專(zhuān)利名稱(chēng)：測(cè)定腸炎癥疾病療法功效的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腸炎癥疾病領(lǐng)域，尤其涉及到篩選腸炎癥疾病療法和測(cè)定療法功效的方法。此外，還提供了實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
腸炎癥疾病是一個(gè)綜合術(shù)語(yǔ)，它包括引起腸炎癥的疾病如腸道易激綜合癥(IBS)，和炎癥性腸病(IBD)如慢性胃腸道炎癥潰瘍性結(jié)腸炎和局限性腸炎。例如，潰瘍性結(jié)腸炎是一種IBD，它會(huì)導(dǎo)致大腸粘膜發(fā)炎，該病通常發(fā)生在直腸和結(jié)腸的下端，但可能會(huì)侵襲整個(gè)結(jié)腸。局限性腸炎則可能侵襲胃腸道的任何部分(如口腔、食道、胃、小腸、大腸、直腸和肛門(mén))，并且損害到腸壁的所有結(jié)構(gòu)層。上述疾病中有許多的病因仍是未知的。
IBS是一種以腹痛或腹部不適伴排便習(xí)慣改變和無(wú)規(guī)律排便為特征的腸胃功能性疾病。這些癥狀表明，胃腸道運(yùn)動(dòng)與/或感知功能處在一種異常的狀態(tài)，這可能與社會(huì)心理失調(diào)有關(guān)，它們的相互作用導(dǎo)致胃腸道在幾個(gè)水平上癥狀的出現(xiàn)。
IBS被認(rèn)為是目前最常見(jiàn)的腸胃失調(diào)疾病。在西方國(guó)家的青少年和成人人口中患病率估計(jì)為15％至20％，占腸胃病門(mén)診的20％至50％。
目前對(duì)IBS的治療方法由下列步驟組成鑒定癥狀與綜合征的符合度并排除器質(zhì)性疾病引起相似癥狀的可能性，隨后是非藥物治療，需要時(shí)進(jìn)行藥物治療。目前的藥物治療方法相當(dāng)有限，許多方法的功效未經(jīng)驗(yàn)證。這些方法的基本原理是針對(duì)癥狀進(jìn)行治療，或是調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力，降低內(nèi)臟的敏感性，或是治療相關(guān)的心理失調(diào)，尤其是焦慮和憂(yōu)郁。
IBD最常見(jiàn)的癥狀包括腹痛、里急后重、排便急迫感和出血性腹瀉?；颊呖赡軙?huì)出現(xiàn)感覺(jué)疲勞、體重降低、食欲減退、直腸流血、體液和電解質(zhì)流失等情況。此疾病的癥狀通常是進(jìn)行性的，典型的情況是患者會(huì)經(jīng)歷好轉(zhuǎn)期和隨后的驟然加重期。
盡管IBD發(fā)病率高(估計(jì)僅在美國(guó)就有200萬(wàn)人患此病)，目前對(duì)其仍沒(méi)有有效的治療方法，也不知道其確切的致病原因。治療IBD的常規(guī)方法包括抗炎藥、免疫抑制藥和外科手術(shù)等。然而，治療IBD的許多種藥物有不良的副作用，如引起嘔吐、頭暈、貧血、白血球減少、皮疹和藥物依賴(lài)等，而外科手術(shù)則經(jīng)常采用一些激進(jìn)的方案，如腸切除和結(jié)腸切除等。
這種情況使得一些研究人員嘗試著去開(kāi)發(fā)一些新藥物來(lái)治療腸炎癥疾病。不幸的是，這種疾病的自身性質(zhì)意味著篩選療法和測(cè)量潛在療法對(duì)人體的功效是非常困難的。人體試驗(yàn)的結(jié)果經(jīng)常依賴(lài)于試驗(yàn)對(duì)象的主觀描述，缺少甚至沒(méi)有生物化學(xué)和生理學(xué)的數(shù)據(jù)來(lái)證實(shí)這些證言。雖然可以使用動(dòng)物模型來(lái)從患病器官中獲得組織切片，但是藥物在動(dòng)物模型中的功效和在人體中的功效并不總是相同。
對(duì)炎癥疾病可在多個(gè)水平上進(jìn)行控制?？刂埔蜃影に亍⑶傲邢偎?、活性氧和活性氮介質(zhì)、白三烯素和細(xì)胞因子。細(xì)胞因子是低分子量生物活性蛋白質(zhì)，它參與免疫和炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生和控制。許多種細(xì)胞能生產(chǎn)細(xì)胞因子，其中嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞由于會(huì)在受傷部位大量聚集，是炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子的主要來(lái)源。
發(fā)炎部位產(chǎn)生的細(xì)胞因子通過(guò)多種機(jī)制影響炎癥反應(yīng)。趨化性刺激炎性細(xì)胞向受傷部位聚集，同時(shí)某些特定的細(xì)胞因子促使細(xì)胞滲透入組織。損傷組織內(nèi)釋放的細(xì)胞因子引起炎癥浸潤(rùn)的活化。大多數(shù)細(xì)胞因子是多效性的，表達(dá)多種的、有重疊的生物學(xué)活性。細(xì)胞因子通過(guò)級(jí)聯(lián)和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)控制炎癥反應(yīng)，而不是通過(guò)一種特定的細(xì)胞因子作用于一種特定類(lèi)型的細(xì)胞來(lái)控制。由于不受控制的炎癥反應(yīng)能引起如腸炎癥疾病這樣的疾病，因此有理由認(rèn)為，在這類(lèi)疾病的患者體內(nèi)，細(xì)胞因子的生產(chǎn)出現(xiàn)了錯(cuò)誤。然而，許多種細(xì)胞因子既有促炎癥活性又有抗炎癥活性，因此很難將疾病癥狀歸因于，或是將痊愈原因歸功于某種特定的細(xì)胞因子。
基于以上所述，提供能篩選腸炎癥疾病療法和測(cè)量潛在療法功效的方法是令人期待的，這種方法應(yīng)能在人類(lèi)或是別的哺乳動(dòng)物試驗(yàn)中提供生物化學(xué)或者生理學(xué)的數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)能用來(lái)評(píng)估治療方法的功效。更加令人期待的是，能夠提供測(cè)量與腸炎癥疾病發(fā)病機(jī)制有關(guān)的特定細(xì)胞因子水平變化的方法，使人們能夠?qū)δc炎癥疾病患者的預(yù)后和疾病的發(fā)展進(jìn)行監(jiān)控。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了測(cè)定哺乳動(dòng)物腸炎癥疾病療法功效的體內(nèi)新方法，該方法包括以下步驟a)測(cè)量受試哺乳動(dòng)物生物樣品中至少一種抗炎癥細(xì)胞因子的水平和至少一種促炎癥細(xì)胞因子的水平；b)測(cè)定至少一種抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)至少一種促炎癥細(xì)胞因子的比率；c)實(shí)施所述療法；d)在所述療法實(shí)施后的某一時(shí)間，在所述受試哺乳動(dòng)物的生物樣品中測(cè)量至少一種抗炎癥細(xì)胞因子水平和至少一種促炎癥細(xì)胞因子水平；e)所述療法實(shí)施后，測(cè)定至少一種抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)至少一種促炎癥細(xì)胞因子的比率；其中，如果所述療法實(shí)施后，抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率升高，則指示所述療法能抑制腸炎癥疾病，而如果此比率未發(fā)生變化或是降低，則指示所述療法不能抑制腸炎癥疾病。
此外，本發(fā)明提供了篩選治療腸炎癥疾病的組合物的體外方法，該方法包括以下步驟a)提供包含至少一種腸源性細(xì)胞的生物樣品；b)用該組合物體外處理所述生物樣品；c)組合物處理后某一時(shí)間，測(cè)量生物樣品中至少一種抗炎癥細(xì)胞因子與至少一種促炎癥細(xì)胞因子的水平；d)組合物處理后某一時(shí)間，測(cè)定生物樣品中至少一種抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)至少一種促炎癥細(xì)胞因子的比率；特征在于，如果組合物處理過(guò)的生物樣品經(jīng)步驟(d)測(cè)得的比率顯著地高于在未經(jīng)組合物處理的對(duì)照樣品中同時(shí)測(cè)得的比率，則指示該組合物是腸炎癥疾病的抑制劑，而如果該比率與未經(jīng)處理的對(duì)照樣品中同時(shí)測(cè)得的比率相同或是更低，則指示該組合物不是腸炎癥疾病的抑制劑。
本發(fā)明也涉及提供本文所述方法的更廣泛的應(yīng)用和實(shí)施本文所述方法的試劑盒。
附圖概述

