專利名稱：特異結(jié)合反應測定方法、測定裝置以及其中所用試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及能夠?qū)悠分锌赡芎械谋粶y定物質(zhì)的含量進行測定的特異結(jié)合反應測定方法和該方法中使用的試劑盒以及特異結(jié)合反應測定裝置。
背景技術：
在醫(yī)療領域中，為了進行各種各樣疾病的診斷以及調(diào)查病狀的過程，廣泛進行對存在于人體液的各種疾病中特征的蛋白質(zhì)含量的測定。在這些蛋白質(zhì)含量的測定中，廣泛采用利用特異識別作為抗原的靶蛋白的抗體和抗原的反應(抗原抗體反應)的免疫反應測定方法?，F(xiàn)在，在免疫反應測定方法中開發(fā)了利用各種各樣原理的測定方法。
在上述各種各樣的免疫反應測定方法中，有人們都了解的為測定樣品中被測定物質(zhì)含量，對通過抗原抗體反應生成的抗原抗體復合物的凝集物(以下稱之為凝集復合物)進行檢測的免疫散射測濁法(以下略稱為散射測濁法)、免疫比濁法(以下略稱為比濁法)以及玻片凝集法等測定方法。在抗原抗體反應中，由于凝集復合物的生成使得反應體系中出現(xiàn)混濁。凝集復合物生成引起反應體系中出現(xiàn)的混濁程度與抗原的量和抗體的量有關。根據(jù)這一現(xiàn)象，散射測濁法和比濁法是對上述反應體系產(chǎn)生的混濁程度進行光學測定，由其測定值算出抗原的量或抗體的量的方法。具體來說，散射測濁法是根據(jù)反應體系中散射的光量的變化，而比濁法是根據(jù)反應體系中因散射而減少的透光量的變化測定凝集復合物的方法。一般來說，上述兩個測定方法在測定中可以使用同一反應體系。就是說任一方測定方法能夠測定的反應體系，另一方測定方法也能進行測定。玻片凝集法是通過將由于凝集復合物生成而出現(xiàn)的混濁或凝集塊在載玻片上等通過目視等進行判定的方法。即使是玻片凝集法在測定中也可以使用與散射測濁法、比濁法同樣的反應體系。以上列舉的三個測定方法由于是抗原和抗體都同樣以分散于反應體系中的狀態(tài)下進行的方法，所以統(tǒng)稱為“均一體系的免疫反應測定方法”。
另外在醫(yī)療領域中，為了進行各種各樣疾病的診斷以及病狀過程的調(diào)查，要進行多種被測定物質(zhì)含量的測定。例如在臨床檢查中作為腎臟過濾能力的指標，要對人尿中含有的總蛋白的含量進行測定，另外作為急性腎小體腎炎、IgA腎癥、腎結(jié)核、腎梗塞、腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎、前列腺炎等尿道炎癥、結(jié)石癥和腫瘤等的指標，要對人尿中含有的紅血球(血紅蛋白)的含量進行測定(例如，參照非專利文獻1)。另外下述專利文獻1概括了作為用于對多種被測定物質(zhì)進行測定的均一體系的免疫反應測定方法，對每個被測定物質(zhì)都準備不同的反應容器，一個一個地分別測定各被測定物質(zhì)的方法。
而在本說明書中將利用樣品中含有的被測定物質(zhì)和與被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的反應，測定樣品中被測定物質(zhì)含量的方法稱之為“特異結(jié)合反應測定方法”。上述的免疫反應測定方法也是特異結(jié)合反應測定方法的一種。
特開平5-2024號公報[非專利文獻1]金井泉原著、金井正光編著、「臨床檢查法提要」、修訂第31版、金原出版株式會社、1998年、156頁、179-181頁。
然而，用上述以往方法對多種被測定物質(zhì)進行測定時，需要準備與被測定物質(zhì)數(shù)相同數(shù)目的反應容器，測定需要大量的樣品。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是借鑒上述情況完成的發(fā)明，目的在于提供在一個反應容器內(nèi)可對多個被測定物質(zhì)進行測定的特異結(jié)合反應測定方法、方法中使用的試劑盒以及特異結(jié)合反應測定裝置。
本發(fā)明的特異結(jié)合反應測定方法是對測定樣品中被測定物質(zhì)含量進行測定的特異結(jié)合反應測定方法，包括構(gòu)建含有上述樣品、固定了與上述被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的磁性粒子的反應體系的工序(a)；對上述反應體系的光學特性進行測定的工序(b)；利用磁力從上述反應體系中除去含有上述被測定物質(zhì)和上述特異結(jié)合物質(zhì)以及上述磁性粒子的凝集復合物工序(c)。
按照本發(fā)明，在測定后的工序(c)中，通過利用磁力可以從上述反應體系中除去存在于反應體系中的磁性粒子、含有被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)以及磁性粒子的凝集復合物。特別是在本發(fā)明中，由于利用磁力完全不會給反應體系帶來化學方面的影響。因此，可以利用測定后的反應體系，通過各種測定方法對樣品中含有的其他成分進行測定。
另外以往對2種被測定物質(zhì)進行測定時，需要準備與被測定物質(zhì)數(shù)相同數(shù)目的反應容器。然而利用本發(fā)明，如果有一個可構(gòu)建反應體系的反應容器，那么可以利用該容器對2種被測定物質(zhì)進行測定。因此測定需要的樣品量可以非常少。由于這一原因，例如在醫(yī)療領域中，可以減少從患者採集的樣品量，減輕患者的負擔。
上述光學特性可以是散射光強度或透射光量。
上述磁性粒子的直徑最好是處于大約0.05～2μm范圍內(nèi)。
在上述工序(c)中優(yōu)選從上述反應體系中除去殘存于上述反應體系中的上述磁性粒子。
本發(fā)明的特異結(jié)合反應測定方法是對樣品中第1被測定物質(zhì)和第2被測定物質(zhì)的含量進行測定的特異結(jié)合反應測定方法，包括構(gòu)建含有上述樣品、固定了與上述第1被測定物質(zhì)特異結(jié)合的第1特異結(jié)合物質(zhì)的磁性粒子的反應體系的工序(a)；在上述工序(a)后，對上述反應體系的光學特性進行測定的工序(b)；利用磁力從上述反應體系中收集含有上述第1被測定物質(zhì)、上述第1特異結(jié)合物質(zhì)和上述磁性粒子的凝集復合物的工序(c)；向上述反應體系中添加對上述第2被測定物質(zhì)特異結(jié)合的第2特異結(jié)合物質(zhì)的工序(d)；以及在上述工序(d)后，對上述反應體系的光學特性進行測定的工序(e)。
依據(jù)本發(fā)明，在對第2被測定物質(zhì)進行測定時，由于反應體系中含有被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)以及磁性粒子的凝集復合物引起的反應體系的光學特性的變化可以通過利用磁力消除。特別是由于利用磁力完全不會給反應體系帶來化學方面的影響。因此，如果利用本發(fā)明的特異結(jié)合反應測定方法在對第2被測定物質(zhì)進行測定時，測定值的可靠性也會很高的。
而以往對2種被測定物質(zhì)的含量進行測定時，需要準備與被測定物質(zhì)種類數(shù)相同的2個反應容器，然而利用本發(fā)明，只要有一個可構(gòu)建反應體系的反應容器，那么利用該容器可以對2種被測定物質(zhì)的含量進行測定。因此測定需要的樣品量可以非常少。由于這一原因，例如在醫(yī)療領域中，可以減少從患者採集的樣品量，減輕患者的負擔。
在上述工序(d)中，反應體系最好是含有2～6重量％的聚乙二醇。
上述第2特異結(jié)合物質(zhì)最好是由與上述第2被測定物質(zhì)特異結(jié)合的抗原或抗體以及固定了上述抗原或抗體的非磁性粒子構(gòu)成。
上述磁性粒子的直徑大約在0.05～2μm范圍內(nèi)最好，而上述非磁性粒子的直徑大約在0.05～2μm范圍內(nèi)最好。
上述的第1被測定物質(zhì)和上述第2被測定物質(zhì)的組合可以是人血紅蛋白和人白蛋白的組合。
在上述工序(c)中優(yōu)選除去殘存于上述反應體系中的上述磁性粒子。
本發(fā)明另外的特異結(jié)合反應測定方法是對樣品中n種(n為2以上的整數(shù))的被測定物質(zhì)的含量進行測定的特異結(jié)合反應測定方法，包括構(gòu)建含有上述樣品、固定了與未測定的被測定物質(zhì)中的一種物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的磁性粒子的反應體系的工序(a)；在上述工序(a)后；對上述反應體系的光學特性進行測定的工序(b)；利用磁力從上述反應體系中除去含有上述一種被測定物質(zhì)和上述特異結(jié)合物質(zhì)以及上述磁性粒子的凝集復合物的工序(c)；在上述工序(c)后，進行判斷的工序(d)，以便使在上述工序(b)不到第(n-1)次時，再次進入到工序(a)；向上述反應體系中添加與上述反應體系中剩下的一種未測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的工序(e)；以及在上述工序(e)后，對上述反應體系的光學特性進行測定的工序(f)。
