專利名稱：控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大致涉及用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法。某些實(shí)施例涉及包括基于參數(shù)監(jiān)視而實(shí)時(shí)地改變流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法。
背景技術(shù)：
以下的說明和范例并不因其包含于該部分之內(nèi)而被認(rèn)為是現(xiàn)有技術(shù)。通常，流式細(xì)胞計(jì)在激光激發(fā)的聚苯乙烯小珠或者細(xì)胞線性地通過流動(dòng)室的時(shí)候提供對(duì)其熒光強(qiáng)度的測量。不過，流式細(xì)胞計(jì)同樣可以被用于提供對(duì)其它粒子的一個(gè)或多個(gè)特性的測量。某些系統(tǒng)被配置為用于測量由粒子所散射的與激發(fā)源成
90°或者180°的光的級(jí)別，兩個(gè)或更多個(gè)熒光測量被用于確定分類，也就是粒子的"身份"，被稱為"指示器"(reporter)的另外的熒光測量往往被用于量化所關(guān)注的化學(xué)反應(yīng)。各熒光測量是在不同的波長下作出的。
由于流式細(xì)胞計(jì)型測量儀器的測量能力已有所改進(jìn)，流式細(xì)胞計(jì)可以提供有用的測量的應(yīng)用領(lǐng)域大大地增加了。例如，對(duì)于諸如生物化驗(yàn)(例如，置換或競爭化驗(yàn)、非競爭化驗(yàn)、酶化驗(yàn))、核酸分析、以及組合化學(xué)等應(yīng)用，流式細(xì)胞計(jì)已經(jīng)變得越來越有助于提供數(shù)據(jù)。特別是，由于進(jìn)行化驗(yàn)的速度(特別是與其他化驗(yàn)方法(例如常規(guī)的酶聯(lián)免疫吸附分析"ELISA"形式)相比較)的原因，流式細(xì)胞計(jì)越來越普及。
在通常環(huán)境下，為了確保精確可靠的化驗(yàn)結(jié)果，作為準(zhǔn)備儀器以用于適當(dāng)?shù)挠猛竞蜏y量的一個(gè)或多個(gè)初始步驟，進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)的校準(zhǔn)。此外，除非每個(gè)流式細(xì)胞計(jì)的熒光通道都被校準(zhǔn)為進(jìn)行相同的讀取，否則對(duì)于樣本間的變化源，就沒有保證。如果沒有采用完整而穩(wěn)固的校準(zhǔn)方法的話，很有可能同一個(gè)儀器在不同的幾天里對(duì)同一個(gè)樣本給出不同的讀取結(jié)果。類似地，如果任意兩個(gè)儀器即使在被正確地設(shè)置的前提下仍然不能保證給出相同的結(jié)果，盡管流式細(xì)胞計(jì)可能對(duì)樣本中的細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和區(qū)分的測量效果要好一些，但其作為醫(yī)療儀器的用途可能是不大的。因此，已經(jīng)開發(fā)了許多不同的用于校準(zhǔn)流式細(xì)胞計(jì)的方法。起先，進(jìn)行了有效的研究，開發(fā)出降低在校準(zhǔn)時(shí)操作者的涉及程度的方法，從而提高了校準(zhǔn)的精度。這一成果很大程度上使得流式細(xì)胞計(jì)的校準(zhǔn)中的很多步驟實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化。此外，進(jìn)行了有效的研究以在其它方面提高校準(zhǔn)的精度。例如，該成果已導(dǎo)致校準(zhǔn)中的進(jìn)步，諸如使用具有統(tǒng)一而恒定的特性的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。特別是，由于生物樣本的特性會(huì)隨時(shí)間而變化，用于流式細(xì)胞計(jì)的生物校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)基本上被具有更加穩(wěn)定的特性的綜合校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)(例如，聚合微球體或粒子)所取代。此外，通常情況下，校準(zhǔn)微球體具有與測試微球體的特性基本相似(即，盡可能地相近)的特性(例如，尺度、體積、表面特性、粒度特性、折射率、熒光性等)。人們確信，通過將對(duì)與在測試中預(yù)期的值盡可能接近的值進(jìn)行校準(zhǔn)，此類校準(zhǔn)微球體提高了流式細(xì)胞計(jì)的精度。
改進(jìn)流式細(xì)胞計(jì)的校準(zhǔn)的努力同時(shí)也導(dǎo)致了與校準(zhǔn)有關(guān)的流式細(xì)胞計(jì)的參數(shù)的數(shù)量的增加。例如，流式細(xì)胞計(jì)測量系統(tǒng)的激光激發(fā)、探測器、以及電子會(huì)隨時(shí)間變化，從而影響最終測量結(jié)果。因此，流式細(xì)胞計(jì)的這些參數(shù)，以及在某些場合下的其它參數(shù)，往往與校準(zhǔn)方法有關(guān)。
其它的一些更加難以控制的參數(shù)同樣影響流式細(xì)胞計(jì)的測量。樣本速度就是
一個(gè)這樣的參數(shù)。Ortyn等人的編號(hào)為6,532,061美國專利就描述了一個(gè)用于測量樣本速度的方法的例子，該專利通過被引用而結(jié)合于此，如同在這里完整提出那樣。在該方法中，對(duì)象夾帶在流過感應(yīng)或者測量空間的液體流中。在這些實(shí)施例的每一個(gè)中，具有大致統(tǒng)一的節(jié)距的光柵被用于調(diào)制從移動(dòng)的對(duì)象接收到的光。該調(diào)制光被轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，電信號(hào)被數(shù)字化，然后進(jìn)行快速傅利葉變換(FFT)以確定對(duì)象的速度。然而，Ortyn等人的用于測量樣本速度的方法和系統(tǒng)有一些缺陷。例如，這些方法需要相當(dāng)復(fù)雜的光柵和軟件。此外，由于光柵所要求的精密度以及其制造的復(fù)雜性，光柵可能相當(dāng)昂貴。而且，由于諸如移動(dòng)的對(duì)象造成所檢測的光的光學(xué)畸變，可能會(huì)導(dǎo)致樣本速度測量不那么精確。
然而，流式細(xì)胞計(jì)測量的最大誤差通常是由溫度變化造成的。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有的可行的校準(zhǔn)方法不能夠充分地說明溫度變化對(duì)流式細(xì)胞計(jì)進(jìn)行的測量的影響。例如，Ortyn等人所描述的方法和系統(tǒng)盡管其試圖校準(zhǔn)一些參數(shù)，但并未考慮溫度變化，以及這些變化將如何影響流式細(xì)胞計(jì)的測量。因此，盡管巳經(jīng)有很多不同的可行的校準(zhǔn)方法，但還是可以通過更加精確地考慮在不同的流式細(xì)胞計(jì)測量中或是在單個(gè)的流式細(xì)胞計(jì)測量中的溫度變化來對(duì)這些方法作出進(jìn)一步的改進(jìn)。
因此，發(fā)展用于對(duì)流式細(xì)胞計(jì)測量系統(tǒng)的至少主要的誤差因素進(jìn)行控制的方法應(yīng)該是有益的，這些方法可以被整合從而產(chǎn)生實(shí)時(shí)的校準(zhǔn)方案。

發(fā)明內(nèi)容
如前所細(xì)述的那樣，通常最流式細(xì)胞計(jì)的最顯著的誤差因素是溫度變化。由于溫度可以是一個(gè)可測量的量，而且其效應(yīng)背后的物理機(jī)理是已知的，因此有可能降低甚至是完全消除這些誤差源中最關(guān)鍵的 一環(huán)。
已經(jīng)識(shí)別了一些測量誤差的原因和對(duì)于這些測量誤差原因的實(shí)時(shí)校正技術(shù)。此外，已經(jīng)創(chuàng)建了一種使用校準(zhǔn)微球體進(jìn)行實(shí)時(shí)微調(diào)節(jié)的方法，其中校準(zhǔn)微球體因直徑與可能包含于微球體樣本混合物中的待測物略有不同而可被識(shí)別。微調(diào)節(jié)過程的額外特征包括系統(tǒng)健康狀態(tài)的實(shí)時(shí)識(shí)別、 一個(gè)或多個(gè)通道中的非線性性的校正、和/或流式細(xì)胞計(jì)測量系統(tǒng)的有用的指示器動(dòng)態(tài)范圍的顯著擴(kuò)展。所描述的實(shí)施例可用于補(bǔ)償主要由溫度導(dǎo)致的系統(tǒng)變化，從而擴(kuò)展了操作的校準(zhǔn)范圍。
此外，需要指出的是，此處描述了用于控制流式細(xì)胞計(jì)測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法的若干不同的實(shí)施例。要理解，每個(gè)方法都可單獨(dú)被使用和執(zhí)行。另外，兩個(gè)或更多的方法可以被結(jié)合使用，這取決于例如測量系統(tǒng)的各種組件的可變性和/或測量系統(tǒng)的期望精度。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及一種控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法。該方法包括在測量系統(tǒng)進(jìn)行樣本微球體的測量時(shí)，監(jiān)測流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)。該方法還包括基于監(jiān)測實(shí)時(shí)地改變所述一個(gè)或多個(gè)參數(shù)。
在一個(gè)實(shí)施例中，監(jiān)測一個(gè)或多個(gè)參數(shù)可包括使用校準(zhǔn)微球體的測量來監(jiān)測一個(gè)或多個(gè)參數(shù)。校準(zhǔn)微球體的直徑與樣本微球體的直徑不同(例如，稍小)。在某些實(shí)施例中，該一個(gè)或多個(gè)參數(shù)可包括由測量系統(tǒng)的探測器所產(chǎn)生的輸出信號(hào)。輸出信號(hào)響應(yīng)于由樣本微球體所散射的光。
在另一個(gè)實(shí)施例中，監(jiān)測一個(gè)或多個(gè)參數(shù)可包括使用校準(zhǔn)微球體的測量來監(jiān)測一個(gè)或多個(gè)參數(shù)。校準(zhǔn)微球體的直徑與樣本微球體的直徑不同(例如，稍小)，
并且至少部分校準(zhǔn)微球體具有不同的光譜地址(spectral address)。在一個(gè)此類實(shí)施例中，所述一個(gè)或多個(gè)參數(shù)包括測量系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍。在另一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)參數(shù)的改變可包括擴(kuò)展測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)通道的動(dòng)態(tài)范圍。在又一個(gè)實(shí)施例中，所述一個(gè)或多個(gè)參數(shù)可包括對(duì)系統(tǒng)健康狀態(tài)的測量。系統(tǒng)健康狀態(tài)的測量可包括分類通道的健康狀態(tài)、指示器通道的健康狀態(tài)、或者其結(jié)合。在某些實(shí)施例中，所述一個(gè)或多個(gè)參數(shù)可包括樣本微球體的測量中的線性性。在這樣一個(gè)實(shí)施例中，測量可包括對(duì)分類通道的測量、對(duì)指示器通道的測量、或其組合。在另一個(gè)此類實(shí)施例中，對(duì)參數(shù)的改變包括在測量中大致地對(duì)任何非線性性進(jìn)行校正。
在某些實(shí)施例中，參數(shù)可包括測量系統(tǒng)的雪崩光電二極管的參數(shù)。在一個(gè)此類實(shí)施例中，其方法還可包括使用經(jīng)驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)來確定在改變參數(shù)時(shí)所要使用的校正因子。在另一個(gè)實(shí)施例中，參數(shù)可包括測量系統(tǒng)的光電倍增管的參數(shù)。
在還有一個(gè)實(shí)施例中，參數(shù)可包括樣本微球體的速度。在一個(gè)此類實(shí)施例中，對(duì)參數(shù)的監(jiān)測可包括監(jiān)測樣本微球體被置于其中的液體的溫度，并根據(jù)該溫度來確定樣本微球體的速度。在某些實(shí)施例中，該方法還可包括在對(duì)樣本微球體進(jìn)行測量之前對(duì)一個(gè)或多個(gè)參數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)。前述方法的每一個(gè)實(shí)施例都可包括此處所述的任何其它步驟。
另一個(gè)實(shí)施例涉及控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的一種不同的方法。該方法包括監(jiān)測最接近于流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的溫度。該方法還包括使用經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來響應(yīng)于溫度而改變測量系統(tǒng)的雪崩光電二極管的偏置電壓，從而大致上校正由于溫度所致的雪崩光電二極管的增益的變化。
