專利名稱：一種用于熒光儀器校準(zhǔn)測量的校準(zhǔn)基片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于熒光儀器校準(zhǔn)測量的校準(zhǔn)基片及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著生物技術(shù)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，熒光檢測已成為一種發(fā)展最快的應(yīng)用于生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)及生物化學(xué)分析等領(lǐng)域的重要檢測方法。傳統(tǒng)的熒光儀器通常采用激光、氙燈、高壓/低壓汞燈等光源作為激發(fā)光源，通過檢測熒光物質(zhì)受激發(fā)后發(fā)射光的光譜及信號強(qiáng)弱來進(jìn)行分析。不同熒光儀器的光源、光路、檢測系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、集成各不相同，同一儀器的光源、光路及檢測系統(tǒng)隨使用時間的延長也會出現(xiàn)細(xì)微的變化，這往往會帶來測量誤差。由于熒光檢測法靈敏度極高，通常用于痕量檢測中，極小的測量誤差可能導(dǎo)致完全相反的結(jié)論。因此制備熒光標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并應(yīng)用其對熒光儀器進(jìn)行校準(zhǔn)就顯得極為必要。
目前，常用作熒光校準(zhǔn)的材料及制備工藝主要有以下幾種1、有機(jī)熒光染料作為熒光校準(zhǔn)物質(zhì)如美國Gene Pharm公司用于激光共聚焦掃描儀的熒光校準(zhǔn)產(chǎn)品，直接將Cy3、Cy5等熒光染料噴印/打印到無自發(fā)熒光背景的玻片表面，每張校準(zhǔn)基片上固定有20個系列稀釋濃度的熒光染料點(diǎn)，基片需真空密封包裝。美國Full Moon公司也使用有機(jī)熒光染料Cy3、Cy5制備了類似的適合于微陣列掃描儀使用的校準(zhǔn)玻片。但是，由于有機(jī)熒光染料在相對較短的時間內(nèi)即可被光漂白，因此，這一類熒光校準(zhǔn)材料的光學(xué)穩(wěn)定性差；材料保存條件苛刻，需避光、干燥等；使用壽命短，每使用了一次之后，校準(zhǔn)材料的熒光強(qiáng)度均會有不同程度的損失。
2、聚合物摻雜有機(jī)熒光染料作為熒光校準(zhǔn)物質(zhì)如英國Optiglass Limited公司的Starna熒光校準(zhǔn)產(chǎn)品，是將不同濃度的有機(jī)熒光染料摻雜于甲基丙烯酸甲酯單體中，聚合得到有機(jī)熒光染料摻雜的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)固體，用于熒光光譜儀的熒光光譜校準(zhǔn)；Polysciences公司的PolybeadTM熒光微球是將有機(jī)熒光染料吸附于聚苯乙烯類高分子微球的孔洞結(jié)構(gòu)中構(gòu)成的，它可以對熒光光譜儀、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、微孔板儀等光學(xué)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。美國專利US2003/0105195中敘述了將有機(jī)熒光染料摻于高聚物(如聚甲基丙烯酸甲酯、環(huán)氧樹脂、聚氨酯等)本體中在基片表面進(jìn)行涂覆的方法。但此類方法未從根本上解決有機(jī)熒光染料光漂白的問題。
3、高分子材料作為熒光校準(zhǔn)物質(zhì)美國專利US2003/0057379、US2003/0015668、US6472671中采用無熒光背景的石英玻璃為基體材料，將具有寬帶熒光響應(yīng)的高分子材料-聚酰亞胺作為熒光材料在玻璃表面涂覆，再將極薄的金屬層覆蓋其上，可在金屬層表面刻蝕出需要的圖形，這種校準(zhǔn)基片主要作為熒光顯微鏡的校準(zhǔn)與測試。德國Clondiag公司的FluorIS產(chǎn)品可作為微陣列掃描儀的校準(zhǔn)工具使用，它由玻片表面的具有確定熒光強(qiáng)度和形狀的熒光點(diǎn)陣列構(gòu)成，可實(shí)現(xiàn)熒光掃描儀掃描效果的比較和校準(zhǔn)。該公司在其專利WO 02/077620中介紹使用光聚合物SU8-10作為其校準(zhǔn)基片表面涂覆的熒光材料的制備方法。該校準(zhǔn)基片可在20次左右的使用次數(shù)內(nèi)可保證其熒光穩(wěn)定性；但是采用這種具有自發(fā)熒光的聚合物制成的校準(zhǔn)材料被激發(fā)光照射時，仍然存在光漂白的問題，因此使用次數(shù)過多會導(dǎo)致檢測熒光強(qiáng)度降低。