依據(jù)本發(fā)明，在光學特性測定后通過利用磁力可以除去含有被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)以及磁性粒子的凝集復合物。由于利用磁力完全不會給反應體系帶來化學方面的影響。由于這個原因，在對多個被測定物質(zhì)進行測定時，由于先形成的凝集復合物的影響幾乎被排除，所以在測定光學特性時，每次測定值的可靠性高。
以往對2種以上被測定物質(zhì)的含量進行測定時，需要準備與被測定物質(zhì)種類相同個數(shù)的反應容器，然而利用本發(fā)明，只要有一個可構(gòu)建反應體系的反應容器，就可以利用該容器對2種以上被測定物質(zhì)的含量進行測定。因此測定需要的樣品量可以非常少。由于這一原因，例如在醫(yī)療領域中，可以減少從患者採集的樣品量，減輕患者的負擔。
在上述工序(c)中優(yōu)選從上述反應體系中除去殘存于上述反應體系中的上述磁性粒子。
本發(fā)明另一個特異結(jié)合反應測定方法是對樣品中n種(n為2以上的整數(shù))的被測定物質(zhì)的含量進行測定的特異結(jié)合反應測定方法，包括構(gòu)建含有上述樣品、固定了與未測定的被測定物質(zhì)中的一種特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的磁性粒子的反應體系的工序(a)；在上述工序(a)后，對上述反應體系的光學特性進行測定的工序(b)；向反應體系添加含有可與由上述一種被測定物質(zhì)和上述特異結(jié)合物質(zhì)構(gòu)成的凝集復合物結(jié)合的物質(zhì)和磁性粒子的磁性復合物(c)；利用磁力從上述反應體系中除去結(jié)合上述磁性復合物的上述凝集復合物的工序(d)；在上述工序(d)后進行判斷的工序(e)，以便使在上述工序(b)不到第(n-1)次時，再次進入到工序(a)；向上述反應體系中添加與上述反應體系中剩下的一種未測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的工序(f)；以及在上述工序(e)后，對上述反應體系的光學特性進行測定的工序(g)。
依據(jù)本發(fā)明，在光學特性測定后可以利用磁力除去含有被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)的凝集復合物。由于利用磁力完全不會給反應體系帶來化學方面的影響。由于這個原因，在對多個被測定物質(zhì)進行測定時，由于先形成的凝集復合物的影響幾乎被排除，所以在進行光學特性測定時，每次測定值的可靠性高。
而以往對2種以上被測定物質(zhì)的含量進行測定時，需要準備與被測定物質(zhì)的種類數(shù)相同個數(shù)的反應容器，然而利用本發(fā)明，只要有一個可構(gòu)建反應體系的反應容器，就可以利用該容器對2種以上被測定物質(zhì)的含量進行測定。因此測定需要的樣品可以非常少。由于這一原因，例如在醫(yī)療領域中，可以減少從患者採集的樣品量，減輕患者的負擔。
在上述工序(d)中優(yōu)選從上述反應體系中除去沒有與上述凝集復合物結(jié)合的上述磁性復合物。
本發(fā)明的試劑盒是用于對樣品中第1被測定物質(zhì)以及第2被測定物質(zhì)的含量進行測定的試劑盒，其中含有固定了與上述第1被測定物質(zhì)特異結(jié)合的第1特異結(jié)合物質(zhì)的磁性粒子以及與上述第2被測定物質(zhì)特異結(jié)合的第2特異結(jié)合物質(zhì)。
如果在特異結(jié)合反應測定方法中利用本發(fā)明的試劑盒，只要有一個可構(gòu)建反應體系的反應容器，就可以利用該容器對2種以上被測定物質(zhì)的含量進行測定。因此測定需要的樣品量可以非常少。
上述磁性粒子的直徑大約在0.05～2μm范圍內(nèi)最好。
上述第2特異結(jié)合物質(zhì)最好是由與上述第2被測定物質(zhì)特異結(jié)合的抗原或抗體以及固定了上述抗原或抗體的非磁性粒子構(gòu)成。
本發(fā)明的另外試劑盒是用于對樣品中n種(n為2以上的整數(shù))的被測定物質(zhì)的含量進行測定的試劑盒，其中含有與上述n種被測定物質(zhì)中的一種被測定物質(zhì)特異結(jié)合的一種特異結(jié)合物質(zhì)；分別固定了與上述n種被測定物質(zhì)中剩下的(n-1)種被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的(n-1)種磁性粒子。
如果在特異結(jié)合反應測定方法中利用本發(fā)明的試劑盒，只要有一個可構(gòu)建反應體系的反應容器，利用該容器就可以對2種以上被測定物質(zhì)的含量進行測定。因此測定需要的樣品量可以非常少。
本發(fā)明的另外試劑盒是用于對樣品中n種(n為2以上的整數(shù))的被測定物質(zhì)的含量進行測定的試劑盒，其中含有分別與上述n種被測定物質(zhì)特異結(jié)合的n種特異結(jié)合物質(zhì)；含有可與由上述n種被測定物質(zhì)中的(n-1)種被測定物質(zhì)和與這些物質(zhì)對應的(n-1)種特異結(jié)合物質(zhì)構(gòu)成的凝集復合物結(jié)合的物質(zhì)以及固定有上述物質(zhì)的磁性粒子的磁性復合物。
如果在特異結(jié)合反應測定方法中利用本發(fā)明的試劑盒，只要有一個可構(gòu)建反應體系的反應容器，就可以利用該容器對2種以上被測定物質(zhì)的含量進行測定。因此測定需要的樣品量可以非常少。
本發(fā)明的特異結(jié)合反應測定裝置，其中備有室、將光對照上述室進行照射的光源、對來自上述反應體系的散射光或透射光進行檢測的光檢測器、上述室中含有磁性粒子時利用磁力從上述室內(nèi)除去上述磁性粒子的除去手段。
利用本發(fā)明可以得到非常適用于本發(fā)明上述特異結(jié)合反應測定方法的特異結(jié)合反應測定裝置。
圖1是表示本發(fā)明的一實施方式中的免疫反應測定方法的流程圖。
圖2(a)～(c)是表示圖1所示免疫反應測定方法的各個工序中反應體系模式圖。
圖3是表示本發(fā)明其他實施方式中的免疫反應測定方法的流程圖。
圖4(a)和(b)是表示圖3所示免疫反應測定方法中反應體系模式圖。
圖5是表示本發(fā)明另一實施方式中的免疫反應測定方法的流程圖。
圖6是表示本發(fā)明的又一實施方式中的免疫反應測定方法的流程圖。
圖7(a)和圖7(b)是表示圖6所示免疫反應測定方法中反應體系模式圖。
圖8是表示本發(fā)明一實施方式中的測定裝置構(gòu)成的模式圖。
圖9是表示圖8的測定裝置的一部分配置關系的圖。
圖10是表示本發(fā)明其他實施方式中的測定裝置構(gòu)成的模式圖。
圖11是表示圖10的測定裝置的一部分配置關系的圖。
圖12是表示圖10的測定裝置的一部分配置關系的圖。
圖中1樣品，2被測定物質(zhì)，2a第1被測定物質(zhì)，2b第2被測定物質(zhì)，3特異結(jié)合物質(zhì)，3a第1特異結(jié)合物質(zhì)，3b第2特異結(jié)合物質(zhì)，4、4a、4c磁性粒子，4b、5、5a、5c凝集復合物，6磁鐵，7抗體，8磁性復合物，100、200測定裝置，101、201光源，102、202室，103、203室架，104、204光檢測器，105永久磁鐵，106罩，107臂，108、208除去手段，202a排出口，205電磁鐵，206容器，207閥。
具體實施例方式
在以下各實施方式中，利用附圖對作為特異結(jié)合反應測定方法之一的免疫反應測定方法進行說明。為了簡單起見，各實施方式中共同的構(gòu)成要素賦予相同的參照符號。
(實施方式1)圖1是表示本實施方式的免疫反應測定方法的流程圖。圖2(a)～(c)是表示本實施方式的免疫反應測定方法各工序中反應體系模式圖。
首先，在圖1所示的工序St1中，就象圖2(a)表示的那樣，構(gòu)建含有要對被測定物質(zhì)2的含量進行測定的樣品1和固定了與被測定物質(zhì)2特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)3的磁性粒子4的反應體系。作為樣品1，例如可以是血液、尿等體液原樣，或?qū)⑦@些樣品與緩沖液混合后的混合液。而被測定物質(zhì)2是抗原時，特異結(jié)合物質(zhì)3是抗體，當被測定物質(zhì)2是抗體時，特異結(jié)合物質(zhì)3是抗原。
利用這樣的體系，當樣品中含有被測定物質(zhì)2時，就象圖2(b)表示的那樣，通過被測定物質(zhì)2與特異結(jié)合物質(zhì)3的抗原抗體反應，生成由被測定物質(zhì)2和特異結(jié)合物質(zhì)3以及磁性粒子4構(gòu)成的凝集復合物5。當樣品中不含有被測定物質(zhì)2時，就不產(chǎn)生由被測定物質(zhì)2與特異結(jié)合物質(zhì)3的抗原抗體反應生成凝集復合物5。
