濃度為3mM的CaCl2溶浸種5min；然后加入海螢熒光素衍生物(MCLA)并使其終濃度為1mM，再用自制的單光子計(jì)數(shù)儀測(cè)量其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度2分鐘；測(cè)量溫度為30(±2)℃；得到圖3中高溫高濕處理不同時(shí)間的的大豆種子在以海螢熒光素衍生物MCLA為化學(xué)發(fā)光試劑介導(dǎo)下的化學(xué)發(fā)光平均強(qiáng)度。從圖3可知同一年份收獲的大豆種子經(jīng)不同時(shí)間的高溫高濕處理后，其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯不同，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而下降；48h的高溫高濕處理，其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與未處理的相比，已下降到極顯著水平(P＜0.01)，圖中用**表示高溫高濕處理48h及48h以上后與未處理相比(高溫高濕處理0時(shí)間的)，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度下降的極顯著差異；144h的高溫高濕處理，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度幾乎完全消失。
據(jù)此可知同一年份收獲的大豆種子化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨高溫高濕處理時(shí)間而降低；大豆種子化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的大小可以用來(lái)判定高溫高濕處理后種子活力的大小。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種種子活力快速檢測(cè)方法，其特征在于同一溫度及黑暗條件下，測(cè)量待測(cè)種子吸脹初期的種子浸出液在化學(xué)發(fā)光探針試劑介導(dǎo)下的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的平均值，比較其大小，從而實(shí)現(xiàn)待測(cè)種子活力大小的檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的種子活力快速檢測(cè)方法，其特征在于測(cè)量種子吸脹初期的種子浸出液在化學(xué)發(fā)光試劑介導(dǎo)下化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的平均值包括下述步驟(1)將待測(cè)種子用升汞溶液浸泡然后用蒸餾水或純凈水清洗；(2)將清洗后的種子放入透光容器，置于暗箱中；(3)用CaCl2的水溶液對(duì)所述種子浸種一段時(shí)間；(4)然后將化學(xué)發(fā)光探針試劑加入所述種子浸泡液中，測(cè)量種子浸泡液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的種子活力快速檢測(cè)方法，其特征在于所述種子是指具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的種子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的種子活力快速檢測(cè)方法，其特征在于所述種子是糧食類(lèi)作物種子、經(jīng)濟(jì)類(lèi)作物種子、花卉類(lèi)種子、蔬菜水果類(lèi)種子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的種子活力快速檢測(cè)方法，其特征在于所述化學(xué)發(fā)光探針試劑為魯米諾、光澤精、海螢熒光素類(lèi)似物或其衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的種子活力快速檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(1)中種子用升汞溶液浸泡，指的是用1～10％的升汞溶液浸泡種子1～10min。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的種子活力快速檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(3)中用CaCl2的水溶液對(duì)所述種子浸種一段時(shí)間，指的是用體積為100μL～1L濃度為1～10mM的CaCl2的水溶液對(duì)所述種子浸種1～30min。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的種子活力快速檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(4)中所述化學(xué)發(fā)光探針試劑加入所述種子浸泡液中，指的是加入最終濃度為100μM～10mM的化學(xué)發(fā)光探針試劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的種子活力快速檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(4)中種子浸泡液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度測(cè)量時(shí)間是30s～10min。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的種子活力快速檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(4)中種子浸泡液的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度測(cè)量溫度是20～32℃。
全文摘要
本發(fā)明提供一種種子活力快速檢測(cè)方法，主要是在同一條件下，測(cè)量待測(cè)種子吸脹初期的種子浸出液在化學(xué)發(fā)光探針試劑介導(dǎo)下的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的平均值，比較其大小，從而實(shí)現(xiàn)待測(cè)種子活力大小的檢測(cè)。本發(fā)明檢測(cè)種子活力需要樣品量少、適用范圍廣；檢測(cè)的是種子浸出液的化學(xué)發(fā)光，有效的排除了種子中別的發(fā)光物質(zhì)以及種子含水量對(duì)化學(xué)發(fā)光的影響，可以方便快捷的實(shí)現(xiàn)種子活力的無(wú)損、準(zhǔn)確、高靈敏檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/76GK101084707SQ20071002892
公開(kāi)日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2007年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月2日
發(fā)明者邢達(dá), 劉學(xué)俊, 張玲瑞 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)