4、無機(jī)材料摻雜有機(jī)熒光染料作為熒光校準(zhǔn)物質(zhì)美國專利US2003/0015668中提出了采用溶膠-凝膠等技術(shù)在玻璃基質(zhì)表面沉積很薄的Cy3、Cy5等熒光染料摻雜玻璃膜的方法制備熒光顯微鏡的校準(zhǔn)基片，但由于發(fā)光物質(zhì)依然是Cy3、Cy5等有機(jī)染料，未從根本上解決光漂白問題。
5、無機(jī)離子摻雜無機(jī)固體材料作為熒光校準(zhǔn)物質(zhì)1989年成立的美國Matech公司致力于熒光標(biāo)準(zhǔn)材料的生產(chǎn)和制造。他們的產(chǎn)品TR-系列96孔板熒光參比材料包括四種波段紫光波段TR-418、藍(lán)光波段TR-460、綠光波段TR-517、紅光波段TR-613，可以對熒光光譜儀的波長和熒光強(qiáng)度進(jìn)行校準(zhǔn)。TR-系列熒光材料采用了光學(xué)穩(wěn)定性最佳的無機(jī)固體材料-無機(jī)玻璃與Ce3+、U6+、Eu3+等無機(jī)離子共摻雜，與PMMA摻雜有機(jī)染料羅丹明B、PMMA摻雜有機(jī)熒光染料熒光素等聚合物摻雜有機(jī)熒光染料相比幾乎不存在光漂白的問題，同時對保存溫度、濕度等無要求。但由于該類產(chǎn)品多為塊材或大尺寸片材，很難在相同基底上提供精細(xì)結(jié)構(gòu)的不同熒光強(qiáng)度的校準(zhǔn)，限制了其在某些熒光光學(xué)儀器(如微陣列掃描儀)校準(zhǔn)上的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、使用壽命長的用于熒光儀器校準(zhǔn)測量的校準(zhǔn)基片及其制備方法。
本發(fā)明所提供的用于熒光儀器校準(zhǔn)測量的校準(zhǔn)基片，是在玻璃基片上點(diǎn)設(shè)有無機(jī)熒光材料的陣列；所述無機(jī)熒光材料是稀土元素與稀土元素或非稀土元素?fù)诫s形成的復(fù)合物。
所述復(fù)合物為CaS:Eu復(fù)合物、NaYF4:Yb:M復(fù)合物、NaYF4:M復(fù)合物、NaYbF4:M復(fù)合物等，其中M＝Tm，Er，Ho，可采用室溫和水熱等方法合成，經(jīng)過高溫煅燒得到。
該校準(zhǔn)基片的制備方法，包括如下步驟1)將稀土元素與稀土元素或非稀土元素?fù)诫s形成的復(fù)合物分散于水溶液中；2)將復(fù)合物溶液以陣列形式排布于玻璃基片表面，得到校準(zhǔn)基片。
為了提高無機(jī)熒光材料在水溶液體系中的分散性能，對無機(jī)熒光材料還可進(jìn)行表面包覆。無機(jī)熒光材料經(jīng)過表面包覆，可以改善或改變材料的分散性，提高顆粒的表面活性，使顆粒表面產(chǎn)生新的物理、化學(xué)、機(jī)械性能，改善無機(jī)顆粒與其他物質(zhì)之間的相容性。常見的方法是在無機(jī)熒光材料表面包覆上聚合物，如聚苯乙烯；或無機(jī)物，如二氧化硅，由硅烷化試劑-硅酸烷基酯三乙氧基-3-氨基丙基硅烷、三乙氧基-3-環(huán)氧基丙基硅烷、三乙氧基-3-巰基丙基硅烷、正硅酸乙酯等在酸性或堿性條件下水解，形成了無機(jī)熒光材料的表面SiO2改性，該方法增強(qiáng)了無機(jī)熒光材料的親水性，提高了其在水溶液體系中的分散性能。
經(jīng)過包覆后的無機(jī)熒光材料，在一定量的表面活性劑或高分子分散劑的作用下可以較好地分散于水溶液體系。具體的表面活性劑可以為非離子型的Tween-20、Triton-100，陰離子型的十二烷基苯磺酸鈉(SDS)等表面活性劑中的一種或幾種的復(fù)配。高分子分散劑可以為非離子空間位阻型的聚乙二醇(PEG)，如PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG20000、聚乙烯醇(PVA)，高分子聚電解質(zhì)類型中的陽離子型聚乙烯亞胺(PEI)、陰離子型聚丙烯酸鈉(PAA)的一種或幾種的復(fù)配。所述表面活性劑或高分子分散劑的用量通常為0.1％～10％，優(yōu)選為0.1-5％。