接下來在圖1所示的工序工序St2中，對反應體系的光學特性進行測定。此時，當上述工序St1中有凝集復合物5產(chǎn)生時，上述反應體系中出現(xiàn)混濁，散射光強度和透射光量等都發(fā)生變化。因此通過測定散射光強度或透射光量等可以估算反應體系混濁的程度。在此最好是一邊以測定前的樣品1作為基準，一邊對上述反應體系的光學變化量、即散射光強度或透射光量的變化量進行測定。另外將樣品1與緩沖液混合之后構(gòu)建反應體系時，以緩沖液作為基準也可以。
接下來在圖1所示的工序St3中，利用磁力(具體如圖2(c)所示的磁鐵6)可以回收由被測定物質(zhì)2和特異結(jié)合物質(zhì)3以及磁性粒子4構(gòu)成的凝集復合物5，以及沒有形成凝集復合物5的磁性粒子，將他們從反應體系中除去。
在免疫反應測定方法中，由于凝集復合物生成使得反應體系中出現(xiàn)的混濁程度依賴于抗原的量和抗體的量。根據(jù)這一現(xiàn)象通過本實施方式對上述反應體系的光學特性進行測定，從其測定值可以算出被測定物質(zhì)2的含量。
另外通過本實施方式，在測定后利用磁力可以將反應體系中存在的磁性粒子、由被測定物質(zhì)2和特異結(jié)合物質(zhì)3以及磁性粒子4構(gòu)成的凝集復合物5從反應體系中除去。在本實施方式中由于利用磁力，完全不會對反應體系帶來化學方面的影響。因此，可以利用測定后的體系，通過各種測定方法對樣品1中含有的其他成分進行測定。
而以往對2種被測定物質(zhì)的含量進行測定時，需要準備與被測定物質(zhì)數(shù)相同的2個反應容器，然而依據(jù)本實施方式，只要有一個可構(gòu)建反應體系的反應容器，就可以利用該容器對2種被測定物質(zhì)的含量進行測定。因此依據(jù)本實施方式，測定需要的樣品量可以非常少。由于這一原因，例如在醫(yī)療領域中，可以減少從患者採集的樣品量，減輕患者的負擔。
另外，在本實施方式中也可以利用pH3.0以下酸性條件阻礙抗原抗體反應現(xiàn)象，以便從反應體系除去的凝集復合物5和磁性粒子(沒有圖示)中，以被固定的抗體或抗原具有反應性的狀態(tài)對磁性粒子進行回收、再利用?；蛘撸ㄟ^用強酸或強堿處理、基于表面活性劑清洗，將固定在磁性粒子上的抗體或抗原完全除去，將別的抗體或抗原固定在該磁性粒子上也可以。
在本實施方式的免疫反應測定方法中使用的磁性粒子4最好是在反應體系中不溶的。作為磁性粒子4的具體例子，如鐵氧體粒子、鐵氧體膠體粒子、含有鐵氧體的膠乳粒子等。這樣的磁性粒子可以自己制作。特別是通過對菌體內(nèi)含有0.05～0.1μm的磁性粒子的磁性細菌進行培養(yǎng)使菌數(shù)增加，用法式壓力機等進行破碎之后，用磁鐵收集分離、取出菌體內(nèi)的磁性粒子，可以得到具有大致均一直徑的磁性粒子。利用磁性細菌得到磁性粒子的方法更詳細地記載于特開2000-346843號公報。
由磁性細菌得到的磁性粒子用脂質(zhì)雙層膜包被。這樣做后，在水溶液等溶液等中的分散性良好，而且也適用于對作為特異結(jié)合物質(zhì)的抗體等蛋白質(zhì)進行固定。
在本實施方式中使用的磁性粒子4的直徑，從容易均一分散于水溶液中的觀點、能夠?qū)τ糜诙炕诳乖贵w反應生成的凝集復合物的散射光強度或透射光量的變化量進行檢測的觀點出發(fā)，最好是0.05～2μm。
在本實施方式中，例舉了用于收集磁性粒子的產(chǎn)生磁力的磁鐵6，更具體地講該磁鐵6可以是永久磁鐵、電磁鐵等。
在本實施方式的免疫反應測定方法的反應體系中，根據(jù)其用途等可以添加該領域中眾所周知的任意成分。例如，為了減少被測定物質(zhì)2以及特異結(jié)合物質(zhì)3的各自的自身凝集引起的非特異性凝集，在本實施方式中，也可以向反應體系中添加Tween 20、辛基糖苷、十二烷基硫酸鈉(SDS)、蔗糖甘油單月桂酸酯、CHAPS等表面活性劑。上述表面活性劑在反應體系中的含量從抗原抗體反應障礙少的觀點出發(fā)，0.3重量％以下比較好，0.1重量％以下更好。
在本實施方式的免疫反應測定方法中，作為在工序St2中進行測定的光學特性，既可以對散射光強度的變化進行測定(散射測濁法)，也可以對來自反應體系的透射光量的變化進行測定(比濁法)。
在本實施方式中，被測定物質(zhì)沒有特別限定，只要是利用抗原抗體反應能夠測定的物質(zhì)都可以。例如蛋白質(zhì)、核酸、脂類、細菌、病毒以及半抗原等。特別是本實施方式的免疫反應測定方法以及試劑盒適合以往在臨床檢查中利用抗原抗體反應測定的測定對象即蛋白質(zhì)的測定。作為蛋白質(zhì)例如可以是LH(促黃體素)、FSH(促卵胞素)、hCG(人絨毛膜促性激素)等激素，以及各種免疫球蛋白類和亞類、補體成分、各種傳染病的標志物、CRP、白蛋白、血紅蛋白、類風濕因子以及血型抗原等。
本實施方式中使用的抗體沒有特別限定，只要是通過與抗原特異結(jié)合，可與抗原形成凝集復合物的抗體，沒有特別限定。例如無論是IgG、IgM、IgE、IgA、IgD中的哪一類抗體，還是這些抗體的混合物都可以。另外無論是多克隆抗體，還是單克隆抗體都可以，即使是他們的混合物也可以。其中IgG抗體最好，這是由于IgG抗體具有難于產(chǎn)生非特異反應的性質(zhì)，另外由于銷售的產(chǎn)品比較多、容易買到的緣故。另外抗體來自動物的種類也沒有特別限定，但由于來自兔、山羊、小鼠的抗體比較容易獲得，使用的例子也比較多，所以比較好。
而在本實施方式中，作為特異結(jié)合反應測定方法，雖然對利用抗原抗體反應的免疫反應測定方法進行了說明，也可以通過利用抗原抗體反應以外的發(fā)生特異結(jié)合的反應使凝集復合物生成，進行測定。利用抗原抗體反應以外的發(fā)生特異結(jié)合的反應時，被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)的組合如配體和受體的組合，單鏈DNA(被測定物質(zhì))與含有與該單鏈DNA互補序列的各種DNA片段之間的組合等。
作為配體和受體組合的例子，如可作為配體的分子和對該分子具有多個結(jié)合部位的變構(gòu)蛋白的組合。當在作為配體的分子內(nèi)只存在一個與變構(gòu)蛋白結(jié)合的部位時，如果通過在與變構(gòu)蛋白結(jié)合部分以外的部位將作為配體的分子固定在磁性粒子上，就可以使作為配體的分子和變構(gòu)蛋白之間的凝集復合物生成。
另外，在將單鏈DNA作為被測物質(zhì)、將各種DNA片段作為特異結(jié)合物質(zhì)時，只要以能夠互補結(jié)合在作為被測物質(zhì)的單鏈DNA上的狀態(tài)將各種DNA片段固定在磁性粒子上即可。
(實施方式2)在本實施方式中，參照圖，對可以測定2種被測定物質(zhì)含量的免疫反應測定方法進行說明。
圖3是表示本實施方式的免疫反應測定方法的流程圖。圖4(a)和4(b)是表示本實施方式的免疫反應測定方法中反應體系模式圖。
首先在圖3表示的St21中，構(gòu)建含有要對第1被測定物質(zhì)以及第2被測定物質(zhì)的含量進行測定的樣品和固定了與第1被測定物質(zhì)特異結(jié)合的第1特異結(jié)合物質(zhì)的磁性粒子的反應體系。作為樣品，例如可以是血液、尿等體液原樣，或?qū)⑦@些樣品與緩沖液混合后的混合液。而被測定物質(zhì)1是抗原時，第1特異結(jié)合物質(zhì)是抗體，當被測定物質(zhì)1是抗體時，第1特異結(jié)合物質(zhì)是抗原。
利用這樣的體系，就象圖4(a)表示的那樣，當樣品中含有第1被測定物質(zhì)2a時，通過第1被測定物質(zhì)2a與第1特異結(jié)合物質(zhì)3a的抗原抗體反應，生成由第1被測定物質(zhì)2a與第1特異結(jié)合物質(zhì)3a以及磁性粒子4a構(gòu)成的凝集復合物5a。當樣品中不含有第1被測定物質(zhì)2a時，就不會由第1被測定物質(zhì)2a與第1特異結(jié)合物質(zhì)3a的抗原抗體反應生成凝集復合物5a。
接下來在圖3所示的工序工序St22中，對反應體系的光學特性進行測定。此時，當上述工序St21中有凝集復合物5a產(chǎn)生時，上述反應體系中出現(xiàn)混濁，散射光強度或透射光量等都發(fā)生變化。因此通過測定散射光強度或透射光量等可以估算反應體系混濁的程度。在此最好是一邊以測定前的樣品作為基準，一邊對上述反應體系的光學上的變化量、即散射光強度或透射光量的變化量進行測定。另外將樣品與緩沖液混合之后構(gòu)建反應體系時，以緩沖液作為基準也可以。
接下來在圖3所示的工序St23中，利用磁力可以收集由第1被測定物質(zhì)2a與第1特異結(jié)合物質(zhì)3a以及磁性粒子4a構(gòu)成的凝集復合物5a；以及沒有形成凝集復合物5a的磁性粒子。此時，可以將凝集復合物5a以及磁性粒子從反應體系中除去，另外為了不妨礙后述的工序St25中的反應體系的光學特性測定，也可以集中放置在構(gòu)建反應體系的反應容器內(nèi)的一個地方。