圖1是一幅條線(xiàn)圖，顯示IBS患者喂食嬰兒雙岐桿菌前后經(jīng)體外刺激的外周血單核細(xì)胞(PBMC)中產(chǎn)生的IL-10對(duì)IL-12的平均比率。
圖2是一幅條線(xiàn)圖，顯示IBS患者喂食嬰兒雙岐桿菌前后經(jīng)體外刺激的外周血單核細(xì)胞(PBMC)中產(chǎn)生的IL-10對(duì)TNF-α的平均比率。
圖3是一幅條線(xiàn)圖，顯示IBS患者喂食嬰兒雙岐桿菌前后經(jīng)體外刺激的外周血單核細(xì)胞(PBMC)中產(chǎn)生的IL-10對(duì)IFN-γ的平均比率。
表1顯示在喂食嬰兒雙歧桿菌的IBS患者中的IL-10對(duì)IL-12比率的變化和腹部疼痛/不適指數(shù)變化之間的負(fù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)的Pearson線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)和p值。注意患者喂食嬰兒雙歧桿菌前后，其平均IL-10對(duì)IL-12比率升高了，而平均腹部疼痛/不適指數(shù)下降了。
圖4是一幅條線(xiàn)圖，顯示經(jīng)體外刺激的腸系膜淋巴細(xì)胞(MLNC)中產(chǎn)生的抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率。
圖5是一幅條線(xiàn)圖，顯示經(jīng)體外刺激的腸道黏膜集合淋巴結(jié)細(xì)胞(PP)中產(chǎn)生的抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率。
圖6是一幅條線(xiàn)圖，顯示經(jīng)體外刺激的腸系膜淋巴細(xì)胞源的樹(shù)突細(xì)胞(MLNC DC)中產(chǎn)生的抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率。
發(fā)明詳述除非另外指明，本文中組合物整體的所有重量、尺寸和濃度都在25℃進(jìn)行測(cè)量。
除非另外指明，本文中所有組合物的百分比均為重量百分比，所有的比率均為重量比。
除非另外指明，所有分子量均為重均分子量。
除非另外指明，本文中所有參考文獻(xiàn)的內(nèi)容均全文引入本文以供參考。
除了一些給出實(shí)際測(cè)量值的特別實(shí)施例之外，本文參考的數(shù)值均應(yīng)被認(rèn)為是“近似值”。
本文中，“腸炎癥疾病”包括“腸道易激綜合癥(IBS)”和“炎癥性腸病(IBD)”。
本文中，“炎癥性腸病(IBD)”包括引起腸炎癥的疾病，如潰瘍性結(jié)腸炎和局限性腸炎。
方法和用途本發(fā)明涉及到提供測(cè)定哺乳動(dòng)物腸炎癥疾病療法功效的體內(nèi)方法，包括以下步驟a)測(cè)量受試哺乳動(dòng)物生物樣品中至少一種抗炎癥細(xì)胞因子水平和至少一種促炎癥細(xì)胞因子的水平；b)測(cè)定至少一種抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)至少一種促炎癥細(xì)胞因子的比率；c)實(shí)施所述療法；d)在所述療法實(shí)施后的某一時(shí)間，在所述哺乳動(dòng)物的生物樣品中測(cè)量至少一種抗炎癥細(xì)胞因子水平和至少一種促炎癥細(xì)胞因子水平；e)所述療法實(shí)施后，測(cè)定至少一種抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)至少一種促炎癥細(xì)胞因子的比率；其中，如果所述療法實(shí)施后抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率升高，則指示所述療法能抑制腸炎癥疾病，而如果此比率未發(fā)生變化或是降低，則指示所述療法不能抑制腸炎癥疾病。本發(fā)明所述的方法包括在療法實(shí)施前測(cè)量和測(cè)定至少一種抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)至少一種促炎癥細(xì)胞因子的比率。這可以包括在治療實(shí)施前測(cè)定至少一次細(xì)胞因子的水平和比率，理想的時(shí)間是第0天，即測(cè)定后立即實(shí)施治療。作為選擇方案之一，所述細(xì)胞因子的水平和比率也可以在治療實(shí)施前的一段給定時(shí)間里重復(fù)測(cè)定，以提供本領(lǐng)域的技術(shù)人員所共知的測(cè)量基準(zhǔn)。本發(fā)明的方法還包括，在所述治療實(shí)施后，在相近的時(shí)間點(diǎn)重復(fù)步驟(d)和(e)至少一次。此外，本發(fā)明的方法還包括，對(duì)所述受試哺乳動(dòng)物實(shí)施治療的同時(shí)，在相近的時(shí)間點(diǎn)重復(fù)步驟(d)和(e)至少一次。本發(fā)明的方法可用于篩選和臨床上評(píng)價(jià)未知的、新的療法或組合物對(duì)腸炎癥疾病的療效。此外，本發(fā)明的方法也可用于檢驗(yàn)已知療法對(duì)個(gè)體腸炎癥疾病患者的療效。另外，本發(fā)明的方法還可用以提供一種用于腸炎癥疾病、有助于對(duì)該病進(jìn)行診斷的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物。此外，本發(fā)明提供了篩選治療腸炎癥疾病的組合物的體外方法，該方法包括以下步驟a)提供包含至少一種腸源性細(xì)胞的生物樣品；b)用所述組合物體外處理所述生物樣品；c)組合物處理后某一時(shí)間測(cè)量生物樣品中至少一種抗炎癥細(xì)胞因子和至少一種促炎癥細(xì)胞因子的水平；d)組合物處理后某一時(shí)間測(cè)定生物樣品中至少一種抗炎癥細(xì)胞因子與至少一種促炎癥細(xì)胞因子的比率；特征在于，如果步驟(d)在處理后的生物樣品中測(cè)得的比率高于在未經(jīng)組合物處理的對(duì)照樣品中同時(shí)測(cè)得的比率，則指示該組合物能抑制腸炎癥疾病，而如果該比率與未經(jīng)處理的對(duì)照樣品中同時(shí)測(cè)得的比率相同或是更低，則指示該組合物不能抑制腸炎癥疾病。
本文中方法適合應(yīng)用于篩選和測(cè)定治療腸炎癥疾病的療法和組合物的臨床功效。腸炎癥疾病包括炎癥性腸胃失調(diào)和其他一些非限定的疾病，后者包括腸道易激綜合癥(IBS)和諸如潰瘍性結(jié)腸炎和局限性腸炎這樣的炎癥性腸病(IBD)。本文中方法優(yōu)選用于測(cè)定腸道易激綜合癥(IBS)療法的功效。
本文中方法包括任何用于治療腸炎癥疾病的療法和/或組合物。組合物可能包含一種或多種需要測(cè)定其療效的成分，這些成分對(duì)腸炎癥疾病，優(yōu)選腸道易激綜合癥(IBS)，有潛在的療效。組合物非限定的實(shí)施例包括抗炎癥藥物、益生菌組合物、未知是否對(duì)腸炎癥疾病有療效的新組合物和化合物、已知的能減輕腸炎癥疾病癥狀的組合物與化合物和它們的新給藥形式，以及上述組合物的混合物。
本發(fā)明的體內(nèi)方法也用于測(cè)定個(gè)體腸炎癥疾病患者對(duì)治療所用組合物的反應(yīng)。這使得個(gè)體腸炎癥疾病患者所接受的一種特定療法的療效能夠得到測(cè)定，從而使醫(yī)生能夠監(jiān)控患者的病情發(fā)展并決定是否改變藥物或是給藥形式，以使對(duì)患者的治療最優(yōu)化。這將令患者得到更好的治療，并將減少將治療方法應(yīng)用于對(duì)其不敏感的腸炎癥疾病患患者群所引起的藥品和金錢(qián)的浪費(fèi)。