將無機(jī)熒光材料均勻分散于水溶液中后，還可以向其中加入二甲基亞砜(DMSO)、甘油等，形成中性點(diǎn)樣液，采用美國Cartesian、Genomic Instrumentation等公司生產(chǎn)的微陣列點(diǎn)樣儀按一定規(guī)則的陣列形式排布于玻璃基片表面，或用旋涂儀旋涂成膜，再用絲網(wǎng)印刷技術(shù)將其隔離為分隔點(diǎn)陣，即可以得到本發(fā)明的校準(zhǔn)基片，所得校準(zhǔn)信號點(diǎn)直徑為100～500μm，優(yōu)選為120～300μm。
本發(fā)明所用玻璃基片通常是尺寸為75.6mm×25mm的顯微鏡通用載玻片，可以使用未經(jīng)修飾的載玻片為基底材料，也可以對載玻片進(jìn)行表面修飾。修飾的基片可以為化學(xué)修飾的基片-氨基化基片、醛基化基片、環(huán)氧基化基片、巰基化基片；高分子薄膜基片-高分子量PVA薄膜基片、瓊脂糖薄膜基片、高分子量PVA復(fù)合瓊脂糖薄膜基片等。
為了提高無機(jī)熒光材料在基片表面的固定牢度，可在點(diǎn)樣后的基片表面涂覆保護(hù)層。常用保護(hù)層為聚甲基硅氧烷(PDMS)膜、聚乙烯醇(PVA)膜等透明的低熒光背景的膜，膜的厚度應(yīng)小于50微米。也可以在高分子膜基片上實(shí)現(xiàn)無機(jī)熒光材料的陣列排布。
本發(fā)明是將光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的無機(jī)熒光材料經(jīng)過表面包覆處理后，在表面活性劑的作用下，以一定的陣列形式排布于玻璃基片上，可得到熒光性能穩(wěn)定的校準(zhǔn)基片。本發(fā)明校準(zhǔn)基片不存在現(xiàn)有熒光基片普遍存在的光漂白問題，使用壽命長；通過保護(hù)膜的制備使得無機(jī)熒光材料樣品在基片表面固定牢度比較高，基本不會機(jī)械擦傷基片，無需苛刻的保存條件；用途廣泛，可用于微陣列生物芯片掃描儀多通道檢測、熒光顯微鏡、熒光光譜儀、微孔板儀等常用熒光光學(xué)儀器的校準(zhǔn)和測試。


圖1為本發(fā)明校準(zhǔn)基片的結(jié)構(gòu)示意圖，圖1A表示先制備無機(jī)熒光材料陣列，再在表面覆蓋高分子保護(hù)膜層；圖1B表示在高分子膜層上制備無機(jī)熒光材料陣列；圖中1為玻璃基片；2為無機(jī)熒光材料陣列；3為表面保護(hù)層；4為高分子膜。
圖2為實(shí)施例1中Tm-SiO2共摻雜材料制備的校準(zhǔn)基片的Cy3通道掃描圖片圖3為實(shí)施例5中制備的校準(zhǔn)基片的Cy3通道掃描圖片圖4為NaYF4:Yb:Tm與Cy3光學(xué)穩(wěn)定性比較曲線圖5為實(shí)施例7中制備的定位用的校準(zhǔn)基片的Cy3通道掃描圖片圖6為實(shí)施例8制備的濃度梯度校準(zhǔn)基片的Cy3通道掃描圖片圖7為實(shí)施例9中制備的表面涂覆有PVA保護(hù)膜的校準(zhǔn)基片的Cy3通道掃描圖片圖8為實(shí)施例10中制備的CaS:Eu校準(zhǔn)基片的Cy3、Cy5通道掃描圖片圖9為實(shí)施例11中制備的PVA膜玻璃基片的校準(zhǔn)基片的Cy3、Cy5通道掃描圖片具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、熒光材料為稀土-SiO2共摻雜材料的校準(zhǔn)基片制備1、稀土-SiO2共摻雜材料的制備量取2.2ml正硅酸乙酯(TEOS)于小燒杯中，室溫下，電磁攪拌，加入0.58ml無水乙醇，將0.36ml濃度為0.15M HCl水溶液滴加到上述反應(yīng)體系當(dāng)中，水解反應(yīng)2h。然后加入濃度為0.2M的Tm3+10ml，室溫?fù)u動反應(yīng)2h，陳化12h，即得到Tm-SiO2共摻雜材料。
2、校準(zhǔn)基片的制備稱4mg上述Tm-SiO2稀土無機(jī)摻雜材料，加入到100μL 4％PVA水溶液中，超聲至固體顆粒分散均勻，然后用Gene Machine公司生產(chǎn)的點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于清潔載玻片表面，得到校準(zhǔn)基片。
以ScanArray 4000生物芯片掃描儀的Cy3通道掃描基片，圖像如圖2所示。
實(shí)施例2、熒光材料為NaYF4:Yb:Tm稀土共摻雜材料的校準(zhǔn)基片制備1、NaYF4:Yb:Tm稀土共摻雜材料的室溫法制備稱取2.1gNaF固體粉末加入到反應(yīng)瓶，并加入80ml的高純水，超聲溶解，電磁攪拌。分別量取濃度為0.2M的YCl3溶液20ml、YbCl3溶液6ml、和TmCl3溶液3ml，混合均勻后快速注射入NaF水溶液中，溶液逐漸變混濁，室溫電磁攪拌反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束后以4000rpm離心分離，以去離子水洗滌沉淀三次，放入60℃烘箱中干燥。將干燥樣品在N2氣氛中400℃煅燒5h，得到NaYF4:Yb:Tm復(fù)合物。