然后，在圖3所示的工序St24中，向反應體系添加與第2被測定物質(zhì)特異結(jié)合的第2特異結(jié)合物質(zhì)。例如第2被測定物質(zhì)是抗原時，第2特異結(jié)合物質(zhì)是抗體，當?shù)?被測定物質(zhì)是抗體時，第2特異結(jié)合物質(zhì)是抗原。
利用這樣的體系，就象圖4(b)表示的那樣，當樣品中含有第2被測定物質(zhì)時，通過第2被測定物質(zhì)2b與第2特異結(jié)合物質(zhì)3b的抗原抗體反應，生成由第2被測定物質(zhì)2b與第2特異結(jié)合物質(zhì)3b構(gòu)成的凝集復合物4b。不用說，當樣品中不含有第2被測定物質(zhì)2b時，就不會由第2被測定物質(zhì)2b與第2特異結(jié)合物質(zhì)3b的抗原抗體反應生成凝集復合物4b。
接下來在圖3所示的工序St25中，對反應體系的光學特性進行測定。此時，當上述工序St24中有凝集復合物4b產(chǎn)生時，上述反應體系中出現(xiàn)混濁，散射光強度和透射光量等都發(fā)生變化。因此通過測定散射光強度或透射光量等可以估算反應體系混濁的程度。在此最好是一邊以測定前的樣品作為基準，一邊對上述反應體系的光學上的變化量、即散射光強度或透射光量的變化量進行測定。另外將樣品與緩沖液混合之后構(gòu)建反應體系時，以緩沖液作為基準也可以。
特別是在上述工序St23中，就象圖4(b)表示的那樣，由于利用磁力可以收集凝集復合物5a以及沒有形成凝集復合物5a的磁性粒子，所以在本工序中對反應體系的光學特性進行測定時，可以測定只由凝集復合物4b引起的散射光強度和透射光量等的變化。
特別是利用本實施方式，在對第2被測定物質(zhì)2b進行測定時，利用磁力可以消除掉由反應體系中存在的磁性粒子4a以及由被測定物質(zhì)2a、特異結(jié)合物質(zhì)3a和磁性粒子4a構(gòu)成的凝集復合物5a引起的反應體系的光學變化。由于利用磁力，完全不會對反應體系帶來化學方面的影響。因此，利用本實施方式的免疫反應測定方法，在對第2被測定物質(zhì)2b進行測定時，測定值的可靠性也很高。
而以往對2種被測定物質(zhì)的含量進行測定時，需要準備與被測定物質(zhì)種類數(shù)相同的2個反應容器，然而依據(jù)本實施方式，只要有一個可構(gòu)建反應體系的反應容器，利用該容器就可以對2種被測定物質(zhì)的含量進行測定。因此按照本實施方式，測定需要的樣品量可以非常少。由于這一原因，所以例如在醫(yī)療領域中，可以減少從患者採集的樣品量，減輕患者的負擔。
另外，在本實施方式中也可以利用pH3.0以下酸性條件阻礙抗原抗體反應現(xiàn)象，以便從反應體系除去的凝集復合物和磁性粒子中，以被固定的抗體或抗原具有反應性的狀態(tài)對磁性粒子進行回收、再利用?；蛘?，通過用強酸或強堿處理、基于表面活性劑清洗，將固定在磁性粒子上的抗體或抗原完全除去，將別的抗體或抗原固定在該磁性粒子上也可以。
以下對本實施方式的免疫反應測定方法中使用的試劑盒進行說明。一邊參照圖4(a)和(b)，一邊進行說明。
本實施方式的免疫反應測定方法中使用的試劑盒含有固定了與上述第1被測定物質(zhì)2a特異結(jié)合的第1特異結(jié)合物質(zhì)3a的磁性粒子4a以及與上述第2被測定物質(zhì)2b特異結(jié)合的第2特異結(jié)合物質(zhì)3b。
當?shù)?被測定物質(zhì)2a是抗原時，第1特異結(jié)合物質(zhì)3a為抗體；當?shù)?被測定物質(zhì)2a是抗體時，第1特異結(jié)合物質(zhì)3a為抗原。另外當?shù)?被測定物質(zhì)2b是抗原時，第2特異結(jié)合物質(zhì)3b為抗體；當?shù)?被測定物質(zhì)2b是抗體時，第2特異結(jié)合物質(zhì)3b為抗原。
如果將本實施方式的試劑盒用在本實施方式的免疫反應測定方法中，只要有一個可構(gòu)建反應體系的反應容器，利用該容器就可以對2種被測定物質(zhì)的含量進行測定。因此使用本實施方式的試劑盒，測定需要的樣品量可以非常少。
特別是就象圖4(b)表示的那樣，在對第2被測定物質(zhì)2b進行測定時，可以利用磁力消除掉由反應體系中存在的磁性粒子4a以及由被測定物質(zhì)2a、特異結(jié)合物質(zhì)3a和磁性粒子4a構(gòu)成的凝集復合物5a引起的反應體系的光學變化。由于利用磁力，完全不會對反應體系帶來化學方面的影響。因此，利用本實施方式的免疫反應測定方法，在對第2被測定物質(zhì)2b進行測定時，測定值的可靠性也很高。
在本實施方式的免疫反應測定方法以及試劑盒中使用的磁性粒子4a最好是在反應體系中不溶的。作為磁性粒子4a的具體例子，如鐵氧體粒子、鐵氧體膠體粒子、含有鐵氧體的膠乳粒子等。這樣的磁性粒子可以自己制作。特別是通過對菌體內(nèi)含有0.05～0.1μm的磁性粒子的磁性細菌進行培養(yǎng)使菌數(shù)增加，用法式壓力機等進行破碎之后，用磁鐵收集分離、取出菌體內(nèi)的磁性粒子，可以得到具有大致均一直徑的磁性粒子。利用磁性細菌得到磁性粒子的方法更詳細地記載于特開2000-346843號公報。
由磁性細菌得到的磁性粒子用脂質(zhì)雙層膜包被。因此在水溶液等溶液中的分散性良好，而且也適用于對作為特異結(jié)合物質(zhì)的抗體等蛋白質(zhì)進行固定。
在本實施方式中使用的磁性粒子4a的直徑從均一分散于水溶液中容易的觀點、能夠?qū)τ糜诙炕诳乖贵w反應的凝集復合物的散射光強度或透射光量的變化量進行檢測的觀點出發(fā)，最好是0.05～2μm。
在本實施方式中，例舉了用于收集磁性粒子的產(chǎn)生磁力的磁鐵6，更具體地講該磁鐵6可以是永久磁鐵、電磁鐵等。
在本實施方式的免疫反應測定方法以及試劑盒中作為第2特異結(jié)合物質(zhì)3b，例如可以是抗原或抗體，但不限定于這些。特別是第2特異結(jié)合物質(zhì)3b最好是固定了與第2被測定物質(zhì)2b發(fā)生抗原抗體反應的抗原或抗體的非磁性粒子。這樣在對第2被測定物質(zhì)2b進行測定時(即工序St25)的光學特性的變化范圍與測定第1被測定物質(zhì)2a時(即工序St22)的光學特性的變化范圍沒有太大的變化。因此，測定使用的裝置的調(diào)整變得容易。另外第2被測定物質(zhì)2b的抗原抗體反應的進行完全不受到來自磁力的影響也是最理想的理由。
作為非磁性粒子，如玻璃粒子、石墨粒子、膠體金粒子、膠乳粒子等。其中從穩(wěn)定性高、容易獲得具有各種各樣直徑的粒子的觀點看，膠乳粒子比較好，特別是對蛋白質(zhì)吸附性好的聚乙烯膠乳粒子更好。
對于上述非磁性粒子要求容易均一分散到溶液中，以及對用于由抗原抗體反應形成的凝集復合物進行定量的散射光強度和透射光量的變化量可進行檢測。因此上述非磁性粒子的直徑最好是0.05～2μm，從與使用磁性粒子4a時的測定和光學特性的變化范圍做到同等的觀點出發(fā)，如果與磁性粒子4a的直徑同等更好。
在本實施方式的免疫反應測定方法的反應體系中，根據(jù)其用途可以添加該領域眾所周知的任意成分。例如當?shù)?特異結(jié)合物質(zhì)3b不是固定了抗原或抗體的非磁性粒子時，在工序St24中也可以向反應體系加入聚乙二醇。而為了向工序St24中反應體系添加聚乙二醇，可以向試劑盒中附加聚乙二醇。聚乙二醇的含量相對于反應體系2～6重量％比較好，4重量％更好。反應體系中含有上述濃度的聚乙二醇時，第2被測定物質(zhì)2b和第2特異結(jié)合物質(zhì)3b各自的自身凝集引起的非特異凝集變少，測定靈敏度提高。
另外為了減少在工序St22和工序St25中第1被測定物質(zhì)2a、第1特異結(jié)合物質(zhì)3a、第2被測定物質(zhì)2b以及第2特異結(jié)合物質(zhì)3b各自的自身凝集引起的非特異凝集，在本實施方式中，也可以向反應體系中添加Tween20、辛基糖苷、十二烷基硫酸鈉(SDS)、蔗糖甘油單月桂酸酯、CHAPS等表面活性劑。上述表面活性劑在反應體系中的含量從減少抗原抗體反應的障礙觀點出發(fā)，0.3重量％以下比較好，0.1重量％以下更好。
在本實施方式的免疫反應測定方法中，作為在工序St22和工序St25中進行測定的光學特性可以測定散射光強度的變化(散射測濁法)，也可以測定來自反應體系的透射光量的變化(比濁法)。
在本實施方式中，第1被測定物質(zhì)2a以及第2被測定物質(zhì)2b沒有特別限定，只要是利用抗原抗體反應能夠測定的物質(zhì)都可以。例如蛋白質(zhì)、核酸、脂類、細菌、病毒以及半抗原等。特別是本實施方式的免疫反應測定方法以及試劑盒適用于以往在臨床檢查中利用抗原抗體反應進行測定的對象即蛋白質(zhì)的測定。作為蛋白質(zhì)例如可以是LH(促黃體素)、FSH(促卵胞素)、hCG(人絨毛膜促性激素)等激素，以及各種免疫球蛋白類和亞類、補體成分、各種傳染病的標志物、CRP、白蛋白、血紅蛋白、類風濕因子以及血型抗原等。例如，在本實施方式中，如果將第1被測定物質(zhì)2a以及第2被測定物質(zhì)2b分別定為人血紅蛋白和人白蛋白，可以提供適于腎臟疾病初期篩選的測定結(jié)果。這是由于尿中的人血紅蛋白容易成為急性腎小體腎炎、IgA腎癥、腎結(jié)核、腎梗塞、腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎、前列腺炎等尿道炎癥的指標，尿中的人白蛋白容易反映出尿中的蛋白質(zhì)總量的變化，因此可以進行腎功能的評價。