用于體內(nèi)方法的生物樣品本發(fā)明的方法包括在所述療法實(shí)施前與實(shí)施中或?qū)嵤┖蠓謩e測(cè)量從受試哺乳動(dòng)物獲得的生物樣品的細(xì)胞因子水平。適用于本文的受試哺乳動(dòng)物非限定的實(shí)施例包括人、類(lèi)人猿、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、牛、綿羊、豬、嚙齒動(dòng)物包括鼠科動(dòng)物和大鼠、兔或馬，優(yōu)選人。本文使用的生物樣品是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。本文所用的“生物樣品”包括尿、血漿、血清、唾液、組織切片、腦脊液、體外刺激的外周血單核細(xì)胞、未經(jīng)體外刺激的外周血單核細(xì)胞、體外刺激的腸淋巴組織、未經(jīng)體外刺激的腸淋巴組織、腸灌洗液，以及上述樣品的混合物。本發(fā)明體內(nèi)方法所用的優(yōu)選生物樣品包括血清、組織切片、體外刺激的外周血單核細(xì)胞、未經(jīng)體外刺激的外周血單核細(xì)胞，以及它們的混合物，更優(yōu)選體外刺激的外周血單核細(xì)胞、未經(jīng)體外刺激的外周血單核細(xì)胞，以及它們的混合物。外周血單核細(xì)胞(PBMC)可以通過(guò)一些本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法，如Ficoll-Hypaque密度離心法，由經(jīng)EDTA處理的未凝結(jié)的靜脈血液獲得。還更優(yōu)選地，本發(fā)明的體內(nèi)方法利用的是包含體外刺激的外周血單核細(xì)胞的生物樣品。本文所用的經(jīng)或未經(jīng)體外刺激的“外周血單核細(xì)胞”術(shù)語(yǔ)，包括新鮮采集的PBMC、新鮮采集的PBMC的全細(xì)胞勻漿、從新鮮采集的PBMC中提取的蛋白質(zhì)組分、從新鮮采集的PBMC中提取的mRNA、新鮮采集的PBMC的組織培養(yǎng)上清液、冷凍PBMC、冷凍PBMC的全細(xì)胞勻漿、冷凍PBMC中提取的蛋白質(zhì)組分、冷凍PBMC中提取的mRNA、冷凍PBMC的組織培養(yǎng)上清液、采集的PBMC的體外培養(yǎng)物、采集的PBMC的體外培養(yǎng)物的全細(xì)胞勻漿、采集的PBMC的體外培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì)組分、采集的PBMC的體外培養(yǎng)物中提取的mRNA、采集的PBMC的體外培養(yǎng)物的組織培養(yǎng)上清液，以及它們的混合物。
本文所用“體外刺激”術(shù)語(yǔ)包括在供體體外對(duì)生物樣品進(jìn)行刺激，典型的是在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的組織培養(yǎng)裝置中。優(yōu)選的刺激物包括有絲分裂原、益生菌、本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的抗CD3分子，以及它們的混合物。更優(yōu)選地，刺激物包括有絲分裂原、益生菌，以及它們的混合物。
本文中，“有絲分裂原”包括能以高的比例誘導(dǎo)T細(xì)胞或者B細(xì)胞分裂的物質(zhì)。本文所用的有絲分裂原包括外源凝集素、細(xì)菌脂多糖、超級(jí)抗原，以及它們的混合物。本文所用術(shù)語(yǔ)“超級(jí)抗原”包括這樣的物質(zhì)甚至當(dāng)T細(xì)胞受體不能識(shí)別結(jié)合到MHC II類(lèi)分子上的抗原肽時(shí)，它們也能結(jié)合到T細(xì)胞受體的V區(qū)(可變區(qū))殘基上，并能結(jié)合到抗原結(jié)合槽外面的MHC II類(lèi)分子的殘基上。本文所述的超級(jí)抗原的適當(dāng)實(shí)施例包括葡萄球菌腸毒素、毒素性休克綜合癥毒素-1，以及它們的混合物。優(yōu)選地，有絲分裂素包括外源凝集素、細(xì)菌脂多糖，以及它們的混合物。本文所述的外源凝集素的適當(dāng)實(shí)施例包括伴刀豆球蛋白A(來(lái)源于刀豆)、植物血球凝集素(來(lái)源于菜豆)、美洲商陸有絲分裂原(來(lái)源于美洲商陸)，以及它們的混合物，其中優(yōu)選植物血球凝集素(PHA)。本文中所述的細(xì)菌脂多糖的適當(dāng)實(shí)施例包括大腸桿菌(E.coli)O111:B4、E.coli O55:B5、E.coli K-235(均購(gòu)自Sigma(St Louis，MO))、明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、弗氏志賀菌、肺炎克魯伯氏菌、銅綠假單胞菌，以及它們的混合物。
益生菌是指對(duì)宿主有益的微生物或經(jīng)加工后的微生物組合物。益生菌有益于宿主的機(jī)理目前仍然未知。除非另外指明，本發(fā)明中所述的“益生菌”還包括微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的代謝物。這些代謝物或者被釋放到發(fā)酵培養(yǎng)基中，或者儲(chǔ)存于微生物體內(nèi)。本文中所用的“益生菌”術(shù)語(yǔ)還包括用在治療劑中時(shí)能對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的細(xì)菌、細(xì)菌勻漿、細(xì)菌蛋白、細(xì)菌提取物、細(xì)菌上清液，以及它們的混合物。因此，益生菌可包括酵母菌、霉菌和細(xì)菌。EP 0862863列出了一些當(dāng)前已知的益生菌。本文使述的益生菌的適當(dāng)實(shí)施例包括如下菌株嬰兒長(zhǎng)雙歧桿菌(NCIMB 35624)、約氏乳桿菌(CNCM I-1225)、乳酸雙歧桿菌(DSM20215)、乳酸乳桿菌(CNCM I-2216)，以及它們的混合物。本文中更多非限定的適用的益生菌參見(jiàn)WO 03/010297 A1，WO 03/010298 A1，WO 03/010299 A1(均公布于2003年2月6日并轉(zhuǎn)讓給了Alimentary Health Ltd.)。
用于體外方法的生物樣品本發(fā)明的體外方法利用包含至少一種腸源性細(xì)胞的生物樣品。使用腸源性細(xì)胞的體外方法已被發(fā)現(xiàn)優(yōu)于以前所用的、使用別的組織如外周血單核細(xì)胞的體外方法。不受理論的約束，這種情況被認(rèn)為是由兩方面的相互作用造成治療腸炎癥疾病的組合物經(jīng)過(guò)了篩選并且腸更能指示體內(nèi)的正在發(fā)生的事件。本文的體外篩選方法被發(fā)現(xiàn)更易于識(shí)別潛在的腸炎癥疾病療法，并且與臨床療效有更好的相關(guān)性。不受理論的約束，這種情況被認(rèn)為是由于在腸炎癥疾病中，腸組織對(duì)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)起主要作用，因而那些在體外能有益地改變腸源性細(xì)胞中細(xì)胞因子比率的組合物在體內(nèi)有療效的可能性更高。
本文中所用“腸源性細(xì)胞”術(shù)語(yǔ)包括來(lái)源于哺乳動(dòng)物的腸或是腸相關(guān)組織的各類(lèi)型細(xì)胞和細(xì)胞株，所述的相關(guān)組織包括胃、十二指腸、空腸、回腸、淋巴組織、腸系膜、腋窩、腹股溝、腿彎部、骨髓、盲腸、結(jié)腸、闌尾和直腸。此外，這些細(xì)胞類(lèi)型也包括從所述組織中新鮮提取的細(xì)胞和提取后在體外經(jīng)過(guò)了常規(guī)培養(yǎng)的各類(lèi)型細(xì)胞，后者包括非永生細(xì)胞系和致癌永生細(xì)胞系。優(yōu)選地，體外方法利用的生物樣品包括新鮮提取的或是對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)得到的腸相關(guān)的淋巴組織。更優(yōu)選地，生物樣品包括新鮮提取的或是對(duì)其進(jìn)行體外培養(yǎng)得到的腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞。
此外，本發(fā)明的體外方法另外還包括在上述步驟(c)之前刺激生物樣品的步驟。本文中所用“體外刺激”術(shù)語(yǔ)包括在取樣對(duì)象的身體以外刺激生物樣品，典型的是在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)裝置中。優(yōu)選地，刺激物包括有絲分裂原、益生菌、本領(lǐng)域研究人員所知的抗CD-3分子，以及它們的混合物。更優(yōu)選地，刺激物包括有絲分裂原、益生菌，以及它們的混合物。
本文中的“有絲分裂原”包括能以高的比例誘導(dǎo)T細(xì)胞或B細(xì)胞分裂的物質(zhì)。本文中使用的有絲分裂原包括外源凝集素、細(xì)菌脂多糖、超級(jí)抗原，以及它們的混合物。本文中所用的“超級(jí)抗原”術(shù)語(yǔ)包括這樣的物質(zhì)甚至當(dāng)T細(xì)胞受體不能識(shí)別結(jié)合到MHC II類(lèi)分子上的抗原肽時(shí)，它們也能結(jié)合到T細(xì)胞受體的V區(qū)(可變區(qū))殘基上，并能結(jié)合到抗原結(jié)合槽外面的MHC II類(lèi)分子的殘基上。本文中所述的超級(jí)抗原的適當(dāng)實(shí)施例包括葡萄球菌腸毒素、毒素性休克綜合癥毒素-1，以及它們的混合物。優(yōu)選地，有絲分裂原包括外源凝集素、細(xì)菌脂多糖，以及它們的混合物。本文所述的外源凝集素的適當(dāng)實(shí)施例包括伴刀豆球蛋白A(來(lái)源于刀豆)、植物血球凝集素(來(lái)源于菜豆)、美洲商陸有絲分裂原(來(lái)源于美洲商陸)，以及它們的混合物，優(yōu)選植物血球凝集素(PHA)。本文中所述的細(xì)菌脂多糖的適當(dāng)實(shí)施例包括E.coli O111:B4、E.coli O55:B5、E.coli K-235(均購(gòu)自Sigma(St Louis，MO))、明尼蘇達(dá)沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、弗氏志賀菌、肺炎克魯伯氏菌、銅綠假單胞菌，以及它們的混合物。