2、校準(zhǔn)基片的制備將上述復(fù)合物分散到含10％表面活性劑Tween-20的水溶液中，按照實(shí)施例1的方法點(diǎn)樣于清潔載玻片表面制備校準(zhǔn)基片。
實(shí)施例3、熒光材料為NaYF4:Tm稀土共摻雜材料的校準(zhǔn)基片制備1、NaYF4:Tm稀土共摻雜材料的室溫法制備稱取2.1g NaF固體粉末加入到反應(yīng)瓶，并加入80ml的高純水，超聲溶解，電磁攪拌。分別取濃度為0.2M的YCl3和TmCl3溶液20ml、3ml，混合均勻后快速注射入NaF水溶液中，室溫攪拌反應(yīng)1h后，以4000rpm離心分離，以去離子水洗滌沉淀三次，放入60℃烘箱中干燥。將干燥樣品于N2氣氛中400℃煅燒5h，得到NaYF4:Tm復(fù)合物。
2、醛基修飾玻片制備取經(jīng)鉻酸洗液浸泡過夜并經(jīng)充分水洗的潔凈載玻片5片，放入裝有40ml 1％APTES(3-aminopropyl triethoxysilane)乙醇溶液的直型染色缸中，室溫?fù)u動反應(yīng)1小時，得氨基化基片；將氨基化基片放入裝有8％戊二醛水溶液的直型染色缸中，室溫?fù)u動反應(yīng)1小時，得醛基化玻璃基片。
3、校準(zhǔn)基片的制備以醛基化玻片為基片，將上述復(fù)合物分散到含0.1％表面活性劑Triton-100的水溶液中，其他方法與實(shí)施例1相同，得到熒光材料為NaYF4:Tm稀土共摻雜材料的校準(zhǔn)基片。
實(shí)施例4、熒光材料為NaYF4:Yb:Tm稀土共摻雜材料的校準(zhǔn)基片制備1、NaYF4:Yb:Tm稀土共摻雜材料水熱法制備稱取2.1g NaF固體粉末加入到反應(yīng)瓶，并加入80ml的高純水，超聲溶解，電磁攪拌。分別取濃度為0.2M的YCl3、YbCl3和TmCl3溶液20ml、6ml、3ml，混合均勻后快速注射入NaF水溶液中，室溫反應(yīng)1小時。將該反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到水熱釜中，160℃繼續(xù)反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后以4000rpm離心分離，以去離子水洗滌沉淀三次，放入60℃烘箱中干燥。將干燥樣品于N2氣氛中400℃煅燒5h，得到NaYF4:Yb:Tm復(fù)合物。
2、巰基修飾玻片制備取經(jīng)鉻酸洗液(8g K2Cr2O7+5ml H2O+95ml濃硫酸)浸泡過夜并經(jīng)充分水洗的潔凈載玻片5片，置裝有40ml 1％MTPS(3-mercaptopropyl trimethoxysilane)乙醇溶液的直型染色缸中，室溫?fù)u動反應(yīng)1小時，得巰基化玻片。
3、校準(zhǔn)基片的制備以巰基化玻片為基片，以含5％PEG2000和5％聚乙烯亞胺(PEI)的水溶液作為分散用表面活性劑，其他操作同實(shí)施例1，得到校準(zhǔn)基片。
實(shí)施例5、熒光材料為NaYF4:Yb:Tm稀土共摻雜材料的校準(zhǔn)基片制備1、NaYF4:Yb:Tm稀土共摻雜材料的室溫法制備稱取2.1g NaF固體粉末加入到反應(yīng)瓶，并加入80ml的高純水，超聲溶解，電磁攪拌。分別取濃度為0.2M的YCl3、YbCl3和TmCl3溶液分別為20ml、6ml、3ml混合后，加入到0.2M的乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液20ml中，搖勻后快速注射入NaF水溶液中，室溫攪拌反應(yīng)1h后以4000rpm離心分離，以去離子水洗滌沉淀三次，放入60℃烘箱中干燥。將干燥樣品于N2氣氛中400℃煅燒5h，得到NaYF4:Yb:Tm復(fù)合物。
2、稀土熒光材料表面SiO2包覆稱取0.4g NaYF4:Yb:Tm復(fù)合物樣品于單口瓶中，加入10ml異丙醇，反復(fù)超聲分散樣品。取分散均勻的樣品于100ml錐形瓶中，向錐形瓶中補(bǔ)充異丙醇到總體積約為50ml，電磁攪拌；向該懸浮液中注入12ml高純水、20ml濃NH3·H2O(濃度約28％)，封口，40℃油浴反應(yīng)10min后，加入1ml TEOS，電磁快速攪拌反應(yīng)1h后，以4000rpm離心分離，以高純水洗滌樣品4次，60℃烘干過夜。