本實施方式中使用的抗體只要是通過與抗原特異結(jié)合，能夠與抗原形成凝集復合物的就可以，沒有特別限定。例如可以是IgG、IgM、IgE、 IgA、IgD中的任一類抗體，也可以是這些抗體的混合物。另外無論是多克隆抗體還是單克隆抗體都可以，即使是他們的混合物也可以。其中IgG抗體最好，這是由于IgG抗體具有難于產(chǎn)生非特異反應的性質(zhì)，另外由于銷售的產(chǎn)品比較多、容易買到的緣故。另外抗體來自動物的種類也沒有特別限定，但由于來自兔、山羊、小鼠的抗體比較容易獲得，使用的例子也比較多，所以比較好。
另外在本實施方式中，作為特異結(jié)合反應測定方法雖然對利用抗原抗體反應的免疫反應測定方法進行了說明，也可以通過利用抗原抗體反應以外的發(fā)生特異結(jié)合的反應使凝集復合物生成，進行測定。利用抗原抗體反應以外的發(fā)生特異結(jié)合的反應時，被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)的組合如配體和受體的組合，單鏈DNA(被測定物質(zhì))與含有與該單鏈DNA互補序列的各種DNA片段之間的組合等。
作為配體和受體組合的例子，如可作為配體的分子和對該分子具有多個結(jié)合部位的變構(gòu)蛋白的組合。在作為配體的分子內(nèi)只存在一個與變構(gòu)蛋白結(jié)合的部位時，如果通過在與變構(gòu)蛋白結(jié)合部分以外的部位將作為配體的分子固定在磁性粒子、非磁性分子等上，就可以使作為配體的分子和變構(gòu)蛋白之間的凝集復合物生成。
另外，在將單鏈DNA作為被測物質(zhì)、將各種DNA片段作為特異結(jié)合物質(zhì)時，只要以能夠互補結(jié)合在作為被測物質(zhì)的單鏈DNA上的狀態(tài)將各種DNA片段固定在磁性粒子、非磁性粒子等上即可。
(實施方式3)在本實施方式中一邊參照附圖，一邊對將上述實施方式2的免疫反應測定方法擴展到能夠?qū)Χ喾N被測定物質(zhì)的含量進行測定的免疫反應測定方法進行說明。
圖5是表示本實施方式的免疫反應測定方法的流程圖。
首先，在圖5所示的工序St31中，構(gòu)建含有要對n種(n為2以上的整數(shù))被測定物質(zhì)的含量進行測定的樣品和固定了與未測定的被測定物質(zhì)中的一種特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的磁性粒子的反應體系。作為樣品例如可以是血液、尿等體液原樣，或?qū)⑦@些樣品與緩沖液混合后的混合液。而被測定物質(zhì)是抗原時，特異結(jié)合物質(zhì)是抗體，當被測定物質(zhì)是抗體時，特異結(jié)合物質(zhì)是抗原。
利用這樣的體系，當樣品中含有被測定物質(zhì)時，通過被測定物質(zhì)與特異結(jié)合物質(zhì)的抗原抗體反應，生成與上述實施方式2的圖4(a)所示的凝集復合物5a相同的由被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)以及磁性粒子構(gòu)成的凝集復合物。當樣品中不含有被測定物質(zhì)時，就不會由被測定物質(zhì)與特異結(jié)合物質(zhì)的抗原抗體反應生成凝集復合物。
接下來在圖5所示的工序St32中，對反應體系的光學特性進行測定。此時，當上述工序St31中有凝集復合物產(chǎn)生時，上述反應體系中出現(xiàn)混濁，散射光強度或透射光量等都發(fā)生變化。因此通過測定散射光強度或透射光量等可以估算反應體系混濁的程度。在此最好是一邊以測定前的樣品作為基準，一邊對上述反應體系的光學方面的變化量、即散射光強度或透射光量的變化量進行測定。另外將樣品與緩沖液混合之后構(gòu)建反應體系時，以緩沖液作為基準也可以。
接下來在圖5所示的工序St33中，利用磁力可以從反應體系中除去由被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)以及磁性粒子構(gòu)成的凝集復合物，以及沒有形成凝集復合物的磁性粒子。
接下來，在圖5所示的工序St34中，對上述工序St32是否是第(n-1)次進行判斷。此時當上述工序St32是第(n-1)次時，向工序St35進行。當上述工序St32不到第(n-1)次時，再度進行工序St31。就是說，在上述工序St32達到第(n-1)次之前，反復進行工序St31～St33。通過這樣操作，n種被測定物質(zhì)中的(n-1)種被測定物質(zhì)從反應體系中被除去。
接下來，在圖5所示的工序St35中，向反應體系中添加與上述反應體系中剩下的一種未測定的被測物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)。此時，例如被測定物質(zhì)是抗原時，特異結(jié)合物質(zhì)為抗體，如果被測定物質(zhì)是抗體時，特異結(jié)合物質(zhì)為抗原。
利用這樣的體系，當樣品中含有被測定物質(zhì)時，通過被測定物質(zhì)與特異結(jié)合物質(zhì)的抗原抗體反應，生成與上述實施方式2的圖4(b)表示的凝集復合物4b相同的由被測定物質(zhì)與特異結(jié)合物質(zhì)構(gòu)成的凝集復合物。不用說，當樣品中不含有被測定物質(zhì)時，就不會由被測定物質(zhì)與特異結(jié)合物質(zhì)的抗原抗體反應生成凝集復合物。
接下來在圖5所示的工序St36中，對反應體系的光學特性進行測定。此時，當上述工序St35中有凝集復合物產(chǎn)生時，上述反應體系中出現(xiàn)混濁，散射光強度和透射光量等都發(fā)生變化。因此通過測定散射光強度或透射光量等可以估算反應體系混濁的程度。在此最好是一邊以測定前的樣品作為基準，一邊對上述反應體系的光學上的變化量、即散射光強度或透射光量的變化量進行測定。另外將樣品與緩沖液混合之后構(gòu)建反應體系時，以緩沖液作為基準也可以。
特別是在上述工序St33中，由于利用磁力可以收集凝集復合物以及沒有形成凝集復合物的磁性粒子，所以在本工序中對反應體系的光學特性進行測定時，可以測定只由凝集復合物引起的散射光強度和透射光量等的變化。
依據(jù)本實施方式，在光學特性測定后利用磁力消除掉了由被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)以及磁性粒子構(gòu)成的凝集復合物引起的反應體系的光學變化。由于利用磁力，完全不會對反應體系帶來化學方面的影響。因此，在對多個被測定物質(zhì)進行測定時，由于幾乎排除了先前形成的凝集復合物的影響，所以在進行光學特性測定時，每次測定值的可靠性都很高。
特別是以往對2種以上被測定物質(zhì)的含量進行測定時，需要準備與被測定物質(zhì)種類數(shù)相同個數(shù)的反應容器，然而依據(jù)本實施方式，只要有一個可構(gòu)建反應體系的反應容器，利用該容器就可以對2種以上被測定物質(zhì)的含量進行測定。因此按照本實施方式，測定需要的樣品量可以非常少。由于這一原因，所以例如在醫(yī)療領域中，可以減少從患者採集的樣品量，減輕患者的負擔。
另外，在本實施方式中也可以利用pH3.0以下酸性條件阻礙抗原抗體反應現(xiàn)象，以便從反應體系除去的凝集復合物和磁性粒子中，以被固定的抗體或抗原具有反應性的狀態(tài)對磁性粒子進行回收、再利用?；蛘?，通過用強酸或強堿處理、以及基于表面活性劑清洗，將固定在磁性粒子上的抗體或抗原完全除去，將別的抗體或抗原固定在該磁性粒子上也可以。
以下對本實施方式的免疫反應測定方法中使用的試劑盒進行說明。
在本實施方式的免疫反應測定方法中使用的試劑盒含有分別固定了與(n-1)種被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的磁性粒子以及與剩下的一種未測定的被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)。
如果將本實施方式的試劑盒用在本實施方式的免疫反應測定方法中，只要有一個可構(gòu)建反應體系的反應容器，就可以利用該容器就可以對2種以上的被測定物質(zhì)的含量進行測定。因此使用本實施方式的試劑盒，測定需要的樣品量可以非常少。
作為在本實施方式的免疫反應測定方法以及試劑盒中使用的磁性粒子以及用于回收磁性粒子的磁鐵6可以使用與上述實施方式2中說明的完全相同的磁性粒子和磁鐵。
另外在本實施方式的免疫反應測定方法以及試劑盒中，作為圖5所示的工序St35中添加的特異結(jié)合物質(zhì)，最好是固定了與反應體系剩下的一種未測定的被測定物質(zhì)發(fā)生抗原抗體反應的抗原或抗體的非磁性粒子。這樣在工序St36中的被測定物質(zhì)測定中的光學特性的變化范圍與工序St32中的(n-1)種被測定物質(zhì)測定中的光學特性的變化范圍沒有太大的變化。因此，測定使用的裝置的調(diào)整變得容易。