益生菌是指對(duì)宿主有益的微生物或經(jīng)加工后的微生物組合物。益生菌有益于宿主的機(jī)理目前仍然未知。除非另外指明，本發(fā)明中所述的“益生菌”還包括微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的代謝物。這些代謝物或者被釋放到發(fā)酵培養(yǎng)基中，或者儲(chǔ)存于微生物體內(nèi)。本文中所用的“益生菌”術(shù)語(yǔ)還包括用在治療劑中時(shí)能對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的細(xì)菌、細(xì)菌勻漿、細(xì)菌蛋白、細(xì)菌提取物、細(xì)菌上清液，以及它們的混合物。因此，益生菌可包括酵母菌、霉菌和細(xì)菌。EP 0862863列出了一些當(dāng)前已知的益生菌。本文中所述的益生菌的適當(dāng)實(shí)施例包括如下菌株嬰兒長(zhǎng)雙歧桿菌(NCIMB35624)、約氏乳桿菌(CNCM I-1225)、乳酸雙歧桿菌(DSM20215、乳酸乳桿菌(CNCM I-2216)，以及它們的混合物。本文中更多非限定的適用的益生菌，參見(jiàn)WO 03/010297 A1，WO 03/010298 A1，WO 03/010299 A1(均公布于2003年2月6日并轉(zhuǎn)讓給了Alimentary Health Ltd.)。
細(xì)胞因子本發(fā)明的方法包括測(cè)量從受試哺乳動(dòng)物獲得的生物樣品中至少一種抗炎癥細(xì)胞因子和至少一種促炎癥細(xì)胞因子的水平的步驟。在體內(nèi)方法中，所述的樣品在用待測(cè)組合物處理前和處理后都進(jìn)行收集。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，細(xì)胞因子是多效性的并表達(dá)多種的、有重疊的生物學(xué)活性。相應(yīng)地，也應(yīng)該懂得雖然本文中使用的細(xì)胞因子根據(jù)當(dāng)前系統(tǒng)中各自的炎癥反應(yīng)進(jìn)行分類(lèi)，一些細(xì)胞因子能在某些病例中導(dǎo)致多于一種免疫反應(yīng)的發(fā)生。因此，本文中的分類(lèi)法是為了方便起見(jiàn)。
本發(fā)明使用的抗炎癥細(xì)胞因子包括本領(lǐng)域已知的所有抗炎癥細(xì)胞因子。本文中所述的抗炎癥細(xì)胞因子的適當(dāng)實(shí)施例包括白介素-4、白介素-5、白介素-13、白介素-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，以及它們的混合物。本發(fā)明中優(yōu)選的抗炎癥細(xì)胞因子包括白介素-10(IL-10入藏號(hào)碼CAA55201；GI收錄ID14625940))，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β異構(gòu)體1，2，3 and 4，以及它們的混合物。本發(fā)明使用的促炎癥細(xì)胞因子包括本領(lǐng)域已知的所有促炎癥細(xì)胞因子。本文中所述的促炎癥細(xì)胞因子的適當(dāng)實(shí)施例包括白介素-2、異二聚體白介素-12、腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β、干擾素-γ，以及它們的混合物。本文中優(yōu)選的促炎癥細(xì)胞因子包括異二聚體白介素-12(IL-12入藏號(hào)碼chain A；1F45A，chain B；1F45B；GI收錄IDchain A；1479640；chain B；1479641)、腫瘤壞死因子-α(TNF入藏號(hào)碼AAC03542；GI收錄ID2905634)、干擾素-γ(INF入藏號(hào)碼NP_000610；GI收錄ID10835171)，以及它們的混合物。
測(cè)量細(xì)胞因子水平的方法根據(jù)本發(fā)明的方法，需測(cè)量生物樣品中至少一種抗炎癥細(xì)胞因子和至少一種促炎癥細(xì)胞因子的水平。測(cè)量抗炎癥細(xì)胞因子水平或者促炎癥細(xì)胞因子水平或者對(duì)二者均進(jìn)行測(cè)量的方法包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的所有方法。測(cè)量所述的抗炎癥細(xì)胞因子和促炎癥細(xì)胞因子的水平能通過(guò)測(cè)量mRNA的表達(dá)或是蛋白質(zhì)的表達(dá)來(lái)進(jìn)行，這一點(diǎn)已經(jīng)為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。這些方法的非限定性的實(shí)施例包括免疫吸附法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、基于微陣列平臺(tái)的多重ELISA、編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA、生物測(cè)定法、Westernblots、色譜分離系統(tǒng)、RT-PCR、競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR、Northern blots、基因芯片、mRNA直接測(cè)量法以及上述方法的聯(lián)合使用。優(yōu)選酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA、色譜分離系統(tǒng)、Western blots以及這些方法的聯(lián)合使用。更優(yōu)選的方法包括編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA。本發(fā)明適用的ELISA方法包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的所有方法，非限定性的實(shí)施例包括直接ELTSA、間接ELISA、直接夾心ELISA、間接夾心ELISA以及這些方法的聯(lián)合使用。本文使用的編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA的一個(gè)非限定的、有可用商品的實(shí)施例，是LINCOplex分析試劑盒(購(gòu)自Linco Research Inc.，Missouri，USA)聯(lián)合BIOPLEXBEAD FLOW CYTOMETERTM(購(gòu)自Bio Rad GmbH)一起使用。
比率本發(fā)明的方法包括測(cè)定至少一種抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)至少一種促炎癥細(xì)胞因子的比率的步驟。在體內(nèi)方法中，細(xì)胞因子的水平在治療實(shí)施前與實(shí)施中或?qū)嵤┖蠖歼M(jìn)行測(cè)定。在體外方法中，在經(jīng)處理的生物樣品中測(cè)定至少一種抗炎癥細(xì)胞因子和至少一種促炎癥細(xì)胞因子的水平，同時(shí)在未經(jīng)處理的對(duì)照樣品中進(jìn)行同樣的測(cè)定。對(duì)照樣品的來(lái)源和處理組中使用的生物樣品必須相同，并且必須使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法和原則進(jìn)行對(duì)照處理。本文中所述的抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率，意思是抗炎癥細(xì)胞因子的水平除以促炎癥細(xì)胞因子的水平，公式表達(dá)如下 不受理論的約束，據(jù)信根據(jù)本發(fā)明，如果在治療后或治療過(guò)程中測(cè)定的比率同治療前或是未處理的對(duì)照樣品中測(cè)定的比率相比出現(xiàn)升高的情況，則這種療法被認(rèn)為能抑制腸炎癥疾病。本文中所述的比率可通過(guò)測(cè)定本文所述的任何抗炎癥細(xì)胞因子和促炎癥細(xì)胞因子來(lái)得到。優(yōu)選地，本文所述的比率包括IL-10/IL-12的比率、IL-10/IFN-γ的比率、IL-10/TNF-α的比率，以及它們的組合。不受理論的約束，據(jù)信本文所述的特定比率對(duì)腸炎癥疾病的發(fā)展和緩解來(lái)說(shuō)是關(guān)鍵的，因而本文所述比率的變化，對(duì)所研究的療法究竟是促進(jìn)還是抑制疾病的發(fā)展起指示性作用。腸炎癥疾病患者似乎有細(xì)胞因子分布偏移的現(xiàn)象，這是炎癥的指示性特征。相似地，本文所用的在腸炎癥疾病抑制劑處理后水平呈現(xiàn)最大變化的細(xì)胞因子指示，患者的PBMC向有更大的Th-1活性偏移，從而改變了正常的Th-1/Th-2平衡。令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是，通過(guò)提高本文所述的比率，腸炎癥疾病的癥狀可以得到減輕。不受理論的約束，據(jù)信這是由于通過(guò)提高本文所述的比率，治療能使腸炎癥疾病患者的該比率返回到或是接近于健康受試者的比率。