在一個(gè)實(shí)施例中，其方法還包括通過在一個(gè)或多個(gè)溫度下將一基本恒定的光級(jí)別施加到雪崩光電二極管上，并且記錄在所述一個(gè)或多個(gè)溫度下對(duì)于多個(gè)偏置電壓的雪崩光電二極管的電流輸出，從而產(chǎn)生經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在另一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)參數(shù)的改變是在測量系統(tǒng)進(jìn)行樣本測量之前進(jìn)行的。在一個(gè)此類實(shí)施例中，偏置電壓在樣本測量過程中可基本保持恒定。在一個(gè)不同的實(shí)施例中，對(duì)參數(shù)的監(jiān)測和改變是實(shí)時(shí)進(jìn)行的。
在某些實(shí)施例中，其方法還可包括在發(fā)射出已知強(qiáng)度的光的校準(zhǔn)微球體被測量系統(tǒng)測量的同時(shí)，改變雪崩光電二極管的偏置電壓，直至從雪崩光電二極管獲得一個(gè)預(yù)定的信號(hào)級(jí)別為止。在一個(gè)此類實(shí)施例中，其方法還可包括確定雪崩光電二極管在反向偏置電壓下相應(yīng)的相對(duì)電流、在預(yù)定信號(hào)級(jí)別下的偏置電壓、以及溫度。該方法的實(shí)施例還可包括使用相應(yīng)的相對(duì)電流、溫度、反向偏置電壓、以及經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來確定偏置電壓。前述的方法的每個(gè)實(shí)施例均可包括此處所述的任何其它步驟。
另一個(gè)實(shí)施例涉及控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的又一個(gè)方法。該方法包括監(jiān)測最接近于流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的溫度。該方法還包括使用光電倍增管的特征曲線響應(yīng)于溫度而改變測量系統(tǒng)的光電倍增管的輸出信號(hào)，從而基本上校正光電倍增管輸出信號(hào)的增益變化。光電倍增管的增益響應(yīng)于溫度作近似線性變化。在某些實(shí)施例中，所述光電倍增管是測量系統(tǒng)的指示器通道的一部分。在另一實(shí)施例中，光電倍增管的特征曲線隨探測波長以及光電倍增管的陰極結(jié)構(gòu)而變 化。此處前述方法的每個(gè)實(shí)施例可包括此處所述的任何其它步驟。
另一個(gè)實(shí)施例涉及控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的一種方法 的另一實(shí)施例。該方法包括將測量系統(tǒng)的光電倍增管電壓設(shè)置為第一值和第二值。 該方法還包括在第一值和第二值測量光電倍增管的輸出電流。此外，該方法包括根 據(jù)第一值和第二值的對(duì)數(shù)與第一值和第二值下輸出電流的對(duì)數(shù)的相對(duì)關(guān)系來確定 光電倍增管的校準(zhǔn)電壓。該方法還包括將該校準(zhǔn)電壓施加到光電倍增管上。該方法 還包括測試該光電倍增管從而確定該光電倍增管的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)是否在預(yù)定的 容差內(nèi)。前述方法的每個(gè)實(shí)施例均可包括此處所述的任何其它步驟。
還有一個(gè)實(shí)施例涉及控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的另一種 方法。該方法包括使用逐次逼近來確定測量系統(tǒng)的探測器的校準(zhǔn)電壓。該方法還包 括將該校準(zhǔn)電壓施加到探測器上。在一個(gè)實(shí)施例中，探測器可包括雪崩光電二極管。 在一個(gè)不同的實(shí)施例中，探測器可包括光電倍增管。 '
在一個(gè)實(shí)施例中，其方法包括將校準(zhǔn)電壓與探測器的擊穿電壓相比較，如果 校準(zhǔn)電壓超過了擊穿電壓則重復(fù)對(duì)校準(zhǔn)電壓的確定過程。該方法的一個(gè)不同的實(shí)施 例包括收集和處理探測器樣本以確定探測器信號(hào)級(jí)別。在一個(gè)此類實(shí)施例中，其方 法可包括將探測器信號(hào)級(jí)別與校準(zhǔn)目標(biāo)信號(hào)級(jí)別相比較，如果探測器信號(hào)級(jí)別高于 校準(zhǔn)目標(biāo)信號(hào)級(jí)別，則減低探測器的偏置電壓，并且重復(fù)對(duì)校準(zhǔn)電壓的確定過程。 在另一個(gè)此類實(shí)施例中，其方法可包括將探測器信號(hào)級(jí)別與校準(zhǔn)目標(biāo)信號(hào)級(jí)別進(jìn)行 比較，如果探測器信號(hào)級(jí)別不在校準(zhǔn)目標(biāo)信號(hào)級(jí)別的預(yù)定范圍之內(nèi)，則重復(fù)對(duì)校準(zhǔn) 電壓的確定直至所有的期望的探測器電壓級(jí)別都被嘗試過為止。前述方法的每個(gè)實(shí) 施例均可包括此處所述的任何其它步驟。
再一個(gè)實(shí)施例涉及控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的一種不同 的方法。該方法包括對(duì)將會(huì)流經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的液體的溫度進(jìn)行監(jiān)測。樣 本微球體被置于該液體中。該方法還包括根據(jù)液體在該溫度下的粘度來確定測量系 統(tǒng)中的樣本微球體的速度。
在一個(gè)實(shí)施例中，其方法還包括基于速度來確定樣本微球體之一將存在于測 量系統(tǒng)的探測窗口中的時(shí)間長度。在某些實(shí)施例中，其方法可包括基于速度來確定 樣本微球體之一從測量系統(tǒng)的一個(gè)探測窗口移動(dòng)到另一個(gè)探測窗口的時(shí)間長度。在 另-個(gè)實(shí)施例中，其方法可包括基于速度來確定樣本微球體之一何時(shí)會(huì)出現(xiàn)在測量 系統(tǒng)的探測窗口中。在又一個(gè)實(shí)施例中，其方法包括控制測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)探測窗口的采樣間隔從而對(duì)速度進(jìn)行補(bǔ)償。
在還有一個(gè)實(shí)施例中，監(jiān)測參數(shù)和確定速度是在測量系統(tǒng)對(duì)樣本微球體進(jìn)行 測量之前進(jìn)行的。在某些實(shí)施例中，其方法可包括根據(jù)速度來確定測量系統(tǒng)的輸出 信號(hào)的一個(gè)或多個(gè)特性。在一個(gè)此類實(shí)施例中，其方法包括利用校正因子來校正由 于速度所致的輸出信號(hào)的誤差。所述的校正因子是采用經(jīng)驗(yàn)測量值來確定的。在另 一個(gè)實(shí)施例中，測量系統(tǒng)被配置為在樣本微球體的測量過程中維持液體的壓力基本 恒定。
在一個(gè)實(shí)施例中，確定速度包括從表、泊肅葉(Poiseuille)等式、或者從對(duì) 應(yīng)于溫度的速度的預(yù)定值來確定速度。在詞類的一些實(shí)施例中，該方法還可包括根 據(jù)速度在樣本微球體的測量過程中控制液體的壓力。前述方法的每個(gè)實(shí)施例均可包 括此處所述的任何其它步驟。
一種不同的實(shí)施例涉及控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的另一 種方法。該方法包括測量微球體從流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的第一探測窗口移動(dòng)到測 量系統(tǒng)的第二探測窗口的時(shí)間。該方法還包括改變測量系統(tǒng)的施加壓力從而使得時(shí) 間大致恒定。在一個(gè)實(shí)施例中，該時(shí)間是平均時(shí)間。微球體可以是樣本微球體或者 校準(zhǔn)微球體。測量時(shí)間可包括在第一和第二探測窗口中測量被微球體所散射的光。 在另一個(gè)實(shí)施例中，測量時(shí)間可包括用一個(gè)探測器測量在第一和第二探測窗口被微 球體所散射的光。在第一和第二探測窗口中被微球體所散射的光可被一個(gè)分光器導(dǎo) 向所述的一個(gè)探測器。該方法可以實(shí)時(shí)操作，也可以非實(shí)時(shí)地操作。前述方法的每 個(gè)實(shí)施例均可包括此處所述的任何其它步驟。
還有一個(gè)實(shí)施例涉及控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的一種不 同的方法。該方法包括測量微球體從流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的第一探測窗口移動(dòng)到 測量系統(tǒng)的第二探測窗口的平均時(shí)間。微球體可包括樣本微球體、校準(zhǔn)微球體、或 者二者兼而有之。該方法還包括將平均時(shí)間和參考微球體從第一探測窗口移動(dòng)到第 二探測窗口所用的參考時(shí)間進(jìn)行比較。此外，該方法包括，如果平均時(shí)間和參考時(shí) 間之間的差大于預(yù)定值，則改變測量系統(tǒng)的施加壓力。
在一個(gè)實(shí)施例中，改變施加壓力包括如果平均時(shí)間大于參考時(shí)間則增加施 加壓力。或者，如果平均時(shí)間小于參考時(shí)間則減小施加壓力。在某些實(shí)施例中，預(yù) 定值被選擇為對(duì)測量系統(tǒng)的已知的時(shí)間變化機(jī)制進(jìn)行補(bǔ)償。該方法可以實(shí)時(shí)地操 作，也可以非實(shí)時(shí)地操作。前述方法的每個(gè)實(shí)施例均可包括此處所述的任何其它步 驟。


通過閱讀以下的詳細(xì)描述并參考附圖，可以明顯地獲知本發(fā)明的其它目的和 優(yōu)點(diǎn)，其中
圖l是一示意圖，舉例描述可用于執(zhí)行此處所述的方法的測量系統(tǒng)。
圖2是舉例描述示出作為溫度的函數(shù)的具有130伏的反向偏置電壓(V60)的
APD的響應(yīng)的多條偏置曲線的示圖。
圖3是描述作為溫度的函數(shù)的各種PMT的響應(yīng)的示圖。
圖4是舉例描述作為PMT偏置電壓的對(duì)數(shù)的函數(shù)的PMT增益的對(duì)數(shù)。
圖5是一流程圖，描述用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的
方法的一個(gè)實(shí)施例。
圖6是一示意圖，描述可被用于執(zhí)行此處所述的至少一個(gè)方法的測量系統(tǒng)的 一部分的一個(gè)實(shí)施例的截面圖。
圖7描述可在此處所述的方法中的一個(gè)實(shí)施例中測量的脈沖群(即，在不同 時(shí)間所測得的散射光)。
雖然本發(fā)明可采用各種修改和變化形式，其具體的實(shí)施例在圖中以示例形式 給出并且將詳細(xì)進(jìn)行描述。但應(yīng)該理解的是，此處的附圖和對(duì)其的詳細(xì)描述并不是 為了將本發(fā)明局限于此處所揭示的細(xì)節(jié)，相反，其應(yīng)該覆蓋所有落入如所附的權(quán)利 要求中所定義的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的修改、等效方法和變化。
具體實(shí)施例方式
此處將描述用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法的若干 不同的實(shí)施例。如上所提及的，可以單獨(dú)使用和進(jìn)行每個(gè)方法。此外，可以組合地 使用或進(jìn)行兩個(gè)或更多的方法，這取決于例如，測量系統(tǒng)中的各種組件的可變性和 /或測量系統(tǒng)的期望精度。
盡管此處對(duì)實(shí)施例的描述涉及的是微球體或者聚苯乙烯小珠，但應(yīng)該理解的 是，所述測量系統(tǒng)和方法也可以用于微粒子、金納米粒子、小珠(bead)、微珠 (microbead)、膠乳粒子、膠乳小珠、熒光小珠、熒光粒子、有色粒子、有色小 珠、以及細(xì)胞(cell)。微球體可以作為分子反應(yīng)的載體。合適的微球體、小珠、 以及粒子的例子被描述于Fulton的美國專利號(hào)5,736,330、 Chandler等人的美國專 利號(hào)5,981,180、 Fulton的美國專利號(hào)6,057,107、 Chandler等人的美國專利號(hào)6,268,222、 Chandler等人的美國專利號(hào)6,449,562、 Chandler等人的美國專利號(hào) 6,514,295、 Chandler等人的美國專利號(hào)6,524,793、 Chandler等人的美國專利號(hào) 6,528,165，這些專利都通過被引用而完全結(jié)合于此。此處所述的測量系統(tǒng)和方法可 以用于這些專利中所述的任何微球體、小珠、以及粒子。此外，用于流式細(xì)胞計(jì)的 微球體可以從諸如得克薩斯州奧斯丁市的盧米尼克斯股份有限公司(Luminex Corp.)等的制造商處獲得。術(shù)語"小珠(bead)"和"微球體(microsphere)" 在此是可互換使用的。