作為非磁性粒子可以使用與上述實施方式2敘述的完全相同的非磁性粒子。即上述非磁性粒子的直徑最好是0.05～2μm，如果與上述的磁性粒子的直徑同等更好。
在本實施方式的免疫反應測定方法的反應體系中，根據(jù)其用途可以添加該領域眾所周知的任意成分。例如當特異結(jié)合物質(zhì)不是固定了抗原或抗體的非磁性粒子時，在工序St35中可以向反應體系加入聚乙二醇。而為了向工序St35中反應體系添加聚乙二醇，可以在試劑盒中附加聚乙二醇。聚乙二醇的含量相對于反應體系，2～6重量％比較好，4重量％更好。反應體系中含有上述濃度的聚乙二醇時，在工序St36中，各個被測定物質(zhì)或各個特異結(jié)合物質(zhì)各自的自身凝集引起的非特異凝集減少，測定靈敏度提高。
另外為了減少在工序St32和工序St36中由于各被測定物質(zhì)以及各特異結(jié)合物質(zhì)各自的自身凝集引起的非特異凝集，在本實施方式中，也可以向反應體系中添加Tween20、辛基糖苷、十二烷基硫酸鈉(SDS)、蔗糖甘油單月桂酸酯、CHAPS等表面活性劑。上述表面活性劑在反應體系中的含量從減少抗原抗體反應的障礙觀點出發(fā)，0.3重量％以下比較好，0.1重量％以下更好。
在本實施方式的免疫反應測定方法中，作為在工序St32和工序St36中進行測定的光學特性可以測定散射光強度的變化(散射測濁法)，也可以測定來自反應體系的透射光量的變化(比濁法)。
在本實施方式中，n種各被測定物質(zhì)沒有特別限定，只要是利用抗原抗體反應能夠測定的物質(zhì)都可以。例如蛋白質(zhì)、核酸、脂類、細菌、病毒以及半抗原等。特別是本實施方式的免疫反應測定方法以及試劑盒適用于以往在臨床檢查中利用抗原抗體反應進行測定的對象即蛋白質(zhì)的測定。作為蛋白質(zhì)例如可以是LH(促黃體素)、FSH(促卵胞素)、hCG(人絨毛膜促性激素)等激素，以及各種免疫球蛋白類和亞類、補體成分、各種傳染病的標志物、CRP、白蛋白、血紅蛋白、類風濕因子以及血型抗原等。
本實施方式中使用的抗體只要是通過與抗原特異結(jié)合，能夠與抗原形成凝集復合物的就可以，沒有特別限定。例如可以是IgG、IgM、IgE、IgA、IgD中的任一類抗體，也可以是這些抗體的混合物。另外無論是多克隆抗體還是單克隆抗體都可以，即使是他們的混合物也可以。其中IgG抗體最好，這是由于IgG抗體具有難于產(chǎn)生非特異反應的性質(zhì)，另外由于銷售的產(chǎn)品比較多、容易買到的緣故。另外抗體來自動物的種類也沒有特別限定，但由于來自兔、山羊、小鼠的抗體比較容易獲得，使用的例子也比較多，所以比較好。
在本實施方式中，作為特異結(jié)合反應測定方法雖然對利用抗原抗體反應的免疫反應測定方法進行了說明，也可以通過利用抗原抗體反應以外的發(fā)生特異結(jié)合的反應使凝集復合物生成，進行測定。利用抗原抗體反應以外的發(fā)生特異結(jié)合的反應時，被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)的組合如配體和受體的組合、單鏈DNA(被測定物質(zhì))與含有與該單鏈DNA互補序列的各種DNA片段之間的組合等。
作為配體和受體組合的例子，如可作為配體的分子和對該分子具有多個結(jié)合部位的變構(gòu)蛋白的組合。在作為配體的分子內(nèi)只存在一個與變構(gòu)蛋白結(jié)合的部位時，如果通過在與變構(gòu)蛋白結(jié)合部分以外的部位將作為配體的分子固定在磁性粒子、非磁性分子等上，就可以使作為配體的分子和變構(gòu)蛋白的凝集復合物生成。
另外，在將單鏈DNA作為被測物質(zhì)、將各種DNA片段作為特異結(jié)合物質(zhì)時，只要以能夠互補結(jié)合在作為被測物質(zhì)的單鏈DNA上的狀態(tài)將各種DNA片段固定在磁性粒子上即可。
(實施方式4)在本實施方式中一邊參照附圖一邊對能夠?qū)Χ喾N被測定物質(zhì)的含量進行測定的另外的免疫反應測定方法進行說明。
圖6是表示本實施方式的免疫反應測定方法的流程圖。圖7(a)和7(b)是表示本實施方式的免疫反應測定方法中反應體系模式圖。
首先，在圖6所示的工序St41中，構(gòu)建含有要對n種(n為2以上的整數(shù))被測定物質(zhì)的含量進行測定的樣品和固定了與未測定的被測定物質(zhì)中的一種特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的反應體系。作為樣品例如可以是血液、尿等體液。被測定物質(zhì)是抗原時，特異結(jié)合物質(zhì)是抗體，當被測定物質(zhì)是抗體時，特異結(jié)合物質(zhì)是抗原。
利用這樣的體系，就象圖7(a)所示的那樣，當樣品中含有一種被測定物質(zhì)2a時，通過被測定物質(zhì)2a與特異結(jié)合物質(zhì)3a的抗原抗體反應，生成由被測定物質(zhì)2a與特異結(jié)合物質(zhì)3a構(gòu)成的凝集復合物5c。當樣品中不含有被測定物質(zhì)2a時，就不會由被測定物質(zhì)2a與特異結(jié)合物質(zhì)3a的抗原抗體反應生成凝集復合物5c。
接下來在圖6所示的工序工序St42中，對反應體系的光學特性進行測定。此時，當上述工序St41中有凝集復合物產(chǎn)生時，上述反應體系中出現(xiàn)混濁，散射光強度和透射光量等都發(fā)生變化。因此通過測定散射光強度或透射光量等可以估算反應體系混濁的程度。在此最好是一邊以測定前的樣品作為基準，一邊對上述反應體系的光學的變化量、即散射光強度或透射光量的變化量進行測定。另外將樣品與緩沖液混合之后構(gòu)建反應體系時，以緩沖液作為基準也可以。
接下來，在圖6所示的工序St43中，將由能夠與由上述一種被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)構(gòu)成的凝集復合物結(jié)合的物質(zhì)(例如能夠與凝集復合物中含有的抗體結(jié)合的抗體)和磁性粒子構(gòu)成的磁性復合物添加到反應體系中。通過這樣操作，如圖7(b)表示的那樣，由抗體7和磁性粒子4c構(gòu)成的磁性復合物8結(jié)合在凝集復合物5c上。
接下來在圖6所示的工序St44中，利用磁力可以從反應體系中除去結(jié)合了磁性復合物的凝集復合物和沒有與凝集復合物結(jié)合的磁性復合物。通過這樣操作，如圖7(b)表示的那樣，通過磁力，凝集復合物5c與磁性復合物8一起被除去，反應體系內(nèi)剩下了另一被測定物質(zhì)2b。
接下來，在圖6所示的工序St45中，對上述工序St42是否是第(n-1)次進行判斷。此時當上述工序St42是第(n-1)次時，向工序St46進行。當上述工序St42不到第(n-1)次時，再度進行工序St41。就是說，在上述工序St42達到第(n-1)次之前，反復進行工序St41～St44。通過這樣操作，n種被測定物質(zhì)中的(n-1)種被測定物質(zhì)從反應體系中被除去。
接下來，在圖6所示的工序St46中，向反應體系中添加與上述反應體系中剩下的一種未測定的被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)。此時，例如被測定物質(zhì)是抗原時，特異結(jié)合物質(zhì)為抗體，如果被測定物質(zhì)是抗體時，特異結(jié)合物質(zhì)為抗原。
通過這樣操作，當樣品中含有被測定物質(zhì)時，通過被測定物質(zhì)與特異結(jié)合物質(zhì)的抗原抗體反應，生成與上述實施方式2的圖4(b)表示的的凝集復合物4b相同的由被測定物質(zhì)與特異結(jié)合物質(zhì)構(gòu)成的凝集復合物。不用說，當樣品中不含有被測定物質(zhì)時，就不會由被測定物質(zhì)與特異結(jié)合物質(zhì)的抗原抗體反應生成凝集復合物。
接下來在圖6所示的工序St47中，對反應體系的光學特性進行測定。此時，當上述工序St46中有凝集復合物產(chǎn)生時，上述反應體系中出現(xiàn)混濁，散射光強度和透射光量等都發(fā)生變化。因此通過測定散射光強度或透射光量等可以估算反應體系混濁的程度。在此最好是一邊以測定前的樣品作為基準，一邊對上述反應體系的光學上的變化量、即散射光強度或透射光量的變化量進行測定。另外將樣品與緩沖液混合之后構(gòu)建反應體系時，以緩沖液作為基準也可以。
特別是在上述工序St44中，由于利用磁力可以收集凝集復合物以及磁性復合物，所以在本工序中對反應體系的光學特性進行測定時，可以測定只由凝集復合物引起的散射光強度和透射光量等的變化。
依據(jù)本實施方式，在光學特性測定后利用磁力可消除掉由被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)構(gòu)成的凝集復合物。由于利用磁力，完全不會對反應體系帶來化學方面的影響。因此，在對多個被測定物質(zhì)進行測定時，由于幾乎排除了先前形成的凝集復合物的影響，所以在進行光學特性測定時，每次測定值的可靠性都很高。