試劑盒本發(fā)明提供實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。優(yōu)選地，試劑盒包括第一測(cè)量單元或系統(tǒng)，用于在治療前和治療中或治療后的至少一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，各測(cè)量受試哺乳動(dòng)物生物樣品中的至少一種抗炎癥細(xì)胞因子，試劑盒還包括第二測(cè)量單元或系統(tǒng)，用于在治療前和治療中或治療后的至少一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，各測(cè)量受試哺乳動(dòng)物生物樣品中的至少一種促炎癥細(xì)胞因子，這樣即可測(cè)定抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率在治療前后的變化。這些測(cè)量單元或系統(tǒng)包括所有為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的測(cè)量單元或系統(tǒng)，非限定性的實(shí)施例包括免疫吸附法、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、基于微陣列平臺(tái)的多重ELISA、編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA、生物測(cè)定法、Western blots、色譜分離系統(tǒng)、RT-PCR、競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR、Northern blots、基因芯片、mRNA直接測(cè)量法以及上述方法的聯(lián)合使用，優(yōu)選ELISA、RIA、編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA、Western blots、色譜分離系統(tǒng)、直接測(cè)量法以及上述方法的聯(lián)合使用，更優(yōu)選編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA。本發(fā)明的試劑盒可以進(jìn)一步包括從受試對(duì)象獲取生物樣品的方法和設(shè)備。這些方法和設(shè)備可包括靜脈血液采集管和采集上述血液所需設(shè)備、尿或唾液采樣管、從靜脈血液中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)的方法以及上述方法設(shè)備的聯(lián)合使用。
此外，本發(fā)明的試劑盒還可以包括使用說(shuō)明書(shū)。使用說(shuō)明書(shū)可以包括說(shuō)明如何根據(jù)本發(fā)明測(cè)定比率的內(nèi)容，和/或指示根據(jù)方法獲得的結(jié)果有何意義的內(nèi)容。關(guān)于使用說(shuō)明書(shū)的一個(gè)非限定的實(shí)施例包括說(shuō)明抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率增高指示此療法抑制了腸炎癥疾病的內(nèi)容。
實(shí)施例體內(nèi)方法給10名健康的成年人和13名自報(bào)到的腸道易激綜合癥(IBS)患者每日喂食100ml益生菌乳制劑，制劑中含濃度為108CFU/ml的嬰兒雙歧桿菌35624(一種潛在的IBS治療物質(zhì))，持續(xù)三個(gè)星期。在治療實(shí)施前和實(shí)施后分別從每位受試者體內(nèi)抽取靜脈血。將靜脈血收集進(jìn)血液采集管(CPTMVACUTAINER細(xì)胞分離管，含有肝素鈉，Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)。外周血單核細(xì)胞(PBMC)隨后通過(guò)400xg離心從血液中分離出來(lái)，而后在本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的適宜細(xì)胞培養(yǎng)條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)。本文中所有的細(xì)胞培養(yǎng)均使用含有100U/ml的青霉素G/100μg/ml鏈霉素(Gibco)、2.5μg/ml兩性霉素B(Gibco)、292μg/ml L-谷氨酸鹽(Gibco)和10％胎牛血清(#1103155，Gibco)的Dulbecco的基本培養(yǎng)基(DMEM)，但在測(cè)量TGF-β時(shí)不使用胎牛血清。分離出的PBMC混懸液稀釋至活細(xì)胞量為1.3×106/ml，然后進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)(無(wú)刺激物)或者和0.1μg/ml E.coli O111B4脂多糖(Sigma，StLouis，MO)、1μg/ml植物血球凝集素(PHA-Sigma，St Louis，MO)或107CFU/ml的完整嬰兒雙歧桿菌35624共同培養(yǎng)3天。隨后將細(xì)胞上清液收集進(jìn)離心管，在MRX-152離心機(jī)(Tomy Tech，Palo Alto，CA)中4℃，10 000rpm離心3分鐘。取上清液進(jìn)行分析。
上清液中的細(xì)胞因子數(shù)量使用LINCOplex分析試劑盒(購(gòu)自LincoResearch Inc.，Missouri，US)在BIOPLEX BEAD FLOW CYTOMETERTM(Bio Rad，Hercules，CA)中進(jìn)行分析。25μl上清液在微球板中進(jìn)行孵育，微球表面有細(xì)胞因子如白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、腫瘤壞死因子-α(TNF)、干擾素-γ(INF)和轉(zhuǎn)化增長(zhǎng)因子-β(TGF)的特異性抗體涂層(LINCOplex分析試劑盒，購(gòu)自LincoResearch Inc.，Missouri，US)。清洗過(guò)的微球混合物同鏈霉親和素-藻紅蛋白室溫共孵育30分鐘。同時(shí)已進(jìn)行過(guò)梯度稀釋的對(duì)照樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品也照上述步驟進(jìn)行孵育。清洗過(guò)的微球混懸液用緩沖液重懸，用BIOPLEX系統(tǒng)進(jìn)行讀數(shù)。細(xì)胞因子水平計(jì)量單位為pg/ml。細(xì)胞因子水平。用Student的配對(duì)t-test統(tǒng)計(jì)分析普通人群和喂食人群細(xì)胞因子的水平和喂食的效果。
每日喂食益生素嬰兒雙歧桿菌35624三個(gè)星期后，在IBS患者經(jīng)嬰兒雙歧桿菌35624體外刺激的PBMC細(xì)胞中，IL-10/IL-12比率從11.2±3.9(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)升高到了409.5±95.2。相似地，用別的益生菌如乳酸菌299V和乳酸菌GG對(duì)患者的PBMC細(xì)胞進(jìn)行體外刺激，也能觀察到IL-10/IL-12比率相似程度的升高(見(jiàn)圖1)。
此外，喂食后的IBS患者的PBMC經(jīng)益生菌(雙歧桿菌)刺激后，IL-10/TNF-α的比率出現(xiàn)了從0.1±0.0到2.0±0.5的增長(zhǎng)；在別的益生菌如乳酸菌4331和乳酸菌299V進(jìn)行刺激后也能觀察到類(lèi)似的結(jié)果(見(jiàn)圖2)。同樣地，喂食后嬰兒雙歧桿菌35624的刺激也能引起IL-10/IFN-γ比率從0.7±0.1增長(zhǎng)到14.1±2.3(見(jiàn)圖3)。