3、氨基修飾玻片制備取經(jīng)鉻酸洗液浸泡過夜并經(jīng)充分水洗的潔凈載玻片5片，放入裝有40ml 1％APTES(3-aminopropyl triethoxysilane)乙醇溶液的直型染色缸中，室溫?fù)u動反應(yīng)1小時，得氨基化基片。
3、校準(zhǔn)基片的制備以氨基化玻片為基片，將所得樣品分散于含4％PEG2000和30％DMSO的水溶液中，以Cartesian點(diǎn)樣儀，直徑為255μm的鋼針共點(diǎn)制兩張基片。以ScanArray 4000生物芯片掃描儀的Cy3通道掃描，圖像如圖3所示。
取本發(fā)明所得NaYF4:Yb:Tm校準(zhǔn)玻片，另用購自美國Amersham Pharmacia公司的Cy3熒光染料水溶液同樣用Cartesian點(diǎn)樣儀點(diǎn)制熒光陣列基片，分別經(jīng)110mW綠色激光連續(xù)照射，每隔5分鐘采集照射后樣品熒光強(qiáng)度的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，與Cy3染料相比，本發(fā)明的Tm復(fù)合物材料在綠色激光照射下具有更好的光學(xué)穩(wěn)定性。
4、聚甲基硅氧烷保護(hù)膜制備取甲基硅氧烷溶液100ml及引發(fā)劑4，4’-偶氮二異丁腈酸10ml，加入10ml正己烷作為稀釋劑與甲基硅氧烷混合，使用甩膠機(jī)/Spin Coater制備PDMS保護(hù)膜于上述基片表面，可以很好得固定住基片表面的熒光樣品，且透明性良好，具有一定的粘性，膜的厚度約為40μm。
實(shí)施例6、熒光材料為NaYF4:Tm稀土共摻雜材料的校準(zhǔn)基片制備1、NaYF4:Tm稀土共摻雜材料水熱法制備稱取2.1g NaF固體粉末加入到反應(yīng)瓶，并加入80ml的高純水，超聲溶解，電磁攪拌。分別取濃度為0.2M的YCl3和TmCl3溶液20ml、.3ml混合均勻后快速注射入NaF水溶液中，室溫反應(yīng)30min。將該反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到熱釜中，160℃繼續(xù)反應(yīng)2h后結(jié)束反應(yīng)，以4000rpm離心分離，以去離子水洗滌沉淀三次，放入60℃烘箱中干燥。將干燥樣品于N2氣氛中400℃煅燒5h，得到NaYF4:Tm復(fù)合物。
2、稀土熒光材料表面氨基修飾將上述材料按實(shí)施例5中所述方法進(jìn)行SiO2包覆，稱取包覆后樣品400mg，加入20ml異丙醇，超聲分散1h，向體系中加入1.2ml APTES，反應(yīng)3h。停止反應(yīng)，以4000rpm離心分離，以去離子水洗滌沉淀三次，60℃干燥，得到氨基化修飾的稀土熒光材料。
3、環(huán)氧基修飾玻片制備取經(jīng)鉻酸洗液浸泡過夜并經(jīng)充分水洗的潔凈載玻片5片，置裝有40ml 1％GPTS(3-glycidoxypropyl trimethoxysilane)乙醇溶液的直型染色缸中，室溫?fù)u動反應(yīng)1小時，得環(huán)氧基化玻片。
4、校準(zhǔn)基片的制備以環(huán)氧基化玻片為基片，以含2％十二烷基苯磺酸鈉(SDS)和3％聚丙烯酸鈉(PAA)的水溶液作為分散用表面活性劑，其他操作同實(shí)施例1，得到校準(zhǔn)基片。
實(shí)施例7、用于定位使用的校準(zhǔn)基片的制備將實(shí)施例5所得無機(jī)熒光材料，以含4％PEG8000和30％DMSO的水溶液為分散體系超聲分散后，作為點(diǎn)樣液，以Gene Machine點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣于氨基化玻璃基片上，采用ScanArray 4000生物芯片掃描儀掃描基片，圖像如圖5，該基片可用于熒光生物芯片掃描儀確定掃描范圍及掃描位置。
實(shí)施例8、濃度梯度校準(zhǔn)基片的制備用含30％DMSO和5％甘油的水溶液做分散液配制實(shí)施例5所得熒光材料，濃度為12％，然后梯度稀釋為9％、6.75％、5.06％、3.8％、2.85％、2.14％、1.6％、1.2％、0.9％、0.68％的懸浮液，超聲分散后以Cartesian點(diǎn)樣儀，直徑為110μm的鋼針在醛基基片上進(jìn)行3個點(diǎn)陣的重復(fù)點(diǎn)樣，基片掃描圖像見圖6，圖中第1行為濃度為12％的樣品點(diǎn)，2～12行分別為由低濃度到高濃度的熒光材料樣品點(diǎn)，具體為0.68％、0.9％、1.2％、1.6％、2.14％、2.85％、3.8％、5.06％、6.75％、9％、12％的熒光材料樣品點(diǎn)。