圖1舉例描述可用于實(shí)現(xiàn)此處所述的方法的測量系統(tǒng)的一個(gè)示例。特別是， 可以根據(jù)此處所述的方法來確定、監(jiān)測、改變、和/或控制描述于圖1中的測量系 統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)。需要指出的是，此處所描述的圖并不是按實(shí)際的尺度比例繪 制的。特別地，圖中某些元件的尺度被夸大以用于強(qiáng)調(diào)這些元件的特征。出于闡述 清楚的考慮，測量系統(tǒng)的某些元件沒有被包括在圖中。
在圖1中，沿著過微球體所流經(jīng)的試管12的橫截面的平面示出了測量系統(tǒng)。 在一個(gè)例子中，試管可以是標(biāo)準(zhǔn)石英試管，比如用于標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞計(jì)中的那種。不 過，任何其它適當(dāng)類型的觀察或輸送室都可以被用于輸送要分析的樣本。測量系統(tǒng) 包括光源14。光源14可包括本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)光源，比如激光器。光源可被 配置為發(fā)射具有一個(gè)或多個(gè)波長的光，比如藍(lán)光或綠光。光源14可被配置為在微 球體流經(jīng)試管的時(shí)候?qū)ζ溥M(jìn)行照射。照射會(huì)導(dǎo)致微球體發(fā)出具有一個(gè)或多個(gè)波長或 波段的熒光。在某些實(shí)施例中，系統(tǒng)可包括一個(gè)或多個(gè)透鏡(未示出)，其被配置 為將來自光源的光聚焦到微球體上或聚焦到流動(dòng)路徑上。系統(tǒng)也可包括不只一個(gè)光 源。在一個(gè)實(shí)施例中，這些光源可被配置為以具有不同波長或波段的光(例如，藍(lán) 光和綠光)來照射微球體。在某些實(shí)施例中，這些光源可被配置為以不同的方向照 射微球體。
從微球體前向散射的光可通過折疊式反射鏡18或者另一種適當(dāng)?shù)墓鈱?dǎo)組件引 導(dǎo)到探測系統(tǒng)16?；蛘?，探測系統(tǒng)16可以直接放置在前向散射的光的路徑上。如 此，折疊式反射鏡或者其它的光導(dǎo)組件可以不包含在系統(tǒng)中。在一個(gè)實(shí)施例中，前 向散射的光可以是由微球體以和光源14的照射方向成大約180°的角度所散射的 光，如圖1中所示。前向散射的光可以不與照射方向正好成180°角，從而來自光 源的入射光不會(huì)撞上探測系統(tǒng)的感光表面。例如，前向散射的光可以是被微球體以 與照射方向成小于或大于180°的角度所散射的光(例如，以大約170°、 175°、 185°、 或者190°所散射的光)。被微球體散射的、與照射方向成大約90°角度的光也可以被收集(collected)。 在一個(gè)實(shí)施例中，該散射光可以被一個(gè)或多個(gè)分光器或者分色鏡分為一個(gè)以上的光 束。例如，與照射方向成大約90。角度而散射的光可以被分光器20分為兩束不同 的光。這兩個(gè)不同的光束可以由分光器22和24進(jìn)一步分成四束不同的光。每束光 可以被導(dǎo)入不同的探測系統(tǒng)，這些探測系統(tǒng)中可包括一個(gè)或多個(gè)探測器。例如，四 個(gè)光束中的一個(gè)可以被導(dǎo)入探測系統(tǒng)26。探測系統(tǒng)26可以被配置為探測由微球體 所散射的光。
由探測系統(tǒng)16和/或探測系統(tǒng)26所探測到的散射光通常與光源所照射的粒子 的體積成比例。因此，探測系統(tǒng)16的輸出信號(hào)和/或探測系統(tǒng)26的輸出信號(hào)可被 用于確定位于照射區(qū)域或者探測窗口中的粒子的直徑。此外，探測系統(tǒng)16和/或探 測系統(tǒng)26的輸出信號(hào)可被用于對(duì)粘在一起或者幾乎同時(shí)通過照射區(qū)域的一個(gè)以上 的粒子進(jìn)行識(shí)別。因此，這些粒子可以與其它樣本微球體以及校準(zhǔn)微球體相區(qū)別。 而且，探測系統(tǒng)16和/或探測系統(tǒng)26的輸出信號(hào)可如此處所述地被用于基于尺寸 的大小來區(qū)別樣本微球體和校準(zhǔn)微球體。
其它3個(gè)光束可被導(dǎo)入探測系統(tǒng)28、 30和32。探測系統(tǒng)28、 30以及32可被 配置為探測由微球體所發(fā)出的熒光。每個(gè)探測系統(tǒng)可被配置為探測不同波長或者不 同波長范圍的熒光。例如，其中一個(gè)探測系統(tǒng)可被配置為探測綠色熒光。另一個(gè)探 測系統(tǒng)可被配置為探測黃-橙色的熒光，而其它探測系統(tǒng)則被配置為探測紅色熒光。
在某些實(shí)施例中，濾光器34、 36、以及38可以分別被耦合到探測系統(tǒng)28、 30以及32上。濾光器可被配置為阻隔除了探測系統(tǒng)配置為要探測的波長以外的其 它波長的熒光。此外， 一個(gè)或多個(gè)透鏡(未示出)可以被光學(xué)地耦合到各個(gè)探測系 統(tǒng)上。這些透鏡可以被配置為將散射光或者發(fā)出的熒光會(huì)聚到探測器的感光表面 上。
探測器的輸出電流與碰撞到其上的熒光成比例，并且產(chǎn)生電流脈沖。電流脈 沖可以被轉(zhuǎn)換為電壓脈沖，經(jīng)過低通濾波，然后由A/D轉(zhuǎn)換器數(shù)字化。處理器40， 比如DSP，對(duì)脈沖下的區(qū)域進(jìn)行積分以提供表示熒光的大小的數(shù)。此外，處理器 可以執(zhí)行此處所述的另外的功能(例如，對(duì)流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參 數(shù)進(jìn)行監(jiān)測，基于所監(jiān)測的參數(shù)來實(shí)時(shí)地改變一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，等等)。如圖1 中所示，處理器40可以通過傳輸媒介42被耦合到探測器26。處理器40還可通過 傳輸媒介42和一個(gè)或多個(gè)其它組件(如A/D轉(zhuǎn)換器)而間接地耦合于探測器26。 處理器可以類似的方式耦合到系統(tǒng)的其它探測器上。在某些實(shí)施例中，由微球體所發(fā)出的熒光所產(chǎn)生的輸出信號(hào)可以被用于確定
微球體的身份(identity)以及有關(guān)發(fā)生在微球體表面的反應(yīng)的信息。例如，探測 系統(tǒng)的其中兩個(gè)探測系統(tǒng)的輸出信號(hào)可被用于確定微球體的身份，而另一探測系統(tǒng) 的輸出信號(hào)可被用于確定發(fā)生在微球體表面上的反應(yīng)。因此，對(duì)于探測器以及濾光 器的選擇是可以變化的，這取決于結(jié)合或綁定于被測量的微球體和/或反應(yīng)的染料 的類型(即，結(jié)合或綁定于反應(yīng)中所涉及的反應(yīng)物的染料)。
用于確定樣本微球體的身份的探測系統(tǒng)(例如，探測系統(tǒng)28和30)可以是 APD、 PMT、或者其它光探測器。如這里所述，可以對(duì)APD實(shí)時(shí)地校正如這里所 述的作為溫度的函數(shù)的增益變化。用于識(shí)別發(fā)生于微球體的表面的反應(yīng)的探測系統(tǒng) (例如，探測系統(tǒng)32)可以是PMT、 APD、或者其它形式的光探測器。通過采用 由PMT特征曲線所得出的一個(gè)簡單乘數(shù)，PMT可以被校正，其中所述PMT特征 曲線可以如此處所述地被施加到PMT的輸出信號(hào)上。探測器和測量系統(tǒng)還可以如 此處所述地進(jìn)行配置。
盡管圖1所示系統(tǒng)包括具有兩個(gè)不同探測窗口的兩個(gè)探測系統(tǒng)，用于區(qū)分具 有不同染色特性的微球體，但應(yīng)該理解的是，該系統(tǒng)可以包括超過兩個(gè)這樣的探測 窗口 (例如，3個(gè)探測窗口、 4個(gè)探測窗口，等等)。在這樣的實(shí)施例中，系統(tǒng)可 包括額外的分光器和額外的具有其它探測窗口的探測系統(tǒng)。此外，濾光器和/或透 鏡可被連接到各個(gè)所述的額外的探測系統(tǒng)上。
在另一個(gè)實(shí)施例中，系統(tǒng)可包括兩個(gè)或更多個(gè)被配置為區(qū)分在微球體的表面 上反應(yīng)的不同材料的探測系統(tǒng)。不同的反應(yīng)物材料可具有不同于微球體的染色特性 的染色特性。
其它可用于執(zhí)行此處所述的方法的測量系統(tǒng)的例子被闡述于Chandler等人的 美國專利號(hào)5,981,180， Chandler等人的美國專利號(hào)6,046,807， Chandler等人的美 國專利號(hào)6,139,800， Chandler等人的美國專利號(hào)6,366,354， Chandler等人的美國 專利號(hào)6,411,904， Chandler等人的美國專利號(hào)6,449,562， Chandler等人的美國專 利號(hào)6,524,793中，所有這些專利都通過被引用而完全結(jié)合于此。此處所描述的測 量系統(tǒng)也可以按照這些專利中所述的方式來配置。
在流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)中，散射光和小珠身份探測通常是采用雪崩光電二 極管(APD)作為光學(xué)傳感器來進(jìn)行的。APD相比于其它探測器的優(yōu)勢在于，通 過施加反向偏置電壓，APD的輸出電流級(jí)別或者"增益"可以在較寬的范圍內(nèi)變 化。所述的增益與施加的偏置電壓的大小成比例，其中該增益可以按照由恒定數(shù)量的入射光子所引起其流動(dòng)的電子來表示。不幸的是，從入射光子到輸出電子間的轉(zhuǎn) 換對(duì)溫度的依賴性很強(qiáng)。因此，APD相當(dāng)依賴于溫度，其程度比流式細(xì)胞計(jì)型測 量系統(tǒng)中的任何其它元件都要高。
因此， 一種控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法的一個(gè)實(shí)施 例包括對(duì)最接近于流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的溫度進(jìn)行監(jiān)測。該方法還包括響應(yīng)該溫
度而改變測量系統(tǒng)的APD的偏置電壓。
每一個(gè)APD都由制造商額定了一個(gè)反向偏置電壓(V60)，在該電壓下可以 獲得的輸出電流比在大致相同照射下的硅二極管要大60倍。取決于個(gè)體器件，V60 的取值在幾十伏到100伏以上。
由于APD的輸出相對(duì)于溫度而言是非線性的，因此不能在APD的整個(gè)操作 范圍內(nèi)使用恒定的補(bǔ)償因子。電流輸出一溫度的經(jīng)驗(yàn)測量可以被用于研究一種全面 的補(bǔ)償方法。換句話說，可以采用經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來確定被用于改變APD的參數(shù)的校正 因子。特別是，可以采用經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來改變APD的偏置電壓，從而大致上校正由于 溫度所導(dǎo)致的雪崩光電二極管的增益變化。
為了用經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來表征APD的響應(yīng)，在一個(gè)或多個(gè)溫度下，將一個(gè)大致恒定 的光級(jí)別施加到APD上。在一個(gè)或多個(gè)給定的溫度下，記錄在多個(gè)偏置電壓下APD 的電流輸出。改變溫度(例如，增加整數(shù)的度數(shù))，然后再次重復(fù)在多個(gè)偏置電壓 下的測量。所得到的數(shù)據(jù)集合(例如，如圖2中所示)充分地描述了特定的V60 器件的照明一電流隨溫度變化的曲線。為了獲取多個(gè)不同器件的響應(yīng)，可以對(duì)具有 不同V60額定值的APD重復(fù)這些測量。
在一個(gè)實(shí)施例中，偏置曲線表可被用于依下述方法校正溫度。在初始系統(tǒng)校 準(zhǔn)時(shí)，發(fā)射出已知強(qiáng)度的光的校準(zhǔn)微球體被引入系統(tǒng)。該校準(zhǔn)微球體流經(jīng)系統(tǒng)，當(dāng) 校準(zhǔn)微球體被測量系統(tǒng)測量時(shí)，偏置電壓被改變直至從APD獲得預(yù)定的信號(hào)級(jí)別。 然后，使用探測器的V60、在所述預(yù)定信號(hào)級(jí)別下的偏置電壓、以及溫度作為對(duì) APD響應(yīng)表中索引，將APD的當(dāng)前讀數(shù)插入表中(R值)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，偏置曲線表可以依以下方式產(chǎn)生?？墒褂萌绨l(fā)光二極管 (LED)之類的恒定光輸出源經(jīng)由光纜遠(yuǎn)程地對(duì)APD的感光區(qū)域進(jìn)行照射。APD 然后可以被放置在可以改變APD暴露于其中的環(huán)境溫度的環(huán)境艙中。然后，當(dāng)溫 度和施加給APD的偏置電壓都變化時(shí)，測量系統(tǒng)將APD的電流輸出(R值)記錄 下來。
在正常的樣本運(yùn)行期間，可監(jiān)測最接近于流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的溫度。然后可使用期望的相對(duì)電流、溫度、以及經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來確定偏置電壓。例如，R值、測