特別是以往對2種以上被測定物質(zhì)的含量進行測定時，需要準備與被測定物質(zhì)種類數(shù)相同個數(shù)的反應容器，然而依據(jù)本實施方式，只要有一個可構(gòu)建反應體系的反應容器，利用該容器就可以對2種以上被測定物質(zhì)的含量進行測定。因此按照本實施方式，測定需要的樣品量可以非常少。由于這一原因，所以例如在醫(yī)療領域中，可以減少從患者採集的樣品量，減輕患者的負擔。
另外，在本實施方式中也可以利用pH3.0以下酸性條件阻礙抗原抗體反應現(xiàn)象，以便從反應體系除去的凝集復合物中，以被固定的抗體或抗原具有反應性的狀態(tài)對磁性粒子進行回收、再利用?；蛘撸ㄟ^用強酸或強堿處理、以及基于表面活性劑清洗，將固定在磁性粒子上的抗體或抗原完全除去，將別的抗體或抗原固定在該磁性粒子上也可以。
以下對本實施方式的免疫反應測定方法中使用的試劑盒進行說明。
本實施方式的免疫反應測定方法中使用的試劑盒含有分別與n種被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)、以及由可與由(n-1)種被測定物質(zhì)和與其對應的特異結(jié)合物質(zhì)構(gòu)成的各個凝集復合物結(jié)合的物質(zhì)(例如能夠與凝集復合物含有的抗體結(jié)合的二次抗體)和固定了上述物質(zhì)的磁性粒子構(gòu)成的磁性復合物。
如果將本實施方式的試劑盒用在本實施方式的免疫反應測定方法中，只要有一個可構(gòu)建反應體系的反應容器，利用該容器就可以對2種以上的被測定物質(zhì)的含量進行測定。因此使用本實施方式的試劑盒，測定需要的樣品量可以非常少。
作為在本實施方式的免疫反應測定方法以及試劑盒中使用的磁性粒子以及用于收集磁性粒子的磁鐵6可以使用與上述實施方式2中說明的完全相同的磁性粒子和磁鐵。
作為在本實施方式中使用的能夠與凝集復合物特異結(jié)合的磁性復合物，可以使用磁性粒子上固定了與各凝集復合物的生成中使用的抗體特異結(jié)合的抗體、或者與凝集復合物生成中使用的抗體不同的部位特異結(jié)合的抗體、或與凝集復合物的特定的結(jié)構(gòu)特異結(jié)合的抗體等的磁性復合物。
另外在本實施方式的免疫反應測定方法以及試劑盒中作為圖6所示的工序St46中添加的特異結(jié)合物質(zhì)最好是固定了與反應體系剩下的一種未測定的被測定物質(zhì)發(fā)生抗原抗體反應的抗原或抗體的非磁性粒子。通過這樣操作，在工序St47中的被測定物質(zhì)測定的光學特性的變化范圍與工序St42中的(n-1)種被測定物質(zhì)測定的光學特性的變化范圍沒有太大的變化。因此，測定使用的裝置的調(diào)整變得容易。
作為上述非磁性粒子可以使用與上述實施方式2敘述的完全相同的非磁性粒子。即上述非磁性粒子的直徑最好是0.05～2μm，如果與上述的磁性粒子的直徑等同更好。
在本實施方式的免疫反應測定方法的反應體系中，根據(jù)其用途可以添加該領域眾所周知的任意成分。例如當特異結(jié)合物質(zhì)不是固定了抗原或抗體的非磁性粒子時，在工序St46中可以向反應體系加入聚乙二醇。而為了向工序St46中反應體系添加聚乙二醇，可以在試劑盒中附加聚乙二醇。聚乙二醇的含量相對于反應體系2～6重量％比較好，4重量％更好。反應體系中含有上述濃度的聚乙二醇時，在工序St47中，被測定物質(zhì)或特異結(jié)合物質(zhì)各自的自身凝集引起的非特異凝集減少，測定靈敏度提高。
另外為了減少在工序St42和工序St47中由于各被測定物質(zhì)以及各特異結(jié)合物質(zhì)各自的自身凝集引起的非特異凝集，在本實施方式中，也可以向反應體系中添加Tween20、辛基糖苷、十二烷基硫酸鈉(SDS)、蔗糖甘油單月桂酸酯、CHAPS等表面活性劑。上述表面活性劑在反應體系中的含量從減少抗原抗體反應的阻礙觀點出發(fā)，0.3重量％以下比較好，0.1重量％以下更好。
在本實施方式的免疫反應測定方法中，作為在工序St42和工序St47中進行測定的光學特性可以測定散射光強度的變化(散射測濁法)，也可以測定來自反應體系的透射光量的變化(比濁法)。
在本實施方式中，n種各被測定物質(zhì)沒有特別限定，只要是利用抗原抗體反應能夠測定的物質(zhì)都可以。例如蛋白質(zhì)、核酸、脂類、細菌、病毒以及半抗原等。特別是本實施方式的免疫反應測定方法以及試劑盒適用于以往在臨床檢查中利用抗原抗體反應進行測定的對象即蛋白質(zhì)的測定。作為蛋白質(zhì)，例如可以是LH(促黃體素)、FSH(促卵胞素)、hCG(人絨毛膜促性激素)等激素，以及各種免疫球蛋白類和亞類、補體成分、各種傳染病的標志物、CRP、白蛋白、血紅蛋白、類風濕因子以及血型抗原等。
本實施方式中使用的抗體只要是通過與抗原特異結(jié)合，能夠與抗原形成凝集復合物的就可以，沒有特別限定。例如可以是IgG、IgM、IgE、IgA、IgD中的任一類抗體，也可以是這些抗體的混合物。另外無論是多克隆抗體還是單克隆抗體都可以，即使是他們的混合物也可以。其中其中IgG抗體最好，這是由于IgG抗體具有難于產(chǎn)生非特異反應的性質(zhì)，另外由于銷售的產(chǎn)品比較多、容易買到的緣故。另外抗體來自動物的種類也沒有特別限定，但由于來自兔、山羊、小鼠的抗體比較容易獲得，使用的例子也比較多，所以比較好。
在本實施方式中，作為特異結(jié)合反應測定方法雖然對利用抗原抗體反應的免疫反應測定方法進行了說明，也可以通過利用抗原抗體反應以外的發(fā)生特異結(jié)合的反應使凝集復合物生成，進行測定。利用生成抗原抗體反應以外的發(fā)生特異結(jié)合的反應時，被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)的組合如配體和受體的組合、單鏈DNA(被測定物質(zhì))與含有與該單鏈DNA互補序列的各種DNA片段之間的組合等。
作為配體和受體組合的例子，如可作為配體的分子和對該分子具有多個結(jié)合部位的變構(gòu)蛋白的組合。在作為配體的分子內(nèi)只存在一個與變構(gòu)蛋白結(jié)合的部位時，如果通過在與變構(gòu)蛋白結(jié)合部分以外的部位將作為配體的分子固定在磁性粒子、非磁性分子等上，就可以使作為配體的分子和變構(gòu)蛋白的凝集復合物生成。
另外，在將單鏈DNA作為被測物質(zhì)、將各種DNA片段作為特異結(jié)合物質(zhì)時，只要以能夠互補結(jié)合在作為被測物質(zhì)的單鏈DNA上的狀態(tài)將各種DNA片段固定在磁性粒子、非磁性粒子上即可。
(實施方式5)在本實施方式中，一邊參照附圖一邊對用于實施上述實施方式1～4的免疫反應測定方法的測定裝置進行說明。
首先，參照圖8對測定裝置100進行說明。圖8是表示本發(fā)明一實施方式中的測定裝置100的構(gòu)成模式圖。
本實施方式的測定裝置100就象圖8所示的那樣，備有光源101、室(反應容器)102、保持室102的室架103、對來自室102的光進行檢測的光檢測器104和除去手段108。
配置光源101，使其輸出光對著室102。
光檢測器104對來自構(gòu)建在室102內(nèi)的反應體系的散射光或透射光進行檢測。
除去手段108是用于在上述實施方式1～4中利用磁力從反應體系中收集和除去磁性粒子、磁性復合物以及凝集復合物等的裝置。在測定裝置100中除去手段108由永久磁鐵105、用于保護永久磁鐵105的罩106、以及設置了永久磁鐵105和罩106的臂107構(gòu)成。
在此參照圖9對除去手段108的操作進行說明。圖9是表示測定裝置100中室102和除去手段108的配置關系的圖。
就象圖9所示的那樣，臂107可以使永久磁鐵105和罩106下降，插入到室102的內(nèi)部，也可以使其上升，從102室內(nèi)部提起。因此，向反應體系內(nèi)導入永久磁鐵105和罩106，使反應體系內(nèi)的磁性粒子、磁性復合物以及凝集復合物附著在罩106的表面。然后當反應體系的混濁大致消失時，將臂由室102中提上來。通過這樣操作，就可以從反應體系內(nèi)收集和除去磁性粒子、磁性復合物以及凝集復合物。而附著在罩上的磁性粒子、磁性復合物以及凝集復合物等可以用機械的方法使其脫離。例如，將永久磁鐵105從罩106中拔出后，通過清洗等除去附著在罩106上的可回收的磁性粒子，或?qū)⒄?06做成一次性的產(chǎn)品。另外用電磁鐵取代永久磁鐵時，可以通過電磁鐵的磁力發(fā)生的開-關(ON-OFF)進行磁性粒子的收集和除去。
接下來，參照圖10對測定裝置200進行說明。圖10是表示本實施方式的測定裝置200的構(gòu)成模式圖。
本實施方式的測定裝置就象圖10表示的那樣，備有光源201、備有排出口202a的室(反應容器)202、保持室202的室架203、對來自室202的光進行檢測的光檢測器204和除去手段208。
配置光源201，使其射出的光對著室202。
光檢測器204對來自構(gòu)建在室202內(nèi)的反應體系的散射光或透射光進行檢測。