實(shí)施例9、聚乙烯醇(PVA)保護(hù)膜校準(zhǔn)基片的制備為了提高樣品于玻片表面的固定牢度，在實(shí)施例8所得校準(zhǔn)基片上制備PVA保護(hù)膜。先配制0.2％PVA水溶液，將校準(zhǔn)基片浸入數(shù)秒鐘，提出，晾干。玻片外觀光滑，輕微機(jī)械摩擦不會對樣品點(diǎn)造成損壞。ScanArray 4000生物芯片掃描儀掃描圖像如圖7所示，圖6、圖7比較表明PVA保護(hù)膜的添加不會對校準(zhǔn)點(diǎn)熒光信號強(qiáng)度及均一性產(chǎn)生明顯影響。
實(shí)施例10、CaS:Eu校準(zhǔn)基片的制備1、CaS:Eu的合成Eu(NO3)3溶液制備稱Eu2O3于錐形瓶中，加入濃硝酸，電磁攪拌加熱，溶解固體，蒸發(fā)過量的硝酸，得到粘稠狀固體，加無水乙醇定容備用。
Na2S溶液的配制稱取Na2S·9H2O，加入無水乙醇溶解，即得到Na2S溶液。
CaCl2溶液的配制稱取CaCl2白色固體，加入無水乙醇溶解，形成均勻溶液即可。
向CaCl2溶液中加入前面配制好的Eu(NO3)3溶液混合均勻備用。
三口瓶中加入Na2S溶液200ml，通入氮?dú)獗Ｗo(hù)。劇烈攪拌下，用50ml注射器將50m1的Eu(NO3)3/CaCl2混合溶液快速注射入反應(yīng)體系中，室溫反應(yīng)1h后以4000rpm離心分離樣品，去離子水洗滌樣品5次，60℃干燥過夜。將干燥后的固體樣品置管式爐中，于N2氣氛中700℃煅燒3h，得到粉紅色固體粉末。
2、CaS:Eu校準(zhǔn)基片的制備樣品以1％PEG 8000水溶液分散后，用Gene Machine公司生產(chǎn)的點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣到顯微鏡通用載玻片上，以ScanArray 4000生物芯片掃描儀的Cy3、Cy5通道掃描，掃描圖像如圖8所示。
實(shí)施例11、以PVA薄膜基片為基底材料的校準(zhǔn)基片的制備1、PVA膜基片的制備將濃度為2％的PVA(聚合度為1750)水溶液旋涂于清潔載玻片表面，室溫放置至干燥。
2、校準(zhǔn)基片的制備將實(shí)施例5所得的表面包覆SiO2的稀土熒光材料分散于含10％甘油和1％PEG8000的水溶液中，按照實(shí)施例7的方法點(diǎn)樣于PVA基片表面，60℃條件下固定3天得到校準(zhǔn)基片?；瑨呙鑸D像如圖9所示。
實(shí)施例12、以瓊脂糖薄膜基片為基底材料的校準(zhǔn)基片的制備1、瓊脂糖薄膜基片的制備將濃度為1％的瓊脂糖水溶液旋涂于清潔玻片表面，室溫放置至干燥。
2、校準(zhǔn)基片制備將實(shí)施例5所得的表面包覆SiO2的稀土熒光材料分散于含10％甘油和1％PEG20000的水溶液體系中，按照實(shí)施例7的方法點(diǎn)樣于瓊脂糖薄膜基片表面，60℃恒溫箱中放置1天，得到固定好樣點(diǎn)的校準(zhǔn)基片。
實(shí)施例13、以PVA-瓊脂糖復(fù)合薄膜基片為基底材料的校準(zhǔn)基片的制備1、PVA-瓊脂糖復(fù)合薄膜基片的制備將濃度為1％瓊脂糖/2％PVA混合水溶液旋涂于清潔玻片表面，室溫放置至干燥。
2、熒光材料表面包覆聚苯乙烯稱取按實(shí)施例6中方法合成的稀土復(fù)合物100mg加入到裝有20ml甲苯的三口瓶中，并加入0.1g十二烷基磺酸鈉，超聲分散0.5小時。將過氧化苯甲酰0.05g，苯乙烯0.5ml，二乙烯苯0.3ml加入三口燒瓶中，通N2，先機(jī)械攪拌15分鐘，再油浴升溫至80℃，緩慢攪拌反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，將三口瓶靜置降溫，棄去上層清液，用1000rpm離心，先用乙醇洗滌，再用去離子水洗，60℃烘干待用。
3、校準(zhǔn)基片制備將聚苯乙烯包覆的稀土復(fù)合物分散于含10％甘油和1％PEG6000的混合水溶液中，按照實(shí)施例7的方法點(diǎn)樣于PVA-瓊脂糖復(fù)合膜基片表面，50℃恒溫箱中放置7天，得到固定好樣點(diǎn)的校準(zhǔn)基片。
實(shí)施例14、熒光材料為NaYbF4:Tm稀土共摻雜材料的校準(zhǔn)基片制備1、NaYbF4:Tm稀土共摻雜材料室溫法制備稱取2.1g NaF固體粉末加入到反應(yīng)瓶，并加入80ml的高純水，超聲溶解，電磁攪拌。分別取濃度為0.2M的YbCl3和TmCl3溶液6ml、3ml，混合均勻后快速注射入NaF水溶液中，室溫攪拌反應(yīng)1h后，以4000rpm離心分離，以去離子水洗滌沉淀三次，放入60℃烘箱中干燥。將干燥樣品于N2氣氛中400℃煅燒5h，得到NaYbF4:Tm復(fù)合物。
