專利名稱：鐵氰化鉀－魯米諾化學發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明設(shè)計的是一種檢測方法，具體地說是一種甜葉菊糖苷的檢測方法。
背景技術(shù)：
目前糖尿病患者逐漸增加，另外正常人過量攝取可吸收性糖也不利于身體健康，為此具有與蔗糖口感相近，同時為非吸收性糖的甜味劑開發(fā)利用是今后的發(fā)展方向。
在世界上許可添加的幾大類甜味劑中，一半來自化工合成，另一半來自于天然植物。隨著人們生活水平的不斷提高，越來越傾向于使用天然植物無能量甜味劑。
在天然植物無能量甜味劑中甜度比較高的有甜葉菊植物，其糖作為甜味劑應用也是近十幾年的事。甜葉菊植物中有7種甜味成分，但主要含量是蔗糖甜度300倍的St(Stevioside)和450倍的RA(Rebaudioside A，或稱為甜菊A3Stevioside A3)。由于其甜度高、無能量等特性而被廣泛地應用于食品、保健品、藥品、化妝品、抗氧化食用商品、飼料添加劑等行業(yè)。
隨著甜菊糖應用范圍不斷地擴大，快速檢測手段也越來越受重視。目前分析檢測方法有(1)分光光度計比色(黃海水，林靜1990；付寶忠，史立華1995；項秀珠，郭秀珠1996)、(2)薄層色譜(黃雨三2003)、(3)高壓液相色譜紫外檢測(黃曉蘭，倪爾葭1990；坂牧成恵等2004)、(4)毛細管電泳紫外檢測(邵寒娟，胡涌剛2001)等方法。薄層色譜法的化學試劑比較多，適合于小樣品的純化。高壓液相色譜法和毛細管電泳法儀器比較貴，同時要有該專業(yè)技術(shù)人員，一般甜葉菊糖苷加工廠不易實現(xiàn)。此外高壓液相色譜法和毛細管電泳法等儀器不方便攜帶，在農(nóng)業(yè)甜葉菊的育種和栽培生產(chǎn)中的隨時監(jiān)控等實際應用比較困難。這4種方法都適合于大學及研究所對甜葉菊糖苷的研究。
化學發(fā)光分析法由于其靈敏度高，線性范圍寬，儀器設(shè)備簡單，越來越受人們青睞。到目前為止(2006年4月28日黑龍江省科技情報局信息中心查新)，未見化學發(fā)光測定甜葉菊糖苷的報道。我們發(fā)表了“流動注射化學發(fā)光法測定甜葉菊糖苷”為題的文章，2005年刊載于“化學工程師”0423～25。在此基礎(chǔ)之上，我們對甜葉菊糖苷的定量測定又增加了Luminol進行深入研究，結(jié)果表明在NaOH堿性介質(zhì)中，甜葉菊糖苷可以增敏Luminol-Fe(CN)63-體系產(chǎn)生化學發(fā)光這一現(xiàn)象，為此提出一種測定甜葉菊糖苷的化學發(fā)光體系，即鐵氰化鉀-魯米諾化學發(fā)光體系，并結(jié)合流動注射技術(shù)，建立起了一種簡單、快速測定甜葉菊糖苷的新方法。該方法比發(fā)表過的文章內(nèi)容更加靈敏，而且有很好的選擇性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單，檢測成本低，適合于做常規(guī)性測定、易于被生產(chǎn)廠家所應用的鐵氰化鉀-魯米諾化學發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的用NaOH溶液作為溶劑，配制不同濃度的Fe(CN)3-6；3-氨基苯二甲酰環(huán)肼(Luminol)用pH值為8.0-12.0的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制成溶液；稱取甜葉菊糖苷溶于無水乙醇，用水定容，配制成甜葉菊糖苷標準溶液(10mg/mL)儲存于棕色容量瓶中；用分光光度計在190～1100nm下對甜葉菊糖苷標準溶液進行全波長掃描；調(diào)控MPI-B型測定儀器的載流在主動泵分別將載流Luminol和甜葉菊糖苷溶液以45r/min的流速通過相應的管道進行三通混合，輸入分析系統(tǒng)；待基線平穩(wěn)后，副動泵將Fe(CN)63-溶液以35r/min的流速通過十六通注射閥注入于載流中，與其混合；K3Fe(CN)6-Luminol為空白發(fā)光體系(I0)，樣品增強信號(IS)，取峰值(ΔI＝IS-I0)進行定量，發(fā)光強度以計數(shù)表示。