此外，喂食嬰兒雙歧桿菌的IBS患者的平均腹部疼痛/不適程度下降了，而平均IL-10/IL-12比率則升高了。這種腹部疼痛/不適變化趨勢(shì)和IL-10/IL-12比率變化趨勢(shì)的負(fù)相關(guān)現(xiàn)象指示了IL-10/IL-12比率的升高是和腹部疼痛/不適這一IBS癥狀的減輕相關(guān)聯(lián)的(見(jiàn)表1)。
體外方法本研究經(jīng)Cork University Hospital的道德委員會(huì)批準(zhǔn)。腸系膜淋巴結(jié)取自10名IBD患者(n＝10年齡19至41歲(平均32.2歲)，3女7男5名患CD；5名患UC)。所有患者均正在服用5′-氨基水楊酸。所有患者均因?yàn)椴∏閻夯皖?lèi)固醇反應(yīng)失敗而需要進(jìn)行外科切除手術(shù)。外周血單核細(xì)胞(PBMC)來(lái)自于腸炎癥疾病患者(n＝12)。年齡范圍是20至51歲(平均28歲)。5女7男，5名患CD；7名患UC。
腸系膜淋巴細(xì)胞(MLNC)的提取選擇腸系膜淋巴結(jié)(MLN)用于本研究是因?yàn)樽屑?xì)考慮到其解剖學(xué)位置與腸炎癥區(qū)域有關(guān)。所選的腸系膜淋巴結(jié)直接對(duì)腸炎癥區(qū)域?qū)Я?。就本組中所研究的3名患者來(lái)看，獲得MLN排出的發(fā)炎的和未發(fā)炎的腸片斷是可能的。MLN單細(xì)胞懸浮液通過(guò)將組織輕柔的推過(guò)一個(gè)網(wǎng)眼孔徑180μ的金屬網(wǎng)線(xiàn)篩而獲得。細(xì)胞經(jīng)清洗后再次懸浮在含有10％FCS(Invitrogen，Paisley，UK)的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco的改良細(xì)胞培養(yǎng)基)中。單細(xì)胞通過(guò)Ficoll-Hypaque密度離心進(jìn)行分離，并用含有25mM葡萄糖，10％FCS，1％非必需氨基酸，50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基(Invitrogen，Paisley，UK)重懸，細(xì)胞濃度為1×106cell/ml。這些單細(xì)胞定義為腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞。
樹(shù)突細(xì)胞提取來(lái)自腸系膜淋巴結(jié)和外周血液的樹(shù)突細(xì)胞(DC)通過(guò)同樣的程序進(jìn)行分離。細(xì)胞以5×107cell/ml的濃度重懸在含4％FCS的PBS(無(wú)Ca2+或Mg2+)中。為使DC活力得到最佳的恢復(fù)，所有培養(yǎng)基中加入1mM EDTA，且細(xì)胞懸浮液加入抗-CD32抗體(StemCell，Meylan，F(xiàn)rance)進(jìn)行封閉。根據(jù)制造商的操作規(guī)程，使用一個(gè)DC陰性提取試劑盒(StemSepTMdepletion cocktail，StemCell，Meylan，F(xiàn)rance)，從該細(xì)胞混懸液中分離DC。DC被重懸在Stemspan無(wú)血清培養(yǎng)基中(StemCell，Meylan，F(xiàn)rance)，細(xì)胞濃度為1×106cell/ml。其通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色排除法(trypan blue exclusion)測(cè)定的成活力始終不低于98％。所制備DC的純度通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行估定。HLA-DR陽(yáng)性的和CD3/CD14/CD16/CD19/CD20/CD56陰性的細(xì)胞定義為樹(shù)突細(xì)胞。所有抗體均購(gòu)自BD Biosciences(Oxford，UK)。
菌株我們以前報(bào)道過(guò)對(duì)唾液乳桿菌UCC118(L.salivarius)和嬰兒雙歧桿菌35624(B.infantis)的選擇標(biāo)準(zhǔn)。L.salivarius和B.infantis通常在分別加入0.05％半胱氨酸(Sigma，Dublin，Ireland)的deMann，Rogosa和Sbarpe培養(yǎng)基，MRS(Oxoid，Basingstoke，UK)厭氧培養(yǎng)24至48小時(shí)。鼠傷寒沙門(mén)氏菌UK1(S.typhimurium)在大豆胰蛋白酶肉湯中(Oxoid，Basingstoke，UK)中需氧培養(yǎng)18至24小時(shí)。通過(guò)離心(3,000g×15min)獲得細(xì)菌培養(yǎng)物，而后用PBS清洗，最后用DMEM稀釋成濃度分別為1×107、1×105和1×103cfu/ml的組合物。
生物樣品的體外處理所有細(xì)胞均接種于24孔組織培養(yǎng)板中(Costar，Schiphol-Rijk，Netherlands)，濃度為1×106cell/ml。MLNC用包含L.salivarius、B.infantis或S.typhimurium的組合物，在1×107CFU、1×105CFU和1×103CFU 3個(gè)細(xì)菌濃度下分別刺激72小時(shí)。由于1×107CFU的細(xì)菌濃度能明顯刺激細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在隨后的一系列試驗(yàn)中均采用了此細(xì)菌濃度。提取自未發(fā)炎的腸中的MLNC用1×107CFU的細(xì)菌組合物刺激72小時(shí)。MLN源的DC用L.salivarius、B.infantis或S.typhimurium刺激24小時(shí)。未處理的對(duì)照生物樣品則用以評(píng)估自然狀態(tài)下分泌的細(xì)胞因子水平。培養(yǎng)板在37℃條件下，含5％CO2的潮濕空氣中孵育，隨后采集上清液進(jìn)行細(xì)胞因子分析。根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)，使用ELISA試劑盒(購(gòu)自R&D Systems，Abington，UK)測(cè)量細(xì)胞因子的產(chǎn)量。需測(cè)量的細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-12 p40、IL-10和TGF-β。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用ANOVA分析工具分析結(jié)果。數(shù)值表示為平均值±平均標(biāo)準(zhǔn)差形式。未受刺激細(xì)胞(對(duì)照)和細(xì)菌刺激細(xì)胞在細(xì)胞因子產(chǎn)量上的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異當(dāng)p＜0.05時(shí)能被接受。
結(jié)果從圖4、5和6中可以看出，在體外受到益生菌(Bif.35624和Lb.118)刺激的腸源性細(xì)胞中的抗炎癥細(xì)胞因子與促炎癥細(xì)胞因子的比率大于未受刺激的對(duì)照樣品中此兩種細(xì)胞因子的比率。雖然這種趨勢(shì)并不總是能達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性，但它指示益生菌組合物和其他一些通常有助于治療腸炎癥疾病的組合物，在體內(nèi)和腸組織間的相互作用與病原菌相比是不同的。據(jù)信這種趨勢(shì)指示此組合物抑制了腸炎癥疾病。從圖4、5和6中可以看出，與對(duì)照相比，病原菌(沙門(mén)氏菌)刺激或者不能引起抗炎癥細(xì)胞因子與促炎癥細(xì)胞因子的比率的差異，或者出現(xiàn)所述比率降低這種更典型的結(jié)果。同樣地，雖然這種差異并不總是能到達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性，它仍然指示了此種組合物不是腸炎癥疾病的抑制物。