2、校準(zhǔn)基片的制備按實(shí)施例5中所述方法對材料進(jìn)行SiO2包覆、樣品分散于含4％PEG2000和1％PVA的水溶液中，用旋涂儀在清潔玻璃基片表面旋涂成膜，厚度約20μm。干燥后，用絲網(wǎng)印刷技術(shù)在稀土材料薄膜表面用高分子熱聚合型復(fù)合膠(如杜邦公司5036膠)進(jìn)行印刷，80℃加熱20分鐘，得到直徑為500μm規(guī)則排布的熒光校準(zhǔn)點(diǎn)陣。
實(shí)施例15、熒光材料為NaYF4:Yb:Er稀土共摻雜材料的校準(zhǔn)基片制備稱取2.1g NaF固體粉末加入到反應(yīng)瓶，并加入80ml的高純水，超聲溶解，電磁攪拌。分別取濃度為0.2M的YCl3、YbCl3和ErCl3溶液20ml、6ml、3ml，混合均勻后快速注射入NaF水溶液中，室溫攪拌反應(yīng)1h后，以4000rpm離心分離，以去離子水洗滌沉淀三次，放入60℃烘箱中干燥。將干燥樣品于N2氣氛中400℃煅燒5h，得到NaYF4:Yb:Er復(fù)合物。
按實(shí)施例5中所述方法對材料進(jìn)行SiO2包覆，將包覆后樣品分散于含4％PEG2000和30％DMSO的水溶液中，以Cartesian點(diǎn)樣儀在氨基基片上進(jìn)行點(diǎn)樣制備校準(zhǔn)基片。
實(shí)施例16、熒光材料為NaYF4:Yb:Ho稀土共摻雜材料的校準(zhǔn)基片制備稱取2.1g NaF固體粉末加入到反應(yīng)瓶，并加入80ml的高純水，超聲溶解，電磁攪拌。分別取濃度為0.2M的YCl3、YbCl3和HoCl3溶液20ml、6ml、3ml，混合均勻后快速注射入NaF水溶液中，室溫攪拌反應(yīng)1h后，以4000rpm離心分離，以去離子水洗滌沉淀三次，放入60℃烘箱中干燥。將干燥樣品于N2氣氛中400℃煅燒5h，得到NaYF4:Yb:Ho復(fù)合物。
按實(shí)施例5中所述方法對材料進(jìn)行SiO2包覆，將包覆后樣品分散于含4％PEG2000和30％DMSO的水溶液中，以Cartesian點(diǎn)樣儀在氨基基片上進(jìn)行點(diǎn)樣制備校準(zhǔn)基片。
權(quán)利要求
1.一種用于熒光儀器校準(zhǔn)測量的校準(zhǔn)基片，是在玻璃基片上點(diǎn)設(shè)有無機(jī)熒光材料的陣列；所述無機(jī)熒光材料是稀土元素與稀土元素或非稀土元素?fù)诫s形成的復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的校準(zhǔn)基片，其特征在于所述復(fù)合物為CaS:Eu復(fù)合物，NaYF4:Yb:M復(fù)合物，NaYF4:M復(fù)合物或NaYbF4:M復(fù)合物，其中所述M為Tm，Er或Ho。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的校準(zhǔn)基片，其特征在于所述無機(jī)熒光材料表面還包覆有聚合物或無機(jī)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的校準(zhǔn)基片，其特征在于所述聚合物為聚苯乙烯；所述無機(jī)物為二氧化硅。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的校準(zhǔn)基片，其特征在于所述玻璃基片為空白玻璃基片或表面化學(xué)修飾的玻璃基片或表面涂有高分子膜的玻璃基片。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的校準(zhǔn)基片，其特征在于所述化學(xué)修飾基片為氨基化玻璃基片、醛基化玻璃基片、環(huán)氧基化玻璃基片或巰基化玻璃基片；所述表面涂有高分子膜的玻璃基片為聚乙烯醇薄膜玻璃基片、瓊脂糖薄膜玻璃基片或聚乙烯醇—瓊脂糖復(fù)合薄膜玻璃基片。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的校準(zhǔn)基片，其特征在于所述校準(zhǔn)基片表面還涂覆有保護(hù)層。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的校準(zhǔn)基片，其特征在于所述保護(hù)層為聚甲基硅氧烷膜或聚乙烯醇膜。