得的溫度、以及V60參數(shù)可以被用作APD響應(yīng)表的輸入以找出相應(yīng)的偏置電壓。
如果測得的溫度處于表格的條目之間，則將對(duì)應(yīng)于最接近的溫度條目的讀數(shù)進(jìn)行內(nèi)
插以獲得最佳偏置電壓。從表格中所獲得的偏置電壓被施加到APD上以校正其增
益隨溫度的變化。由于樣本運(yùn)行的時(shí)間通常在兩分鐘內(nèi)，而溫度在這段時(shí)間內(nèi)變化 不大，所以通常情況下在樣本運(yùn)行的開始階段進(jìn)行單次偏置校正并且在運(yùn)行的過程 中維持該偏置就足夠了。換句話說，可以在測量系統(tǒng)進(jìn)行樣本測量之前改變偏置電 壓，而在樣本測量的過程中偏置電壓可以基本恒定。然而，有可能最接近于測量系
統(tǒng)的溫度在樣本運(yùn)行的時(shí)候隨時(shí)間被監(jiān)測，而APD的偏置電壓可相應(yīng)地被改變。 在這種方式下，對(duì)溫度的監(jiān)測以及對(duì)APD的偏置電壓的改變是實(shí)時(shí)進(jìn)行的。
某些流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的指示器通道包括用作感光探測器的光電倍增管
(PMT)。該指示器通道通?？杀欢x為用于識(shí)別在微球體表面發(fā)生的反應(yīng)中涉 及的材料或結(jié)合于微球體表面的材料的通道。PMT產(chǎn)生與照射光電陰極的光的量、 施加的偏置電壓以及PMT內(nèi)的內(nèi)部倍增電極(internal dynode)的數(shù)量成比例的電 流。在一個(gè)流式細(xì)胞計(jì)中，PMT的偏置電壓通常被用作對(duì)給定級(jí)別的熒光的電流 輸出進(jìn)行歸一化的"控制"點(diǎn)。目前所采用的用于在校準(zhǔn)過程中獲得歸一化電壓的 方法是經(jīng)驗(yàn)性的，進(jìn)行測量，然后對(duì)有可能產(chǎn)生更接近于期望值的輸出的PMT偏 置設(shè)置進(jìn)行有根據(jù)的推測。通常，在輸出誤差級(jí)別達(dá)到一個(gè)可接受的范圍之前需要 多次迭代。所以，縮短校準(zhǔn)時(shí)間，從而降低用于尋找最佳PMT電壓的校準(zhǔn)試劑
(reagent)的量是很有利的。下文中將描述若干不同的可以使得校準(zhǔn)過程比現(xiàn)有情 況更快的方法。
由于對(duì)于溫度的大致線性的響應(yīng)，相比APD， PMT補(bǔ)償溫度變化要簡單得多。 例如，一種用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法的一個(gè)實(shí)施例 包括對(duì)最接近于流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的溫度進(jìn)行監(jiān)測。該溫度通常在盡量接近 PMT的位置測量，盡管由于PMT的溫度變化率相對(duì)輕微，精確的位置并不是很關(guān) 鍵。該方法還包括采用PMT的特征曲線來響應(yīng)于溫度而改變測量系統(tǒng)的PMT的 輸出信號(hào)，從而大致上校正PMT的輸出信號(hào)增益由于溫度所致的改變。PMT的增 益接近線性地響應(yīng)于溫度而改變。此外，PMT的特征曲線會(huì)隨著探測波長和陰極 結(jié)構(gòu)而變化。在這種方式下，在給定的探測波長和陰極結(jié)構(gòu)下，PMT對(duì)于溫度的 響應(yīng)可以通過一個(gè)簡單的線性關(guān)系來表示，如圖3中所示，該圖來自Hamamatsu Photonics K.K 1994年的《光電倍增管-理論到應(yīng)用》(Photomultiplier tube — Principalto Application)，在此將其完全地結(jié)合于此作為參考。
如前所述，由于PMT的增益隨溫度的變化要比APD的小得多，通常沒有必 要通過改變?cè)鲆婊蛘叽_定偏置電壓來對(duì)器件進(jìn)行補(bǔ)償。相反，采用從諸如圖3中所 示的曲線那樣的PMT特征曲線導(dǎo)出的簡單乘數(shù)就足夠了，其中所述曲線可以通過 報(bào)告軟件應(yīng)用到最終的PMT讀數(shù)上。
為了對(duì)PMT進(jìn)行校準(zhǔn)，具有已知熒光量的校準(zhǔn)微球體被提供給儀器，并且從 系統(tǒng)中流過，就像取得正常的樣本那樣。當(dāng)測量系統(tǒng)對(duì)校準(zhǔn)微球體進(jìn)行測量時(shí)，改 變偏置電壓，直至獲得預(yù)定的信號(hào)級(jí)別。
該方法是一種迭代過程，其中， 一組微球體讀數(shù)的統(tǒng)計(jì)值被計(jì)算出來，并且 在獲得期望的容差時(shí)終止該過程。如果誤差不夠小，那么前兩次迭代的結(jié)果可被用 于對(duì)下一個(gè)PMT偏置設(shè)定進(jìn)行預(yù)測。在此過程中采用了一個(gè)線性等式y(tǒng) = m*x +b，其中斜率m由在前的偏置和產(chǎn)生的熒光測量值來定義。如果PMT的偏置電 壓對(duì)電流增益的傳遞函數(shù)是線性的，可以直接獲得最終結(jié)果，并由另一個(gè)測量來測 試。然而，由于PMT的電壓一電流增益?zhèn)鬟f函數(shù)隨偏置電壓增加而呈指數(shù)增長， 線性方法僅僅在曲線的相對(duì)較小的一段內(nèi)有效，因此需要若千次迭代以滿足最終的 容差要求。
有趣的是，當(dāng)把PMT的電壓一增益關(guān)系繪制在log—log圖表上(參見圖4) 時(shí)，其傳遞函數(shù)呈現(xiàn)為一條直線。圖4中的數(shù)據(jù)來自Hamamatsu Photonics K.K 1994
年的《光電倍增管-理論到應(yīng)用》。
如早先所述的，內(nèi)部倍增電極的數(shù)量和施加的偏置電壓決定PMT的電流放大。 對(duì)于固定的光級(jí)別，如等式l中所示，輸出電流與V的N次冪成比例，其中V是 施加的偏置電壓，N是內(nèi)部倍增電極的數(shù)量，而A是包含了PMT的若干物理性質(zhì)
的比例常數(shù)。
i=A*VN (1) 對(duì)等式l的兩邊取對(duì)數(shù)，得到以下等式
log (i) =N*log(V)+log(A) (2)
該式可以被寫成簡單和常見的一階線性等式
y=m*x+b (3) 其中y=log(i)， m=N， x=log(V)， b=log(A)。使用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，現(xiàn)在就有可能僅采 用三個(gè)樣本測量來執(zhí)行縮短的校準(zhǔn)操作。
例如，在一個(gè)實(shí)施例中， 一種用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法包括將測量系統(tǒng)的PMT的電壓設(shè)置為第一值和第二值。該方法還包括
測量在第一值和第二值的PMT的輸出電流。此外，該方法包括從第一值和第二值 的對(duì)數(shù)對(duì)第一值和第二值下的輸出電流的對(duì)數(shù)來確定PMT的校準(zhǔn)電壓。該方法還 包括將校準(zhǔn)電壓施加到PMT上，并且對(duì)PMT進(jìn)行測試以確定該P(yáng)MT的一個(gè)或多 個(gè)參數(shù)是否在預(yù)定的容差之內(nèi)。
以下由步驟l一7概括出這種方法的一個(gè)具體的例子
1. 將PMT電壓設(shè)置為最接近于或位于其范圍的低端的值(V=Vl), 并且獲得一個(gè)測量值(i = L)。
2. 將PMT電壓設(shè)置為最接近于或位于其范圍的高端的值(V二Vh)， 并且獲得一個(gè)測量值(i = iH)。
3. 對(duì)所有四個(gè)值取對(duì)數(shù)。
4. 計(jì)算斜率m和截距b。
5. 求解目標(biāo)PMT設(shè)置(在對(duì)數(shù)空間內(nèi))xcal。
6. 取xeal的反對(duì)數(shù)以獲得PMT校準(zhǔn)電壓Veal。
7. 施加Vw，并測試來確定是否滿足期望的容差。 該方法已經(jīng)過檢驗(yàn)，每次均可成功地收斂在容差之內(nèi)。如果沒有滿足容差，
可以通過采用先前計(jì)算所得的V^， ^和Vh， iH在對(duì)數(shù)空間生成新的斜率和截距， 這樣可能獲得可接受的結(jié)果。點(diǎn)V^， i^可能相對(duì)接近最終的PMT電壓，只需要 煙新的線進(jìn)行較短的遍歷(traversal)即可產(chǎn)生可接受的結(jié)果。在這種情況下，四 個(gè)樣本測量將被用于尋找適當(dāng)?shù)男?zhǔn)電壓。
另一種用于校準(zhǔn)流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的探測器的方法使用逐次逼近法有利 地減少了校準(zhǔn)迭代的次數(shù)。在一個(gè)實(shí)施例中， 一種用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng) 的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法包括使用逐次逼近法來確定測量系統(tǒng)的探測器的校準(zhǔn)電 壓，如圖5中步驟50所示。當(dāng)所有的校準(zhǔn)電壓都已被施加到探測器上卻仍未獲得 成功的校準(zhǔn)時(shí)，該方法將以失敗退出校準(zhǔn)，如步驟52中所示。由于探測器可以是 APD、 PMT、或者任何其它適用于該測量系統(tǒng)的探測器，每個(gè)探測器電壓可與探 測器電壓限值進(jìn)行比較，如步驟54中所示。如果校準(zhǔn)電壓超過了該電壓限值，可 以通過至少重復(fù)步驟50來確定一個(gè)不同的校準(zhǔn)電壓。
如歩驟56、 58以及60中所示的，該方法將校準(zhǔn)電壓施加給探測器，從探測 器收集數(shù)據(jù)，并可包括構(gòu)件收集到的數(shù)據(jù)的直方圖，計(jì)算直方圖的峰值，并且將直 方圖峰值和校準(zhǔn)目標(biāo)峰值進(jìn)行比較。如果直方圖峰值足夠接近于校準(zhǔn)目標(biāo)峰值，校準(zhǔn)就可終止，如步驟62中所示。
該方法還可包括確定直方圖峰值是否在校準(zhǔn)目標(biāo)峰值之上，如步驟64中所 示。步驟64的輸出可被用于修正由步驟50中的逐次逼近法所產(chǎn)生的下一個(gè)校準(zhǔn)電壓。
盡管該方法在上文中相對(duì)于直方圖進(jìn)行了描述，但應(yīng)該理解的是，可以采用 任何合適的統(tǒng)計(jì)測量來進(jìn)行該方法。例如，確定探測器信號(hào)級(jí)別的任何適當(dāng)方法都 可以被采用，這些方法可(但不需要)包括從小珠樣本的集合來確定測量的統(tǒng)計(jì)方 法，比如平均數(shù)，中值等。
特別是，逐次逼近法通過設(shè)置和清除命令字中的位，只嘗試多達(dá)N次來使得 測得的值等于目標(biāo)值。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法可包括收集和處理探測器樣本來確 定探測器信號(hào)級(jí)別。在另一個(gè)此類實(shí)施例中，該方法可包括將探測器信號(hào)級(jí)別和校 準(zhǔn)目標(biāo)信號(hào)級(jí)別進(jìn)行比較，如果探測器信號(hào)級(jí)別高于校準(zhǔn)目標(biāo)信號(hào)級(jí)別，則降低探 測器偏置電壓并重復(fù)對(duì)校準(zhǔn)電壓的確定。在又一個(gè)此類的實(shí)施例中，該方法可包括 將探測器信號(hào)級(jí)別和校準(zhǔn)目標(biāo)信號(hào)級(jí)別進(jìn)行比較，如果探測器信號(hào)級(jí)別不在校準(zhǔn)目 標(biāo)信號(hào)級(jí)別的預(yù)定范圍以內(nèi)，則重復(fù)對(duì)校準(zhǔn)電壓的確定，直至所有所期望的探測器 電壓級(jí)別都巳被嘗試過為止。
這樣一種方法的一個(gè)具體的例子包括以下步驟
1. 將位掩碼(bit mask)和DacCmd值初始化為2N。對(duì)于12位Dac ("數(shù) 字一模擬轉(zhuǎn)換器")，N二12。在此例中，位掩碼=4096， DacCmd 值=4096。該Dac可包括任何適當(dāng)?shù)腄ac，例如可從馬薩諸塞州的 諾伍德市的模擬設(shè)備有限公司(Analog Devices, Inc.)購得的Dac。
2. 使用當(dāng)前的掩碼位來清除DacCmd中相應(yīng)的位。我們驅(qū)動(dòng)要么超出 目標(biāo)，要么超出探測器最大電壓限值。
3. 將掩碼向右移一位(例如，移動(dòng)到下一個(gè)最高有效位)。
4. 如果掩碼是0，則所有可能的位已經(jīng)被檢測而還沒有獲得充分的校 準(zhǔn)。該方法可進(jìn)行到步驟12。
5. 將掩碼和DacCmd相或以設(shè)置下一個(gè)最高有效位。
6. 確定對(duì)應(yīng)于DacCmd 二進(jìn)制值的探測器電壓。將該探測器電壓和探 測器擊穿電壓或者最大電壓相比較。如果該電壓超過了探測器擊穿 電壓，則回到步驟2。
7. 將DacCmd值(例如，所述電壓)發(fā)送給測量系統(tǒng)。8. 等待電壓變化生效。
9. 將新的直方圖峰值和該通道的校準(zhǔn)目標(biāo)峰值進(jìn)行比較。如果直方圖 峰值大于校準(zhǔn)目標(biāo)，則返回步驟2。