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)定治療哺乳動(dòng)物腸炎癥疾病療法功效的體內(nèi)方法，所述體內(nèi)方法包括以下步驟a)測(cè)量采自受試哺乳動(dòng)物的生物樣品中至少一種抗炎癥細(xì)胞因子水平和至少一種促炎癥細(xì)胞因子的水平；b)測(cè)定至少一種抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)至少一種促炎癥細(xì)胞因子的比率；c)實(shí)施所述療法；d)在所述療法實(shí)施后的某一時(shí)間，在所述哺乳動(dòng)物的生物樣品中測(cè)量至少一種抗炎癥細(xì)胞因子水平和至少一種促炎癥細(xì)胞因子水平；e)所述療法實(shí)施后，測(cè)定至少一種抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)至少一種促炎癥細(xì)胞因子的比率；其中所述療法實(shí)施后，抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率升高指示所述療法抑制了腸炎癥疾病，抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率不變或降低指示所述療法不抑制腸炎癥疾病。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗炎癥細(xì)胞因子選自白介素-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、白介素-4、白介素-5、白介素-13，以及它們的混合物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗炎癥細(xì)胞因子選自白介素-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，以及它們的混合物。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述促炎癥細(xì)胞因子包括白介素-12、腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、白介素-2，以及它們的混合物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述促炎癥細(xì)胞因子包括白介素-12、腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ，以及它們的混合物。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率是白介素-10/白介素-12的比率。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/白介素-12的比率。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率是白介素-10/干擾素-γ的比率。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物樣品包括尿、血漿、血清、唾液、組織切片、腦脊液、體外刺激的外周血單核細(xì)胞、未經(jīng)體外刺激的外周血單核細(xì)胞、體外刺激的腸淋巴組織、未經(jīng)體外刺激的腸淋巴組織、腸灌洗液，以及它們的混合物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述生物樣品包括血清、體外刺激的外周血單核細(xì)胞、未經(jīng)體外刺激的外周血單核細(xì)胞，以及它們的混合物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述生物樣品包括體外刺激的外周血單核細(xì)胞、未經(jīng)體外刺激的外周血單核細(xì)胞，以及它們的混合物。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述體外刺激包括有絲分裂原、益生菌、抗CD-3分子，以及它們的混合物。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述體外刺激包括有絲分裂原。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述有絲分裂原包括脂多糖、外源凝集素、超級(jí)抗原，以及它們的混合物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述外源凝集素包括伴刀豆球蛋白A、植物血球凝集素、美洲商陸有絲分裂原，以及它們的混合物。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中測(cè)量所述生物樣品中所述至少一種抗炎癥細(xì)胞因子水平的方法包括ELISA、放射免疫法、基于微陣列平臺(tái)的多重ELISA、編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA、生物測(cè)定法、Western blots、色譜分離系統(tǒng)、RT-PCR、競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR、Northern blots、基因芯片、m-RNA直接測(cè)量法，以及上述方法的聯(lián)合使用。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中測(cè)量所述生物樣品中抗炎癥細(xì)胞因子水平的方法包括ELISA、放射免疫法RIA、編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA以及上述方法的聯(lián)合使用。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中測(cè)量所述生物樣品中所述至少一種抗炎癥細(xì)胞因子水平的方法包括編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其中測(cè)量所述生物樣品中所述至少一種促炎癥細(xì)胞因子水平的方法包括ELISA、放射免疫法、基于微陣列平臺(tái)的多重ELISA、編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA、生物測(cè)定法、Western blots、色譜分離系統(tǒng)、RT-PCR、競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR、Northern blots、基因芯片、m-RNA直接測(cè)量法，以及上述方法的聯(lián)合使用。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中測(cè)量所述生物樣品中所述至少一種促炎癥細(xì)胞因子水平的方法包括ELISA、放射免疫法、編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA，以及上述方法的聯(lián)合使用。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中測(cè)量所述生物樣品中所述至少一種促炎癥細(xì)胞因子水平的方法包括編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA。
22.一種試劑盒，所述試劑盒包括第一測(cè)量單元或系統(tǒng)，用于在治療前和治療中或治療后的至少一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，測(cè)量采自受試哺乳動(dòng)物的生物樣品中的至少一種抗炎癥細(xì)胞因子，試劑盒還包括第二測(cè)量單元或系統(tǒng)，用于在治療前和治療中或治療后的至少一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，測(cè)量采自所述受試哺乳動(dòng)物的生物樣品中的至少一種促炎癥細(xì)胞因子，其中可確定抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率在治療施行后發(fā)生的變化，試劑盒還包括指導(dǎo)使用者測(cè)定抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子在治療前后的比率的使用說(shuō)明書(shū)，所述的抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率升高指示療法抑制了腸炎癥疾病。
23.如權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包括在治療前后獲取所述生物樣品的用具。