本發(fā)明還可以包括這樣一些特征1、所述的Fe(CN)63-的濃度為1mol/L～1×10-6mol/L；2、所述的NaOH溶液的濃度為1mol/L～0.01mol/L；3、所述的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液的pH值為8.0～10.0；4、甜葉菊糖苷在0.05～10mg/mL的濃度范圍內(nèi)與化學發(fā)光強度呈線性關(guān)系，其回歸方程為ΔI＝360.8×(mg/mL)+286.3，r2＝0.9941。
本發(fā)明采用流動注射化學發(fā)光法，操作簡單，檢測成本低，適合于做常規(guī)性測定易于被生產(chǎn)廠家所應用。本發(fā)明所使用的儀器是MPI-B型多參數(shù)化學發(fā)光測試分析系統(tǒng)。它是具有獨特電化學發(fā)光檢測功能的“毛細管電泳電化學發(fā)光檢測儀”，由中國科學院長春應用化學所與西安瑞邁電子科技有限公司合作研制成功，并通過鑒定。有關(guān)專家認為，這種具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的儀器，創(chuàng)新性顯著，設(shè)計制作新穎，達到國際領(lǐng)先水平。該電化學分析儀器可用于藥物、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)及核酸等的檢測分析，并可適用于蛋白質(zhì)與藥物、核酸相互作用的研究，在生化、醫(yī)藥、臨床，免疫等方面有著廣闊的應用前景。它與相關(guān)領(lǐng)域通常應用的進口“毛細管電泳激光誘導熒光分析儀”相比，大大降低了成本。因此由該儀器進行分析、測定建立起來的技術(shù)平臺也將具有我國獨立自主的知識產(chǎn)權(quán)。該方法具有國際先進水平。
本發(fā)明將物理學的流動注射和化學的化學發(fā)光相結(jié)合，利用化學物質(zhì)在氧化還原反應過程中有熒光或磷光，對該部分光信號轉(zhuǎn)變成電信號，再進一步信號放大，依據(jù)發(fā)光強度達到定量分析的目的。
本發(fā)明的方法應用領(lǐng)域廣泛，可以應用于1)工業(yè)甜葉菊糖苷的提取、純化等工業(yè)化生產(chǎn)的隨時監(jiān)控；2)農(nóng)業(yè)在甜葉菊栽培和育種的種植中，甜葉菊糖苷含量質(zhì)量監(jiān)控；3)原料收購收購甜葉菊葉片(或莖稈)時，其中的甜葉菊糖苷含量測定；4)相關(guān)終端產(chǎn)品在食品、保健品、藥品、化妝品、添加甜葉菊糖苷的抗氧化商品以及飼料添加劑中，甜葉菊糖苷被濃縮之后用該方法測定等。
五

圖1是兩種主要的甜葉菊糖苷分子結(jié)構(gòu)，R為H時是st；R為葡萄糖時是RA。
具體實施例方式1儀器設(shè)備1.1MPI-B型多參數(shù)化學發(fā)光分析測試系統(tǒng)(西安瑞邁電子有限公司)。整個分析過程中采樣、注樣、實驗數(shù)據(jù)采集及處理，均由Windows XP系統(tǒng)下MPI-B型多參數(shù)化學發(fā)光分析測試系統(tǒng)軟件完成。
1.2UV-1600紫外可見分光光度計北京瑞利分析儀器公司。
2材料與試劑2.1材料新鮮甜葉菊葉片，本實驗室栽培；甜葉菊糖苷，哈爾濱市綠葉科技有限公司。
2.2試劑(1)用0.1mol/L NaOH作為溶劑，配制不同濃度的Fe(CN)3-6。3-氨基苯二甲酰環(huán)肼(Luminol)為Sigma公司產(chǎn)品(用pH值為9.2的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制)。(2)甜葉菊糖苷標準溶液(10mg/mL)稱取甜葉菊糖苷溶于無水乙醇，用水定容，儲存于棕色容量瓶中備用。其余試劑均為分析純，水為二次去離子水。
3操作方法3.1定性分析用分光光度計在190～1100nm下對甜葉菊糖苷標準溶液進行全波長掃描。
3.2MPI-B型的載流調(diào)控在主動泵分別將載流Luminol和甜葉菊糖苷溶液以45r/min的流速通過相應的管道進行三通混合，輸入分析系統(tǒng)。待基線平穩(wěn)后，副動泵將Fe(CN)63-溶液以35r/min的流速通過十六通注射閥(注樣時間10秒)注入于載流中，與其混合。K3Fe(CN)6-Luminol為空白發(fā)光體系(I0)，樣品增強信號(IS)，取峰值(ΔI＝IS-I0)進行定量，發(fā)光強度以計數(shù)表示。