10. 如果直方圖峰值并不充分接近期望目標(biāo)，則返回步驟3。
11. 校準(zhǔn)通過。方法結(jié)束。
12. 校準(zhǔn)失敗。方法結(jié)束。
在步驟1一12中所描述的示例性方法可包括此處所述的任何其它步驟。
某些流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)在小珠流經(jīng)兩個(gè)探測窗口時(shí)使用流體靜力聚焦技 術(shù)將其分離出來進(jìn)行個(gè)別測量。測量窗口具有固定的大小和物理間隔。例如，在測 量系統(tǒng)中的光源照射點(diǎn)之間的距離定義了所述間隔。
底層液體傳送體的速度的變化會(huì)改變小珠位于探測窗口內(nèi)的時(shí)間的長度，以 及從一個(gè)窗口到下一個(gè)窗口的間隔時(shí)間的長度。最終的讀數(shù)與小珠存在于每個(gè)探測 窗口內(nèi)的時(shí)間的長度是成比例的。此外，系統(tǒng)還使用窗口內(nèi)傳送時(shí)間來確定第二探 測窗口何時(shí)有效(即小珠何時(shí)位于第二探測窗口中以待測量)。如果樣本測量和實(shí) 際小珠存在在時(shí)間上的對(duì)準(zhǔn)不同于在校準(zhǔn)期間所獲得的值，或者在照明窗口中的持 續(xù)(停留)時(shí)間不同，測量的精度就會(huì)下降。
如果測量系統(tǒng)被配置為在樣本微球體的測量過程中維持液體的壓力大致恒 定，則溫度的效果對(duì)于液體的速度變化造成的影響最大。粘度定義是液體的流動(dòng)阻
力的度量。每單位時(shí)間內(nèi)以壓力P流經(jīng)直徑R、長度L的管子的液體的容積可以 由泊肅葉(PoiseuiUe)等式來表示
V/T=( Tt *R4*P)/(8*N*L) (4) 其中V/T是單位時(shí)間的容積(與速度成比例)，而N是以泊(poise)為單位的粘 度。流動(dòng)艙的毛細(xì)管，雖然其尺度為矩形而不是圓形，但可以被視為簡單的管子。 所以，如泊肅葉等式中所定義的，小珠速度與液體傳送體的粘度成反比例。
用作流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的小珠傳送體的液體的主要成分是水。在15°C到 3(fC的操作溫度范圍內(nèi)，粘度由1.139厘泊變化到0.7975厘泊，其具有43%的顯 著變化。以上的粘度值是從第61版的《物理化學(xué)手冊(cè)》(Handbook of Chemistry & Physics)中的"水在0到100°C之間的粘度"(The Viscosity of Water 0 to 100°C ) 中所得的。護(hù)層(sheath)和樣本液體的速度如小珠的速度一樣也變化了大約43 %。因此，操作溫度可以被測量，然后被用于確定液體的粘度。相應(yīng)地，可以從表、 泊肅葉等式、或者速度一溫度的預(yù)定值來確定液體的速度。在此類實(shí)施例中，該方法可包括基于速度在樣本微球體的測量期間控制液體的壓力。
此外，液體的速度可以被用于確定小珠速度。同樣，傳送時(shí)間可以被實(shí)時(shí)地 提取并校正。如果液體的溫度在樣本測量過程中基本上沒有變化，對(duì)溫度的監(jiān)測和 對(duì)速度的確定可以在測量系統(tǒng)對(duì)樣本微球體進(jìn)行測量之前進(jìn)行。然而，該方法的這 些步驟也可以實(shí)時(shí)地進(jìn)行。
相應(yīng)地，用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的一個(gè)方法包括 對(duì)將流經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的液體的溫度進(jìn)行監(jiān)測。樣本微球體被置于該液體 中。該方法還包括根據(jù)在所述溫度下的液體的粘度來確定測量系統(tǒng)中的樣本微球體 的速度。在一些實(shí)施例中，該方法還包括基于所述的速度確定樣本微球體的其中之 一將出現(xiàn)在測量系統(tǒng)的探測窗口中的時(shí)間長度。在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括基 于所述的速度確定其中一個(gè)樣本微球體從測量系統(tǒng)的一個(gè)探測窗口移動(dòng)到另一個(gè) 探測窗口的時(shí)問長度。此外，該方法可包括基于所述的速度確定何吋其中-個(gè)樣本 微球體會(huì)出現(xiàn)在測量系統(tǒng)的探測窗口中。而且，該方法可包括控制測量系統(tǒng)的一個(gè) 或數(shù)個(gè)探測窗口的采樣間隔，從而對(duì)速度進(jìn)行補(bǔ)償。
窗口內(nèi)傳送時(shí)間可以被測量，并保存在系統(tǒng)的非易失性存儲(chǔ)器中，或者保存 到在初始校準(zhǔn)過程中對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行控制的計(jì)算機(jī)中。所測得的傳送時(shí)間然后可以被用 于后續(xù)的樣本運(yùn)行中以適當(dāng)?shù)貙?duì)第二探測窗口的采樣間隔進(jìn)行定時(shí)。窗口內(nèi)傳送時(shí) 間可以被縮短或者延長以補(bǔ)償粘度變化。校準(zhǔn)系統(tǒng)時(shí)的溫度與當(dāng)前溫度相對(duì)可用于 確定要施加的校正量。溫度對(duì)粘度因子的簡表可以被存儲(chǔ)在對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行控制的計(jì)算 機(jī)或者系統(tǒng)的非易失性存儲(chǔ)器中。在任一情況下，傳送時(shí)間校正因子可以從所述的 表計(jì)算而得，并且在樣本運(yùn)行開始之前施加。作為選擇，任何其它在本領(lǐng)域內(nèi)已知 的適當(dāng)方法也可被用于確定校正因子。
該方法還可以包括根據(jù)速度確定測量系統(tǒng)的輸出信號(hào)的一個(gè)或多個(gè)特性。例 如，小珠存在于探測窗口中的時(shí)間長度決定了探測器的輸出電脈沖的幅度和形狀。 脈沖然后經(jīng)過模擬低通濾波器，所述濾波器具有減小幅度和展寬脈沖寬度的顯著效 果。經(jīng)濾波后的脈沖被數(shù)字化，脈沖下的區(qū)域被計(jì)算以得到與光級(jí)別大致成比例的 值。
此外，該方法可包括使用校正因子對(duì)輸出信號(hào)由于速度所致的誤差進(jìn)行校正。 所述校正因子可以使用經(jīng)驗(yàn)測量值來確定。采用經(jīng)驗(yàn)測量值來構(gòu)建用于由流速變化 所致的脈沖寬度變化的校正因子的表是顯而易見的。這張表可以被存儲(chǔ)在系統(tǒng)的存 儲(chǔ)器中，或者是連接到系統(tǒng)的控制計(jì)算機(jī)中。另一種對(duì)由于溫度變化所致的速度變化進(jìn)行補(bǔ)償?shù)姆椒ㄊ前凑照扯鹊淖兓?比例地改變施加的液體壓力。這會(huì)使得速度維持恒定，因此在每個(gè)測量窗口內(nèi)，或 者其之間的時(shí)間不會(huì)有明顯的變化?？梢詫?shí)時(shí)地或在樣本運(yùn)行開始時(shí)實(shí)時(shí)地使用泊 肅葉等式，或者經(jīng)由從泊肅葉等式所計(jì)算出的預(yù)定表，或者通過其它的方法來進(jìn)行 該方法，從而動(dòng)態(tài)地設(shè)置合適的壓力。
這些方法已經(jīng)證明對(duì)恒定壓力方案提供了很大的改進(jìn)，不過，可能希望對(duì)于 溫度變化的其它補(bǔ)償。所以，此處描述了另一種方法，其可以與上述方法分開使用， 或與上述方法結(jié)合使用，來提供一種微調(diào)機(jī)制。與上述的方法不同，該方法采用光 學(xué)機(jī)制。此外，該方法可以使用測量和控制算法。然而，如此處所述的，撇開所附 加的光學(xué)機(jī)制和算法不談，該方法相對(duì)來說是便宜和快捷的。
當(dāng)流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的光學(xué)元件被裝配時(shí)，照明點(diǎn)(例如，激光點(diǎn))之 間的距離被初始地設(shè)置。隨著照明點(diǎn)(例如，或者是光束)間的距離減少，由于小 珠在探測窗口間移動(dòng)的距離較短，速度變化對(duì)于小珠傳送時(shí)間的影響被最小化。
由每個(gè)光束的垂直光照分布(profile)(即在與微球體流經(jīng)測量系統(tǒng)的方向大 致平行的方向上的每個(gè)光束的分布)來進(jìn)一步定義最小的間隔距離。例如，如果光 束強(qiáng)度自峰到肩迅速地減小，而且沒有第二最大值，就有可能將光束彼此相對(duì)接近 地放置，因?yàn)閺囊粋€(gè)光源出來的光不會(huì)溢出到其它的光照點(diǎn)中。需要留意以避免交 迭光束，因?yàn)檫@樣的交迭會(huì)導(dǎo)致在分類和指示器通道之間需要采用復(fù)雜的補(bǔ)償方 案，從而就造成了靈敏度降低。
如前所述的，重要的是保持照明點(diǎn)之間的小珠傳送時(shí)間基本恒定，該時(shí)間又 基本上使速度以及微球體在各自的照明窗口內(nèi)所花費(fèi)的時(shí)間固定。
用于使小珠傳送時(shí)間維持基本恒定的一個(gè)方法涉及實(shí)時(shí)地測量一個(gè)小珠通過 兩個(gè)探測窗口的平均時(shí)間，并且按需控制施加的壓力以保持傳送時(shí)間恒定。根據(jù)一 個(gè)實(shí)施例， 一種用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法包括對(duì)微 球體從流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的第一探測窗口運(yùn)動(dòng)到測量系統(tǒng)的第二探測窗口的 時(shí)間進(jìn)行測量。在一個(gè)實(shí)施例中，該時(shí)間可以是平均時(shí)間。所述微球體可以是樣本 微球體或者是校準(zhǔn)微球體。對(duì)時(shí)間的測量可包括測量在第一和第二探測窗口中被微 球體所散射的光。在另一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)時(shí)間的測量可包括用一個(gè)探測器測量在第 一和第二探測窗口中被微球體所散射的光。在一個(gè)此類實(shí)施例中，在第一和第二探 測窗口中被微球體所散射的光被一個(gè)分光器導(dǎo)向一個(gè)探測器。該方法還包括改變測 量系統(tǒng)的施加壓力，從而使得時(shí)間基本恒定。該方法可以實(shí)時(shí)地操作。如上所述的實(shí)施例可以包括此處所述的任何其它步驟。
不幸的是，大多數(shù)流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的當(dāng)前的光學(xué)設(shè)計(jì)使得其不可能對(duì) 通過第二探測窗口的每個(gè)小珠進(jìn)行探測，其中在第二探測窗口通常只有指示器熒光 被測量，這是因?yàn)闊晒獍l(fā)射(它是無法預(yù)先得知的)不會(huì)對(duì)于各個(gè)小珠都恒定，而 且對(duì)于某些小珠而言非?？赡苁橇?。明顯的解決之道是增加另一個(gè)光學(xué)探測器來測 量由小珠所散射的第二光照源的光，不過這會(huì)對(duì)系統(tǒng)增加顯著的成本，因?yàn)闉榱颂?理新信號(hào)，需要增加額外的電子和數(shù)字處理鏈。
所建議的方法則既簡單又便宜，因?yàn)槠渖婕暗氖窃趦蓚€(gè)探測窗口中采用同一 個(gè)散射光探測器來測量散射。由于當(dāng)前的光學(xué)布局防止了第二 (指示器)窗口中的 散射光到達(dá)散射探測器；因此必須重新置放探測器以使得其接收由小珠發(fā)射或者反 射的所有光。這一步完成后，可由下游的電子設(shè)備分別辨認(rèn)出與來自每個(gè)光源的散 射大致成比例的清晰的峰。
圖6描述了可以用于執(zhí)行此處所述的方法的測量系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施例。如圖6 屮所示，測量系統(tǒng)包括光源70和72。光源70可以是例如發(fā)射的光波長大約為639nm 的激光器。該激光器可適用于為測量系統(tǒng)的分類通道提供光照。光源72可以是例 如發(fā)射的光波長大約為532nm的激光器。該激光器可適用于為測量系統(tǒng)的指示器 通道提供光照。注意，每個(gè)激光器的照射區(qū)域并非與小珠流動(dòng)的軸(未示出)相重 合。其它的光源也可被用于上述的例子中。例如，依要被測量的樣本的不同，光源 及其波長可以改變。
如圖6中所示，光源70和72均照射試管74。特別地，光源70和72被配置 為在小珠76流經(jīng)試管74時(shí)對(duì)其進(jìn)行照射。如圖6中所進(jìn)一步示出的，光源70和 72可以被配置為以大致相對(duì)的角度來照射小珠。不過，應(yīng)該可以理解的是，光源 可以以任何合適的角度對(duì)小珠進(jìn)行照射。
由于兩個(gè)光源的照射而被小珠所散射的光可以被透鏡78收集。透鏡78可以 包括本領(lǐng)域任何已知的合適的透鏡。此外，透鏡78可以由反射收集器(collector) 所代替，或者可以不包含在該系統(tǒng)中。雖然圖中顯示透鏡78以(相對(duì)于光源70 和72)大約90。的收集角來收集光，但應(yīng)該理解的是，透鏡可以被設(shè)置為與光源成 任意合適的收集角度。