9.權(quán)利要求1所述的校準(zhǔn)基片的制備方法，包括如下步驟1)將稀土元素與稀土元素或非稀土元素?fù)诫s形成的復(fù)合物分散于水溶液中；2)將復(fù)合物溶液以陣列形式排布于玻璃基片表面，得到校準(zhǔn)基片。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于步驟1)所述復(fù)合物為CaS:Eu復(fù)合物、NaYF4:Yb:M復(fù)合物、NaYF4:M復(fù)合物或NaYbF4:M復(fù)合物，其中所述M為Tm、Er或Ho。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的制備方法，其特征在于所述無機(jī)熒光材料表面還包覆有聚合物或無機(jī)物。
12.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的制備方法，其特征在于步驟1)所述水溶液含有0.1-10％的表面活性劑或高分子分散劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備方法，其特征在于所述表面活性劑或高分子分散劑用量為0.1-5％。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備方法，其特征在于所述表面活性劑為Tween-20、Triton-100、十二烷基苯磺酸鈉中的一種或幾種；所述高分子分散劑為PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG20000、聚乙烯醇、聚乙烯亞胺和聚丙烯酸鈉中的一種或幾種。
15.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的制備方法，其特征在于所述水溶液中還含有二甲基亞砜或甘油。
16.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的制備方法，其特征在于步驟2)所述玻璃基片為空白玻璃基片或表面化學(xué)修飾的玻璃基片或表面涂有高分子膜的玻璃基片。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的制備方法，其特征在于所述化學(xué)修飾基片為氨基化玻璃基片、醛基化玻璃基片、環(huán)氧基化玻璃基片或巰基化玻璃基片；所述表面涂有高分子膜的玻璃基片為聚乙烯醇薄膜玻璃基片、瓊脂糖薄膜玻璃基片或聚乙烯醇—瓊脂糖復(fù)合薄膜玻璃基片。
18.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的制備方法，其特征在于步驟2)所述復(fù)合物溶液以陣列形式排布于玻璃基片表面的方法為微陣列點(diǎn)樣儀點(diǎn)制法或用旋涂儀將復(fù)合物溶液旋涂于玻璃基片表面成膜，再用絲網(wǎng)印刷技術(shù)將其隔離為分隔點(diǎn)陣。
19.根據(jù)權(quán)利要9或10所述的制備方法，其特征在于所述校準(zhǔn)基片還在表面涂覆有保護(hù)層。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的制備方法，其特征在于所述保護(hù)層為聚甲基硅氧烷膜或聚乙烯醇膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于熒光儀器校準(zhǔn)測量的校準(zhǔn)基片及其制備方法，目的是提供一種光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、使用壽命長的校準(zhǔn)基片。本發(fā)明所提供的校準(zhǔn)基片，是在玻璃基片上點(diǎn)設(shè)有無機(jī)熒光材料的陣列；所述無機(jī)熒光材料是稀土元素與稀土元素或非稀土元素?fù)诫s形成的復(fù)合物。其制備包括如下步驟1)將無機(jī)熒光材料分散于水溶液中；2)將無機(jī)熒光材料溶液以陣列形式排布于玻璃基片表面，得到校準(zhǔn)基片。本發(fā)明校準(zhǔn)基片不存在光漂白問題，使用壽命長；無機(jī)熒光材料在基片表面固定牢度高，基本不會機(jī)械擦傷基片，無需苛刻的保存條件。本發(fā)明用途廣泛，可用于微陣列生物芯片掃描儀多通道檢測、熒光顯微鏡、熒光光譜儀、微孔板儀等常用熒光光學(xué)儀器的校準(zhǔn)和測試。
文檔編號G01N21/27GK1588006SQ20041006932
公開日2005年3月2日 申請日期2004年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月16日
發(fā)明者葛玥, 楊文軍, 趙淑英, 郭良宏, 程京 申請人:北京博奧生物芯片有限責(zé)任公司, 清華大學(xué)