4結(jié)果與分析4.1氧化劑的選擇在酸性介質(zhì)(1mol/L H2SO4)中KMnO4和堿性介質(zhì)(0.4mol/L NaOH)中Fe(CN)63-、H2O2分別做氧化劑進行直接氧化甜葉菊糖苷的化學發(fā)光研究。結(jié)果表明，僅有KMnO4和Fe(CN)3-6做氧化劑時，產(chǎn)生化學發(fā)光，而Fe(CN)63-在該體系中表現(xiàn)出最好的發(fā)光特性。本文選擇堿性的Fe(CN)63-作為氧化劑來測定甜葉菊糖苷。
4.2Fe(CN)63-濃度影響Fe(CN)63-的用量對該體系的化學發(fā)光強度有很大的影響。本文在固定了甜葉菊糖苷和堿的濃度下，詳細考察了不同濃度的Fe(CN)63-(0～1×10-3mol/L)對該化學發(fā)光反應的影響。結(jié)果表明，當Fe(CN)63-的濃度為5×10-4mol/L時，發(fā)光強度最大。
4.3NaOH濃度的影響Fe(CN)63-只有在堿性介質(zhì)中，才能氧化甜葉菊糖苷產(chǎn)生化學發(fā)光。試驗表明，NaOH的最佳濃度為0.1mol/L。
4.4Luminol濃度及pH值的影響固定其它試驗條件，隨Luminol濃度的升高，ΔI增加越大，反應越靈敏。從靈敏度及節(jié)省溶劑角度考慮，選用0.03mmol/l的Luminol溶液。
Luminol的化學發(fā)光反應需要在堿性介質(zhì)中進行，介質(zhì)的pH值會影響化學發(fā)光強度。本文選用Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液為Luminol的介質(zhì)，考察了緩沖溶液pH值在8.0-12.0范圍內(nèi)對ΔI的影響，結(jié)果表明，當緩沖液pH值為9.2時，ΔI達到最大，由于實驗中K3Fe(CN)6用0.1mol/LNaOH溶液配制，實際經(jīng)管道混合后檢測流出廢液的pH值為9.8。
4.5表面活性劑的影響表面活性劑對許多化學發(fā)光體系有影響(Alwarthan 1996)，能顯著地改變化學發(fā)光強度。研究了1種非離子型表面活性劑(Tween80)，1種陽離子型表面活性劑(碘化四甲胺)，1種陰離子表面活性劑(十二烷基磺酸鈉SDS)，對該化學發(fā)光體系的影響。結(jié)果表明，這些表面活性劑對該化學發(fā)光體系均不產(chǎn)生顯著的影響。
4.6流速的影響在流動注射分析中，流速是影響分析特性的一個很重要的因素。在該化學發(fā)光流動體系中，流速太慢會導致最大發(fā)光在流通池之前；流速太快會導致最大發(fā)光在流通池之后。主動泵和副動泵的每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)為0～99，對它們的轉(zhuǎn)數(shù)進行了組合設(shè)定，發(fā)現(xiàn)該體系的最佳轉(zhuǎn)數(shù)分別為45r/min和35r/min。此時，最大發(fā)光在流通池中，恰好能被光電倍增管完全檢測。
4.7該化學發(fā)光體系的特性分析在上述選定的最佳實驗條件下，甜葉菊糖苷在0.05～10mg/mL的濃度范圍內(nèi)與化學發(fā)光強度呈線性關(guān)系，其回歸方程為ΔI＝360.8×(mg/mL)+286.3，r2＝0.9941，檢出限為0.05mg/mL。對5mg/mL甜葉菊糖苷溶液連續(xù)測定，每次得5個峰值，重復7次，相對標準差為1.7％，回收率為98％～108％。
4.8標準溶液甜葉菊糖苷的掃描甜葉菊糖苷在全波長(190～1100nm)掃描的研究結(jié)果表明，223nm、231nm的紫外有最大吸收峰。哈爾濱市綠葉科技有限公司生產(chǎn)的甜葉菊糖苷和本實驗室栽培的甜葉菊葉片提取物都有相同的紫外最大吸收峰。坂牧成恵等(2004)利用高壓液相色譜紫外檢測法，在210nm波長下檢測出了St和RA[食品衛(wèi)生志(日文)，45(2)81～86]。