被透鏡78所收集的光被引向分光器80。分光器80可包括本領(lǐng)域任何己知的 合適的光學(xué)組件，比如玻璃板或者是分光濾光器。分光器80被配置為將透鏡收集 的光的一部分引導(dǎo)給探測器82。探測器82可被配置為對(duì)由于兩個(gè)(或多個(gè))光源的照射而被小珠散射的光進(jìn)行探測。在這種方式下，相對(duì)如前所提供的光源的例子
而言，探測器82可被配置為探測由小珠所散射的、波長大約為532nm和639nm的 光。該探測器可包括本領(lǐng)域任何已知的合適的探測器，比如CCD器件。
探測器82因此將探測單個(gè)小珠的兩個(gè)不同的散射信號(hào)。這些散射信號(hào)在不同 的波長下被探測，所述波長則基于光源的波長來決定。由于在小珠通過試管時(shí)，每 個(gè)光源在不同時(shí)間內(nèi)照射小珠，則不同的散射信號(hào)被探測的時(shí)間就可以被用來測量 小珠或者微球體從測量系統(tǒng)的第一探測窗口移動(dòng)到測量系統(tǒng)的第二探測窗口的時(shí) 間。
此外，分光器80被配置為傳輸透鏡所收集的光的其它部分。被傳輸?shù)脑摬糠?光可被光學(xué)組件84引導(dǎo)給系統(tǒng)的探測子系統(tǒng)的分類部分86。光學(xué)組件84可以包 括例如折疊式反射鏡、分光濾光器、局部透光鏡、或者本領(lǐng)域已知的其它合適的組 件?；蛘撸Q于諸如探測子系統(tǒng)的分類部分的布置等因素，光學(xué)組件84可以不 被包含在系統(tǒng)中。所述探測子系統(tǒng)的分類部分可包括本領(lǐng)域任何已知的組件。在某 些實(shí)施例中，探測子系統(tǒng)的分類部分可以如圖l所述的那樣配置。被分光器80所 傳送的另一部分光可以被引導(dǎo)給探測子系統(tǒng)的指示器通道(未示出)。盡管該系統(tǒng) 使用第一照射區(qū)域用于分類，使用第二區(qū)域用于指示器信號(hào)，不過在采用了該技術(shù) 的設(shè)備中的使用方式不局限于這些實(shí)施例。熒光或者散射光可以被用于另一種用 途，例如，對(duì)熒光指示器或者在細(xì)胞、小珠及其它粒子中的其它染料進(jìn)行測量。
被分光器80引導(dǎo)給探測器82的熒光發(fā)射(如果其存在的話)將被加到散射 信號(hào)，但其作用不是很重要，因?yàn)槠浞冗h(yuǎn)小于散射光的幅度。如上所述的，圖6 中所示的實(shí)現(xiàn)方法采用分光器80，其可以是波長分光器，它將散射的光重新引導(dǎo) 給位置重置的探測器而不改變施加給分類探測器的光譜。顯然，其它的實(shí)施例也是 可能的。例如，可以想像，可以將探測器安排成使得不包含額外的部件。圖6所示 的系統(tǒng)還可以進(jìn)一步依此處所述進(jìn)行配置。
一種用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法的另一個(gè)實(shí)施 例包括測量微球體從流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的第一探測窗口移動(dòng)到測量系統(tǒng)的第 二探測窗口的平均時(shí)間。微球體可包括樣本微球體、校準(zhǔn)微球體、或者二者兼而有 之。該方法還包括將平均時(shí)間和參考時(shí)間進(jìn)行比較，所謂參考時(shí)間就是參考微球體 從第一探測窗口移動(dòng)到第二探測窗口的時(shí)間。該方法可以包括對(duì)參考時(shí)間的測量， 也可以不包括這一步。此外，該方法包括，如果平均時(shí)間和參考時(shí)間的差異大于預(yù) 定值，則改變測量系統(tǒng)的施加壓力。在一些實(shí)施例中，可選擇該預(yù)定值來補(bǔ)償測量系統(tǒng)的已知的時(shí)間變化機(jī)制。在一個(gè)實(shí)施例中，改變施加的壓力包括，如果平均時(shí) 間大于參考時(shí)間，則提高施加的壓力。在一個(gè)不同的實(shí)施例中，改變施加的壓力包 括，如果平均時(shí)間小于參考時(shí)間，則降低施加的壓力。該方法同樣可以實(shí)時(shí)地進(jìn)行。 上述的方法提供了一種直接地控制系統(tǒng)壓力從而使得連續(xù)的散射脈沖之間的 時(shí)間大致恒定的技術(shù)。利用由數(shù)字信號(hào)處理器或者其它合適的處理器所測得的采樣 信號(hào)，使用電子硬件(例如，計(jì)數(shù)器、數(shù)字比較器，等等)或軟件可實(shí)現(xiàn)該技術(shù)。 在任一實(shí)施例中，該方法是模擬的，得到相同的結(jié)果。以下在步驟1-6中提供該算 法的高級(jí)描述，脈沖群的例子示于圖7。
1. 當(dāng)在已知的壓力和溫度下校準(zhǔn)系統(tǒng)時(shí)，測量連續(xù)的散射脈沖峰之間的 平均傳送時(shí)間，并保存以便以后參考。
2. 在正常樣本獲取過程中，來自紅色激光器(或者第一個(gè)照射小珠的任 何其它光源)的第一散射脈沖啟動(dòng)計(jì)時(shí)器。例如，如圖7中所示，在 ^時(shí)刻，對(duì)應(yīng)于具有639nm波長的激光器照射的散射脈沖被探測到。 因此，計(jì)時(shí)器開始于h。
3. 當(dāng)?shù)诙⑸涿}沖到達(dá)時(shí)，計(jì)時(shí)器停止。例如，如圖7中所示，當(dāng)對(duì)應(yīng) 于具有532nm波長的激光器照射的散射脈沖在12時(shí)刻被探測到時(shí)， 計(jì)時(shí)器停止。
4. 計(jì)時(shí)器的值隨后被用于和在校準(zhǔn)操作期間所測得的傳送時(shí)間相比較。
5. 如果計(jì)時(shí)器值明顯高于校準(zhǔn)時(shí)間，則壓力源(例如，泵)的一個(gè)或多 個(gè)參數(shù)會(huì)被改變以增加其壓力。壓力源的參數(shù)可以由處理器來改變。 或者，如果t2和ti的差大于t^，則可增加壓力源的壓力。t^可以是 定義小珠的傳送時(shí)間的可接受變化量的預(yù)定值。
6. 如果計(jì)時(shí)器值明顯低于校準(zhǔn)時(shí)間，則壓力源的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)會(huì)被改 變以降低其壓力。所述一個(gè)或多個(gè)參數(shù)可以由處理器來改變?；蛘?， 如果t2和t,的差小于t^，則壓力源的壓力可以被減小。步驟5和步 驟6中所用的U具有相同值。
為了保持該"控制系統(tǒng)"相對(duì)穩(wěn)定，有以下若干情況可被加以考慮。例如， 可以進(jìn)行該方法使得系統(tǒng)不被控制為對(duì)經(jīng)過系統(tǒng)的每個(gè)小珠事件嘗試或作出正向 或者反向的壓力校正?？梢圆捎媚承┢骄椒▉硌a(bǔ)償被稱為"小珠抖動(dòng)(bead jitter)" 的已知時(shí)間變化機(jī)制，該機(jī)制被認(rèn)為至少是部分地由樣本核心的速度梯度造成的。 而且，應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎地選擇引起壓力校正的時(shí)間誤差的閾值。誤差的幅度最好作為決定壓力校正量的控制器的輸入。很可能的是可使用經(jīng)典的積分一差分控制器來用于良
好的操作。
雖然以上列舉的校正因子可以被用于在樣本微球體的測量之前對(duì)測量誤差的 主要部分進(jìn)行校正，但在測量過程中也可以進(jìn)行精細(xì)校正以補(bǔ)償實(shí)施了上述技術(shù)之 后可能存在的殘留誤差。例如，用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù) 的一個(gè)方法包括在測量系統(tǒng)對(duì)樣本微球體進(jìn)行測量時(shí)監(jiān)測測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè) 參數(shù)。該方法還包括基于監(jiān)測到的參數(shù)實(shí)時(shí)地改變一個(gè)或多個(gè)參數(shù)。例如，如上所
述，被監(jiān)測且被改變的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)可包括測量系統(tǒng)的PMT的參數(shù)。此外，使
用該過程也可消除那些沒有在本說明書加以標(biāo)識(shí)的誤差源。
流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)基于測得的微球體內(nèi)的兩個(gè)或多個(gè)染料的亮度 (intensity)來識(shí)別通過系統(tǒng)的微球體。這一識(shí)別技術(shù)也可以被用于在所有通道中 (指示器通道和分類通道兩者)識(shí)別含有已知量的熒光強(qiáng)度的校準(zhǔn)微球體。在校準(zhǔn)
微球體的測量結(jié)果已知之后，可以將精細(xì)校正因子施加給指示器和/或分類通道以 用于樣本微球體測量。
在區(qū)分校準(zhǔn)微球體和樣本微球體時(shí)可能導(dǎo)致該技術(shù)復(fù)雜化。例如，校準(zhǔn)微球 體的新的光譜地址可以基于染色級(jí)別組合而創(chuàng)建，但這會(huì)使得系統(tǒng)的多路處理能力 降低N-l 。另一種技術(shù)通過使得校準(zhǔn)微球體的直徑大于或者小于樣本微球體的直徑 而對(duì)其進(jìn)行識(shí)別。
測量系統(tǒng)可以對(duì)被微球體所散射的和照射平面成90°角的光線進(jìn)行測量。散射 光的級(jí)別被用于識(shí)別那些可能粘在一起或者可能基本同時(shí)通過照射區(qū)域的多個(gè)微 球體。例如，散射光通常與存在于照射區(qū)域內(nèi)的所有粒子的體積成比例；因此，多 個(gè)微球體要比單個(gè)微球體的散射信號(hào)更強(qiáng)。由于大多數(shù)的微球體通常作為單個(gè)對(duì)象 通過照射區(qū)域，通過考慮群體事件，就容易識(shí)別不屬于單個(gè)小珠的那些事件。通常， 兩個(gè)，有時(shí)為三個(gè)，微球體集合在一起并產(chǎn)生比單個(gè)微球體所產(chǎn)生的信號(hào)要強(qiáng)的信 號(hào)。單個(gè)微球體的散射信號(hào)級(jí)別通常在化驗(yàn)進(jìn)展期間進(jìn)行，因?yàn)榛?yàn)形式對(duì)于散射 信號(hào)會(huì)產(chǎn)生影響。
較佳的情況下應(yīng)該采用直徑小于而不是大于樣本微球體的直徑的校準(zhǔn)微球 體，因?yàn)榭梢愿菀椎貙⑿?zhǔn)微球體從通過照射區(qū)域的任意多的微球體組合中區(qū)分 出來。因此，對(duì)測量設(shè)備的參數(shù)監(jiān)測可以采用直徑小于樣本微球體的直徑的校準(zhǔn)微 球體的測量數(shù)據(jù)來進(jìn)行。此外，被監(jiān)測和改變的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)可以包括由測量系 統(tǒng)的探測器所產(chǎn)生的輸出信號(hào)，這些輸出信號(hào)響應(yīng)于由樣本微球體所散射的光。例如，如果校準(zhǔn)微球體直徑對(duì)樣本微球體直徑的比率已知，就也有可能使用校準(zhǔn)微球 體來對(duì)散射測量結(jié)果進(jìn)行微調(diào)。
至少部分校準(zhǔn)微球體也可具有不同的光譜地址。如此， 一系列不同的校準(zhǔn)微 球體可以被用于增強(qiáng)上述的校準(zhǔn)方法。例如，通過使用直徑作為第一區(qū)別點(diǎn)，校準(zhǔn) 微球體的光譜地址可作為校準(zhǔn)空間中的第二區(qū)別點(diǎn)，正如在樣本空間里那樣。具有 多個(gè)校準(zhǔn)級(jí)別可用于下面的實(shí)現(xiàn)中，這些校準(zhǔn)級(jí)別在分類空間內(nèi)被充分地分開以對(duì) 微球體的身份加以辨別。
例如，可被監(jiān)測和改變的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)可包括樣本微球體的測量中的線性 性。監(jiān)測或改變測量設(shè)備的參數(shù)的測量可包括測量系統(tǒng)的分類通道的測量。在此實(shí) 施例中，對(duì)測量設(shè)備的參數(shù)的改變較佳地校正了測量中的任何非線性性。如此，多 個(gè)校正級(jí)別可被用于探測和校正分級(jí)空間中的非線性性。當(dāng)前的測量系統(tǒng)僅使用單 點(diǎn)校準(zhǔn)，因此由于系統(tǒng)非線性性所導(dǎo)致的誤差就不能被校正。在以二維表示的雙染 料小珠系統(tǒng)中，該非線性性可以被當(dāng)作基于分類微球體的被觀測的位置的平面中分 類空間的變體。對(duì)非線性性的校正改進(jìn)了該平面中的微球體分類精度。該技術(shù)可以 類似效果被擴(kuò)展到任何維數(shù)。
多個(gè)校準(zhǔn)級(jí)別也可以被用于探測和校正指示器信號(hào)的非線性性。類似于如上 所述的技術(shù)，指示器通道在目前的測量系統(tǒng)中也可能經(jīng)受單個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)。對(duì)指示器通 道中的非線性性進(jìn)行探測和校正可如上所述進(jìn)行操作。例如，在測量系統(tǒng)的參數(shù)被 監(jiān)測和改變期間所進(jìn)行的測量可包括對(duì)于測量系統(tǒng)的指示器通道的測量。而且，在 測量系統(tǒng)的參數(shù)被監(jiān)測和改變期間所進(jìn)行的測量可包括對(duì)于測量系統(tǒng)的指示器通 道和分類通道的測量。如此，在分類和指示器通道中的非線性性可以大致同時(shí)地被 監(jiān)測和校正。