24.一種用于篩選治療腸炎癥疾病的組合物的功效的體外方法，所述體外方法包含以下步驟a)提供包含至少一種腸源性細(xì)胞的生物樣品；b)用組合物體外處理所述生物樣品；c)組合物處理后某一時(shí)間測(cè)量生物樣品中至少一種抗炎癥細(xì)胞因子與至少一種促炎癥細(xì)胞因子的水平；d)組合物處理后某一時(shí)間測(cè)定生物樣品中至少一種抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)至少一種促炎癥細(xì)胞因子的比率；特征在于，如果組合物處理過(guò)的生物樣品經(jīng)步驟d)測(cè)得的比率高于在未經(jīng)組合物處理的對(duì)照樣品中同時(shí)測(cè)得的比率，則指示該組合物是腸炎癥疾病的抑制劑，如果組合物處理過(guò)的生物樣品經(jīng)步驟d)測(cè)得的比率與未經(jīng)組合物處理的對(duì)照樣品中同時(shí)測(cè)得的比率相同或是更低，則指示該組合物不是腸炎癥疾病的抑制劑。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述生物樣品包括腸關(guān)聯(lián)的淋巴組織。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述腸關(guān)聯(lián)的淋巴組織包括腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞。
27.如權(quán)利要求24所述的方法，所述方法還包括在步驟(c)之前體外刺激生物樣品的附加步驟。
28.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述抗炎癥細(xì)胞因子從以下范圍內(nèi)選擇白介素-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、自介素-4、白介素-5、白介素-13，以及它們的混合物。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述抗炎癥細(xì)胞因子選自白介素-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，以及它們的混合物。
30.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述促炎癥細(xì)胞因子包括白介素-12、腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、白介素-2，以及它們的混合物。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述促炎癥細(xì)胞因子包括白介素-12、腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ，以及它們的混合物。
32.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率是白介素-10/白介素-12的比率。
33.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/白介素-12的比率。
34.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率是白介素-10/干擾素-γ的比率。
35.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述體外刺激包括有絲分裂原、益生菌、抗CD-3分子，以及它們的混合物。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述體外刺激包括有絲分裂原。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述有絲分裂原包括脂多糖、外源凝集素、超級(jí)抗原，以及它們的混合物。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述外源凝集素包括伴刀豆球蛋白A、植物血球凝集素、美洲商陸有絲分裂原，以及它們的混合物。
39.如權(quán)利要求24所述的方法，其中測(cè)量所述生物樣品中所述至少一種抗炎癥細(xì)胞因子水平的方法包括ELISA、放射免疫法、基于微陣列平臺(tái)的多重ELISA、編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA、生物測(cè)定法、Western blots、色譜分離系統(tǒng)、RT-PCR、競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR、Northern blots、基因芯片、m-RNA直接測(cè)量法，以及上述方法的聯(lián)合使用。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中測(cè)量所述生物樣品中抗炎癥細(xì)胞因子水平的方法包括ELISA、放射免疫法、編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA，以及上述方法的聯(lián)合使用。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中測(cè)量所述生物樣品中所述至少一種抗炎癥細(xì)胞因子水平的方法包括編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中測(cè)量所述生物樣品中所述至少一種促炎癥細(xì)胞因子水平的方法包括ELISA、放射免疫法、基于微陣列平臺(tái)的多重ELISA、編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA、生物測(cè)定法、Western blots、色譜分離系統(tǒng)、RT-PCR、競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR、Northern blots、基因芯片、m-RNA直接測(cè)量法，以及上述方法的聯(lián)合使用。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中測(cè)量所述生物樣品中所述至少一種促炎癥細(xì)胞因子水平所述的方法包括ELISA、放射免疫法、編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的多重ELISA，以及上述方法的聯(lián)合使用。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中測(cè)量所述生物樣品中所述至少一種促炎癥細(xì)胞因子水平的方法包括編碼的微球結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)系統(tǒng)的ELISA。
45.一種用于篩選治療腸炎癥疾病的組合物的功效的試劑盒，所述試劑盒包括第一測(cè)量單元或系統(tǒng)，用于測(cè)量包含腸源性細(xì)胞的生物樣品中的至少一種抗炎癥細(xì)胞因子，試劑盒還包括第二測(cè)量單元或系統(tǒng)，用于測(cè)量包含腸源性細(xì)胞的生物樣品中的至少一種促炎癥細(xì)胞因子，其中抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率在經(jīng)組合物刺激的樣品和對(duì)照樣品間的差異可以被測(cè)定，試劑盒還包括指導(dǎo)使用者測(cè)定抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率的使用說(shuō)明書(shū)，處理樣品中抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率高于對(duì)照樣品中抗炎癥細(xì)胞因子對(duì)促炎癥細(xì)胞因子的比率，指示是腸炎癥疾病的抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了測(cè)定治療哺乳動(dòng)物腸炎癥疾病的療法功效的新方法。本方法用于篩選腸炎癥疾病的療法，并測(cè)定療法的功效，還用以測(cè)定腸炎癥疾病患者個(gè)體對(duì)給定治療的療效反應(yīng)。此外，還提供了實(shí)施本方法的試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1764838SQ200480008149
公開(kāi)日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2004年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月1日
發(fā)明者K·－S·陳, J·K·柯林斯, B·P·基利, F·羅, L·D·奧馬奧尼, R·P·菲利浦森, F·沙納漢 申請(qǐng)人:寶潔公司, 營(yíng)養(yǎng)衛(wèi)生有限公司