4.9干擾實驗甜葉菊糖苷來源于葉片，在提取過程中共存其他組分，它們可能對該化學發(fā)光體系測定甜葉菊糖苷有一定的影響。為此，研究了1000倍的Na+、Cl-、K+、Br-、CO32-、SO42-和NO3-；100倍的淀粉、糊精以及無水乙醇等分別對1mg/mL的甜葉菊糖苷進行干擾測定實驗。結(jié)果表明，它們不干擾測定，因此可以用無水乙醇或水溶解甜葉菊糖苷。100倍蔗糖、葡萄糖、麥芽糖對測定無干擾。
4.10該化學發(fā)光方法測定葉片中的甜葉菊糖苷含量該方法已經(jīng)成功地用于甜葉菊葉片中糖苷含量的測定。取本實驗室栽培的甜葉菊葉片，105℃下干燥30min后80℃下干燥5h，稱重研細，用無水乙醇提取、振蕩過夜。次日10000rpm離心10min，取出上清用無水乙醇定溶到100mL。用該化學發(fā)光方法在線性范圍內(nèi)測定，重復三次。測定結(jié)果表明，干葉片中甜葉菊糖苷含量為9.28％。
權(quán)利要求
1.一種鐵氰化鉀-魯米諾化學發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法，其特征是(1)用NaOH溶液作為溶劑，配制不同濃度的Fe(CN)3-6；(2)3-氨基苯二甲酰環(huán)肼(Luminol)用pH值為8.0-12.0的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液配制成溶液；(3)稱取標準甜葉菊糖苷溶于無水乙醇，用水定容，配制成甜葉菊糖苷標準溶液(10mg/mL)儲存于棕色容量瓶中；(4)用分光光度計在190～1100nm下對甜葉菊糖苷標準溶液進行全波長掃描；(5)MPI-B型測定儀器的載流調(diào)控在主動泵分別將載流Luminol和甜葉菊糖苷溶液以45r/min的流速通過相應的管道進行三通混合，輸入分析系統(tǒng)；待基線平穩(wěn)后，副動泵將Fe(CN)63-溶液以35r/min的流速通過十六通注射閥注入于載流中，與其混合；K3Fe(CN)6-Luminol為空白發(fā)光體系(I0)，樣品增強信號(IS)，取峰值(ΔI＝IS-I0)進行定量，發(fā)光強度以計數(shù)表示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵氰化鉀-魯米諾化學發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法，其特征是所述的Fe(CN)63-的濃度為1mol/L～1×10-6mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鐵氰化鉀-魯米諾化學發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法，其特征是所述的NaOH溶液的濃度為1mol/L～0.01mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鐵氰化鉀-魯米諾化學發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法，其特征是所述的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液的pH值為8.0～10.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鐵氰化鉀-魯米諾化學發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法，其特征是甜葉菊糖苷在0.05～10mg/mL的濃度范圍內(nèi)與化學發(fā)光強度呈線性關(guān)系，其回歸方程為ΔI＝360.8x(mg/mL)+286.3，r2＝0.9941。
全文摘要
本發(fā)明提供了鐵氰化鉀－魯米諾化學發(fā)光體系定量甜葉菊糖苷的方法。配制不同濃度的Fe(CN)
文檔編號G01N21/76GK1877309SQ20061001027
公開日2006年12月13日 申請日期2006年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月12日
發(fā)明者郝再彬, 楊丹, 蒼晶, 王貴民, 一井真比古 申請人:郝再彬