在另一個(gè)例子中，可被監(jiān)測和改變的測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)包括測量系 統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍。例如，多個(gè)校準(zhǔn)級(jí)別也可被用于對(duì)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍進(jìn)行實(shí)時(shí)的確定。 測量系統(tǒng)具有有限的線性范圍。通過在一個(gè)或多個(gè)被唯一識(shí)別的校準(zhǔn)微球體上使用 不同的指示器校準(zhǔn)級(jí)別，就有可能識(shí)別出探測器的探測下限和/或上限，在下限和 上限處系統(tǒng)由于信號(hào)削波而變得非線性。
在某些實(shí)施例中，多個(gè)校準(zhǔn)級(jí)別可被用于確定系統(tǒng)健康狀態(tài)分類。如此，被 監(jiān)測和改變的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)可包括測量系統(tǒng)健康狀態(tài)。測量系統(tǒng)健康狀態(tài)可包括 分類通道的健康狀態(tài)、指示器通道的健康狀態(tài)、或者二者兼而有之。例如，如果上 述的各個(gè)方法的集合不能就溫度或者其它效應(yīng)對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行補(bǔ)償，校準(zhǔn)微球體熒光分類級(jí)別將會(huì)比其預(yù)期值更高。可以設(shè)置一個(gè)閾值級(jí)別，而校準(zhǔn)微球體熒光分類級(jí)別 可與該閾值相比較。如果校準(zhǔn)微球體熒光分類級(jí)別落在閾值級(jí)別的選定的一側(cè)，可 向系統(tǒng)操作者提供或者向耦合于測量系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)發(fā)送警告，告知測量結(jié)果是可疑 的。所述警告可以是可視的輸出信號(hào)和/或音頻輸出信號(hào)。在類似的方式下，多個(gè) 校準(zhǔn)級(jí)別可以被用于確定指示器系統(tǒng)健康狀態(tài)。類似于對(duì)分類系統(tǒng)健康狀態(tài)的確 定，指示器系統(tǒng)中不可校正的誤差可以被識(shí)別并報(bào)告給系統(tǒng)操作者或者與測量系統(tǒng) 相連的計(jì)算機(jī)。
而且，多個(gè)校準(zhǔn)級(jí)別可以被用于擴(kuò)展指示器通道的線性動(dòng)態(tài)范圍。如此，改 變測量系統(tǒng)的參數(shù)可包括對(duì)測量系統(tǒng)的指示器通道的線性動(dòng)態(tài)范圍加以擴(kuò)展。通過 包含存在于非線性區(qū)域內(nèi)的若干明亮級(jí)別的校準(zhǔn)微球體，有可能將實(shí)際測得的熒光 級(jí)別映射到其線性等價(jià)量上。通過在各個(gè)校準(zhǔn)微球體值之間內(nèi)插，可以從校準(zhǔn)數(shù)據(jù) 構(gòu)造出從測得的曲線到期望曲線的平滑映射。因此，如果采用該曲線對(duì)在非線性區(qū) 域內(nèi)的樣本微球體進(jìn)行調(diào)整，系統(tǒng)的線性的、可用的測量范圍可被顯著地?cái)U(kuò)展。
在以上描述中，已經(jīng)識(shí)別出若干測量誤差因素(contributor)以及分別針對(duì)它 們的實(shí)時(shí)校正技術(shù)。此外，還創(chuàng)建了一種使用小直徑校準(zhǔn)微球體的實(shí)時(shí)微調(diào)方法， 其中所述的校準(zhǔn)微球體可以被包含于微球體樣本混合物中。微調(diào)過程的附加特征包 括對(duì)系統(tǒng)健康狀態(tài)的實(shí)時(shí)識(shí)別、對(duì)一個(gè)或多個(gè)通道中的非線性的校正、以及對(duì)于測 量系統(tǒng)的可用指示器動(dòng)態(tài)范圍的顯著擴(kuò)展。
執(zhí)行諸如這里所述的方法的程序指令可通過載體介質(zhì)傳送或存儲(chǔ)于載體介質(zhì) 上。載體介質(zhì)可以是諸如導(dǎo)線、電纜、或無線傳輸鏈路、或沿諸如導(dǎo)線、電纜或鏈 路傳播的信號(hào)之類的傳輸介質(zhì)。載體介質(zhì)可以是諸如只讀存儲(chǔ)器、隨機(jī)存取存儲(chǔ)器、 磁盤或光盤、或磁帶之類的存儲(chǔ)介質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施例中，處理器可以被配置為執(zhí)行程序指令以實(shí)行根據(jù)上述實(shí)施例 的由計(jì)算機(jī)所實(shí)現(xiàn)的方法。該處理器可以采取各種形式，包括采用數(shù)字信號(hào)處理芯 片或現(xiàn)場可編程門陣列的專用處理板、個(gè)人計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、大型計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、工作站、 網(wǎng)絡(luò)設(shè)備、因特網(wǎng)設(shè)備、個(gè)人數(shù)字助理(PDA)、電視系統(tǒng)、或者其它設(shè)備。總之， 術(shù)語"計(jì)算機(jī)系統(tǒng)"可以被寬泛地定義為包括具有一個(gè)或多個(gè)數(shù)字信號(hào)處理元件或 者其它處理元件的任何設(shè)備。
程序指令可以以各種方式實(shí)現(xiàn)，包括基于過程的技術(shù)、基于組件的技術(shù)、和/ 或面向?qū)ο蟮募夹g(shù)，以及其它技術(shù)。例如，程序指令可以采用ActiveX控件、C++ 對(duì)象、JavaBeans、 Microsoft Foundation Classes ( "MFC")、或者其它的技術(shù)或方法來按需實(shí)現(xiàn)。在采用FPGA實(shí)現(xiàn)方式時(shí)，可以使用諸如VHDL的高級(jí)語言來 設(shè)計(jì)嵌入于設(shè)備內(nèi)的信號(hào)處理電路。
從本揭示中受益的那些本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到本發(fā)明被確信可以提供
對(duì)流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)進(jìn)行控制的方法。在參考本說明書的情 況下，本發(fā)明的各方面的進(jìn)一步的修改以及替換實(shí)施例對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是 顯而易見的。因此，本說明書要被理解為僅僅是示例性的，其目的在于教示本領(lǐng)域 技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的總方式。應(yīng)該理解的是，此處所示和所述的本發(fā)明的一些形 式是當(dāng)前的優(yōu)選實(shí)施例。在受益于本發(fā)明的說明書的教示之后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員 將理解，此處所提及和描述的元件和材料可以被替換，部件和過程可被保留，而且 本發(fā)明的某些特征可以被單獨(dú)地使用。在不背離如所附的權(quán)利要求書中所描述的本 發(fā)明的精神和范圍的前提下，此處所述的元件可以被改變。
權(quán)利要求
1. 一種用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法，包括在測量系統(tǒng)對(duì)樣本微球體進(jìn)行測量時(shí)，對(duì)所述流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)進(jìn)行監(jiān)測；以及基于所述的監(jiān)測實(shí)時(shí)地改變所述一個(gè)或多個(gè)參數(shù)。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述監(jiān)測包括使用校準(zhǔn)微球體的測量來監(jiān)測所述一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述的校準(zhǔn)微球體的直徑不同于樣本微球體的直徑。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)包括由測 量系統(tǒng)的探測器所產(chǎn)生的輸出信號(hào)，其中所述輸出信號(hào)響應(yīng)于被樣本微球體所散射 的光。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的監(jiān)測包括使用校準(zhǔn)微球體 的測量來監(jiān)測所述一個(gè)或多個(gè)參數(shù)，其中所述的校準(zhǔn)微球體具有不同于樣本微球體 的直徑的直徑，并且至少部分校準(zhǔn)微球體的光譜地址不同。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述一個(gè)或多個(gè)參數(shù)包括測量系 統(tǒng)的動(dòng)態(tài)范圍。
6. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述改變包括擴(kuò)展測量系統(tǒng)的指 示器通道的線性動(dòng)態(tài)范圍。
7. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述一個(gè)或多個(gè)參數(shù)包括測量系 統(tǒng)健康狀態(tài)。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述測量系統(tǒng)健康狀態(tài)包括分類 通道的健康狀態(tài)、指示器通道的健康狀態(tài)、或者二者兼而有之。
9. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)包括樣本 微球體的測量中的線性性。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的測量包括分類通道的測 量、指示器通道的測量、或者二者兼而有之。
11. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述改變包括大致地校正測量 中的任何非線性性。
12. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述一個(gè)或多個(gè)參數(shù)包括測量 系統(tǒng)的雪崩光電二極管的參數(shù)。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，還包括使用經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來確定在 所述改變中所要使用的校正因子。
14. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述一個(gè)或多個(gè)參數(shù)包括測量 系統(tǒng)的光電倍增管的參數(shù)。
15. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述一個(gè)或多個(gè)參數(shù)包括樣本 微球體的速度，且其中所述的監(jiān)測包括監(jiān)測樣本微球體被置于其中的液體的溫度， 并根據(jù)該溫度來確定樣本微球體的速度。
16. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括在對(duì)樣本微球體測量之 前對(duì)所述 一個(gè)或多個(gè)參數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)。
17. —種用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法，包括 對(duì)最接近于所述流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的溫度進(jìn)行監(jiān)測；以及 使用經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)響應(yīng)于所述溫度而改變測量系統(tǒng)的雪崩光電二極管的偏置電壓，從而大致上對(duì)由于溫度所致的雪崩光電二極管的增益變化進(jìn)行校正。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，還包括通過在一個(gè)或多個(gè)溫度下將大致恒定的光級(jí)別施加到雪崩光電二極管上，并將所述光電倍增二極管在所述 一個(gè)或多個(gè)溫度下的多個(gè)偏置電壓記錄下來，從而產(chǎn)生經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
19. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述的改變?cè)跍y量系統(tǒng)進(jìn)行樣 本測量之前進(jìn)行，其中所述偏置電壓在整個(gè)樣本測量過程中大致恒定。
20. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述的監(jiān)測和改變是實(shí)時(shí)進(jìn)行的。
21. 如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，還包括在發(fā)射出已知強(qiáng)度的光 的校準(zhǔn)微球體被測量系統(tǒng)測量的同時(shí)，改變偏置電壓，直至從雪崩光電二極管獲得 了預(yù)定信號(hào)級(jí)別為止。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，還包括根據(jù)雪崩光電二極管的 反向偏置電壓確定雪崩光電二極管的相應(yīng)的相對(duì)電流、在預(yù)定信號(hào)級(jí)別下的偏置電 壓、以及溫度。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，還包括使用所述的相應(yīng)的相對(duì) 電流、溫度、反向偏置電壓、以及經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來確定偏置電壓。
24. —種用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法，包括 對(duì)最接近于所述流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的溫度進(jìn)行監(jiān)測；以及 使用光電倍增管的特征曲線響應(yīng)于所述溫度而改變測量系統(tǒng)的光電倍增管的輸出信號(hào)，從而大致上對(duì)由于溫度所致的光電倍增管的輸出信號(hào)增益的變化進(jìn)行校正。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述的光電倍增管的增益響應(yīng) 于所述溫度作近似線性變化。
26. 如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述光電倍增管是測量系統(tǒng)的指示器通道的一部分。
27. 如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述光電倍增管的特征曲線隨 探測波長以及光電倍增管的陰極結(jié)構(gòu)而變化。
28. —種用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法，包括 將測量系統(tǒng)的光電倍增管的電壓設(shè)置為第一值和第二值； 在所述第一值和第二值下測量光電倍增管的輸出電流；根據(jù)第一值和第二值的對(duì)數(shù)與在第一值和第二值下的輸出電流的對(duì)數(shù)的相對(duì) 關(guān)系來確定光電倍增管的校準(zhǔn)電壓；將該校準(zhǔn)電壓施加到所述光電倍增管；以及測試所述光電倍增管以確定光電倍增管的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)是否在預(yù)定的容差內(nèi)。
29. —種用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法，包括 使用逐次逼近來確定測量系統(tǒng)的探測器的校準(zhǔn)電壓；以及 將校準(zhǔn)電壓施加給探測器。
30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述探測器包括雪崩光電二極管。
31. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述探測器包括光電倍增管。
32. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，還包括將校準(zhǔn)電壓和探測器的 擊穿電壓相比較，并且如果校準(zhǔn)電壓超過擊穿電壓，則重復(fù)所述確定。
33. 如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，還包括收集和處理探測器采樣 以確定探測器信號(hào)級(jí)別。
34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，還包括將探測器信號(hào)級(jí)別和校 準(zhǔn)目標(biāo)信號(hào)級(jí)別相比較，如果探測器信號(hào)級(jí)別高于校準(zhǔn)目標(biāo)信號(hào)級(jí)別，則降低探測器的偏置電壓，并重復(fù)所述確定。
35. 如權(quán)利要求33所述的方法，包括將探測器信號(hào)級(jí)別和校準(zhǔn)目標(biāo)信號(hào)級(jí)別 相比較，如果探測器信號(hào)不在校準(zhǔn)目標(biāo)信號(hào)級(jí)別的預(yù)定范圍內(nèi)，則重復(fù)所述確定， 直至已經(jīng)嘗試了所有期望的探測器電壓級(jí)別為止。
36. —種用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法，包括 對(duì)將要流經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的液體的溫度進(jìn)行監(jiān)測，其中樣本微球體被置于所述液體中；以及根據(jù)在所述溫度下的液體的粘度來確定測量系統(tǒng)中的樣本微球體的速度。
37. 如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，還包括基于速度確定樣本微球 體之一將存在于測量系統(tǒng)的探測窗口內(nèi)的時(shí)間長度。
38. 如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，還包括基于速度確定樣本微球 體之一從測量系統(tǒng)的一個(gè)探測窗口移動(dòng)到測量系統(tǒng)的另一個(gè)探測窗口的時(shí)間長度。
39. 如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，還包括基于速度確定微球體之 一何時(shí)將出現(xiàn)在測量系統(tǒng)的探測窗口中。
40. 如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，還包括控制測量系統(tǒng)的一個(gè)或 多個(gè)探測窗口的采樣間隔從而對(duì)速度進(jìn)行補(bǔ)償。
41. 如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述的監(jiān)測和確定是在測量系 統(tǒng)進(jìn)行樣本微球體的測量之前進(jìn)行的。
42. 如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，還包括根據(jù)速度確定測量系統(tǒng) 的輸出信號(hào)的一個(gè)或多個(gè)特性。
43. 如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，還包括使用校正因子對(duì)輸出信 號(hào)由于速度所致的誤差進(jìn)行校正，其中所述的校正因子采用經(jīng)驗(yàn)測量值來確定。
44. 如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述測量系統(tǒng)被配置為在樣本微球體的測量過程中維持大致恒定的液體壓力。
45. 如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述的確定包括從表來確定速 度，其中該方法還包括基于該速度在樣本微球體的測量過程中控制液體的壓力。
46. 如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述確定包括從泊肅葉等式來 確定速度，其中該方法還包括基于該速度在樣本微球體測量過程中控制液體的壓力。
47. 如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述確定包括根據(jù)速度的預(yù)定 值與溫度的相對(duì)關(guān)系來確定速度，其中該方法還包括基于該速度在樣本微球體測量 過程中控制液體的壓力。
48. —種用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法，包括 對(duì)微球體從流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的第一探測窗口移動(dòng)到該測量系統(tǒng)的第二探測窗口的時(shí)間進(jìn)行測量；以及改變測量系統(tǒng)的施加壓力從而使得所述時(shí)間基本恒定。
49. 如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述時(shí)間包括平均時(shí)間。
50. 如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述微球體包括樣本微球體或者校準(zhǔn)微球體。
51. 如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述測量包括測量在第一和第 二探測窗口內(nèi)被微球體所散射的光。
52. 如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述測量包括用一個(gè)探測器測 量在第 -和第二探測窗口內(nèi)被微球體所散射的光。
53. 如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，在第一和第二探測窗口內(nèi)被微 球體所散射的光被分光器引導(dǎo)給所述一個(gè)探測器。
54. 如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述方法是實(shí)時(shí)進(jìn)行的。
55. —種用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的方法，包括 對(duì)微球體從流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的第一探測窗口移動(dòng)到該測量系統(tǒng)的第二探測窗口的平均時(shí)間進(jìn)行測量；將所述平均時(shí)間和參考時(shí)間相比較，所述參考時(shí)間是參考微球體從所述第一 探測窗口移動(dòng)到所述第二探測窗口的時(shí)間；以及如果平均時(shí)間和參考時(shí)間之間的差大于預(yù)定值，則改變測量系統(tǒng)的施加壓力。
56. 如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述改變包括如果平均時(shí)間 大于參考時(shí)間，則提高施加壓力。
57. 如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述改變包括如果平均時(shí)間 小于參考時(shí)間，則降低施加壓力。
58. 如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述預(yù)定值被選擇為補(bǔ)償測量 系統(tǒng)的已知的時(shí)間變化機(jī)理。
59. 如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述微球體包括樣本微球體、 校準(zhǔn)微球體、或者二者兼而有之。
60. 如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，該方法是實(shí)時(shí)進(jìn)行的。
全文摘要
提供用于控制流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)參數(shù)的各種方法。一個(gè)實(shí)施例包括在對(duì)樣本微球體進(jìn)行測量時(shí)監(jiān)測測量系統(tǒng)的參數(shù)。該方法還包括基于所述的監(jiān)測實(shí)時(shí)地改變所述參數(shù)。另一種方法包括對(duì)最接近于測量系統(tǒng)的溫度進(jìn)行監(jiān)測。一個(gè)這樣的方法包括利用經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)響應(yīng)于所述溫度而改變雪崩光電二極管的偏置電壓。一種不同的此類方法包括利用特征曲線響應(yīng)于所述溫度而改變光電倍增管的輸出。某些方法包括對(duì)將流經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)型測量系統(tǒng)的液體的溫度進(jìn)行監(jiān)測，其中樣本微球體被置于所述液體中。該方法還包括根據(jù)所述溫度下液體的粘度來確定樣本微球體的速度。
文檔編號(hào)G01N15/14GK101460827SQ200480023013
公開日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2004年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者D·E·穆爾, W·D·羅斯 申請(qǐng)人:盧米尼克斯股份有限公司