除去手段208是用于在上述實施方式1～4中利用磁力從反應體系中收集和除去磁性粒子、磁性復合物以及凝集復合物等的裝置。在測定裝置200中除去手段208設置了電磁鐵205、用于貯存來自室202排出口202a的排出物的容器206以及與室202排出口202a連接并可開閉的閥207。
在此參照圖11對除去手段208的操作進行說明。圖11是表示測定裝置200中室202和除去手段208的配置關系的圖。
閥207就象圖11所示的那樣，與室202排出口202a連接。在這一狀態(tài)下，向電磁鐵205通電，室202內(nèi)的反應體系中的磁性粒子、磁性復合物以及凝集復合物等由排出口202a通過閥207移動到容器206。然后當反應體系的混濁大致消失時，關閉閥207，停止向電磁鐵205通電。通過這樣操作，就可以從反應體系內(nèi)收集和除去磁性粒子、磁性復合物以及凝集復合物。而貯存在容器206的磁性粒子、磁性復合物以及凝集復合物等可以通過清洗除去?；蛘邔⑷萜?06做成一次性產(chǎn)品。
另外在測定裝置200中也可以設置與室202相連的排出用的配管來取代容器206。
另外在測定裝置200中，也可以設置圖12所示的除去手段208’來取代除去手段208。就象圖12所示的那樣，除去手段208’設置了永久磁鐵105、保持永久磁鐵105的臂107、用于貯存來自室202排出口202a的排出物的容器206以及與室202排出口202a連接并可開閉的閥207。
就象圖12所示的那樣，臂107可使永久磁鐵105上下移動。因此將永久磁鐵105靠近容器206，就可以使反應體系內(nèi)的磁性粒子、磁性復合物以及凝集復合物排出到容器206內(nèi)。然后當反應體系的混濁大致消失時，關閉閥207，使永久磁鐵105離開容器206。通過這樣操作，就可以從反應體系內(nèi)收集和除去磁性粒子、磁性復合物以及凝集復合物。而貯存在容器206的磁性粒子、磁性復合物以及凝集復合物等通過清洗就可以除去?；蛘邔⑷萜?06做成一次性的。
對于使用含有永久磁鐵105的除去手段108和208’的場合，在對反應體系的光學特性進行測定時，要預先使永久磁鐵105在離開室202的地方待機，在測定結(jié)束后再使除去手段108和208’操作，以便收集和除去室202內(nèi)的磁性粒子、磁性復合物以及凝集復合物等。
在使用含有電磁鐵205的除去手段108時，可以將電磁鐵205配置在室202附近。這是因為電磁鐵205在不通電的狀態(tài)下幾乎不產(chǎn)生磁力。因此對光學特性進行測定時，最理想的是使除去手段108和208’操作做到不通電就不產(chǎn)生磁力，測定結(jié)束后通電產(chǎn)生磁力，這樣就可以除去室202內(nèi)的磁性粒子、磁性復合物以及凝集復合物等。上述任一種場合，都是為了在對反應體系的光學特性進行測定時盡可能地減少磁力對抗原抗體反應的影響。
此時，最好是預先用與反應體系同樣的緩沖液充滿容器206。通過這樣操作，可以減少室202內(nèi)的反應體系的體積變化。而由于室202內(nèi)的反應體系的體積的變化小，在對反應體系的光學特性進行測定時，也可以只考慮在測定中追加的試劑的容量。因此，從光學特性的測定值推定被測定物質(zhì)的濃度變得容易。
實施例以下對本發(fā)明的實施例進行詳細說明。而以下給出的實施例并不限定本發(fā)明。
在本實施例中表示了上述實施方式2中的第1被測定物質(zhì)為人血紅蛋白，第2被測定物質(zhì)為人白蛋白，第1特異結(jié)合物質(zhì)為抗人血紅蛋白抗體，第2特異結(jié)合物質(zhì)為抗人白蛋白抗體，在非磁性粒子上沒有固定第2特異結(jié)合物質(zhì)時的試劑的構(gòu)成方法。
另外在本實施例表示的緩沖液等的制備中使用了經(jīng)Milli-Q SP TOC(Millipore制造)過濾的純水。而沒有特別記載的鹽、緩沖劑等試劑都為和光純藥工業(yè)制造的產(chǎn)品，聚乙二醇6000使用1級試劑，而其他的試劑使用特級試劑。
作為第1特異結(jié)合物質(zhì)的抗人血紅蛋白抗體以及作為第2特異結(jié)合物質(zhì)的抗人白蛋白抗體的制備如下。
首先，抗人血清白蛋白抗體是使用蛋白A柱層析從免疫了人白蛋白(和光純藥工業(yè)制造)的兔子採集的抗血清中對IgG級分進行純化后制備的。填充在柱子中的蛋白A固定化膠使用Amershram Pharmacia制造的膠。純化中使用的平衡緩沖液是組成為1.5M甘氨酸、3.0MNaCl，pH8.9的緩沖液，洗脫緩沖液液使用pH4.0的0.1M檸檬酸緩沖液。
純化象下述那樣進行。使容量為充填到柱子凝膠容量5倍的平衡緩沖液流過柱子，對柱子進行平衡后，將容量為柱子總?cè)萘?0～20％的含有抗體的抗血清用平衡緩沖液稀釋2倍后上到柱子上，使血清中的抗體結(jié)合在蛋白A上。然后，加平衡緩沖液洗柱子，一直洗到?jīng)]有吸附于蛋白A上的血清成分再從柱子中出來為止。然后加洗脫緩沖液，將結(jié)合于蛋白A的抗體洗脫下來。洗脫出來的抗體級分裝入分級分子量1萬的透析袋中，用約100倍容量的組成為0.05M 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(Dojin制造，以下略稱為MOPS)、0.15M NaCl、0.04重量％NaN3的pH7.4緩沖液透析數(shù)次，更換緩沖液成分。然后通過280nm吸光度測定來推定抗體濃度，用在透析使用的同樣緩沖液進行調(diào)整，將抗體濃度調(diào)到3.0mg/ml，該溶液作為抗人白蛋白抗體溶液?？贵w濃度并不限定于這個濃度。制作的抗體溶液雖然可以保存在室溫下，但從防止抗體變性的角度出發(fā)，在更低的溫度下保存好，保存在4℃更好。
抗人血紅蛋白抗體通過使用蛋白A柱層析從做了人血紅蛋白(SIGMA，Cat.No.H-7379)免疫的兔子採集的抗血清中對IgG級分進行純化后，固定在磁性粒子上制備的。填充在柱子中的蛋白A固定化膠使用Amersham Pharmacia制造的膠。純化中使用的平衡緩沖液使用pH7.0的0.02M Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，洗脫緩沖液使用pH2.7的0.1M甘氨酸緩沖液。透析使用的緩沖液的組成為0.05M MOPS、0.15M NaCl、0.04重量％NaN3，pH為7.4。有關利用柱層析的純化操作、以及通過透析更換緩沖液的方法使用與制備抗人白蛋白抗體同樣的方法。
然后通過280nm吸光度測定推定抗體濃度，用在透析使用的同樣緩沖液進行調(diào)整，將抗體濃度調(diào)到3.0mg/ml，該溶液作為用于抗人血紅蛋白抗體向磁性粒子固定的抗血紅蛋白抗體溶液。
雖然磁性粒子可以制備，但也可以利用市場銷售的產(chǎn)品。在本實施例中，使用含有粒徑為1～2μm的鐵的聚苯乙烯膠乳粒子-Polysciences公司制造的商品名為Polystyrene Superparamagnetic Microspheres，1-2μ(Cat.No.18190)?？贵w向磁性粒子的固定如下進行。
將2.5重量％的磁性粒子0.5ml加到微量管中，然后向管中加入0.5ml的組成為0.05M MOPS、0.04重量％NaN3，pH為7.4的緩沖液，使磁性粒子懸浮，然后用離心機(TOMI精工制造，型號MRX-150)于12,000rpm下離心30分鐘，使磁性粒子沉淀，除去上清。
然后再向管中加1ml的組成為0.05M MOPS、0.04重量％NaN3，pH為7.4的緩沖液，使磁性粒子懸浮，于12,000rpm下離心30分鐘，使磁性粒子沉淀，除去上清。再度反復進行該磁性粒子的懸浮、以及離心沉淀。
然后加入0.9ml的組成為0.05M MOPS、0.04重量％NaN3，pH為7.4的緩沖液，使磁性粒子懸浮，加入0.1ml上述制備的用于向磁性粒子固定的抗血紅蛋白抗體溶液。然后用旋轉(zhuǎn)器(TAITEC公司制造、型號RT-50)攪拌過夜。攪拌后，于12,000rpm下離心30分鐘，再度使磁性粒子沉淀，除去上清。再加入組成為0.05M MOPS、1重量％鈉酪蛋白、0.04重量％NaN3，pH為7.4的緩沖液，使磁性粒子懸浮，用旋轉(zhuǎn)器攪拌30分鐘。攪拌后，于12,000rpm下離心30分鐘，再度使磁性粒子沉淀。共計反復進行3次該磁性粒子的懸浮、以及離心沉淀，對沒有固定抗體的磁性粒子的表面進行封閉。
再加入組成為0.05M MOPS、0.15M NaCl、0.04重量％NaN3、5體積％甘油、pH為7.4的緩沖液，使磁性粒子懸浮。而固定中使用的抗體濃度以及磁性粒子的濃度并不限定于上述值。制作的抗體溶液雖然可以保存在室溫下，但從防止抗體變性的角度出發(fā)，在更低的溫度下保存好，保存在4℃更好。
為了測定人血紅蛋白，作為加入到反應體系的第1緩沖液制備組成為0.05M MOPS、0.04重量％NaN3、pH為7.4的緩沖液，作為用于測定人白蛋白而加入到反應體系的第2緩沖液制備組成為0.05M MOPS、8.6重量％聚乙二醇6,000、0.04重量％NaN3、pH為7.4的緩沖液。制作的各個緩沖液保存在室溫下。
通過將象上述那樣構(gòu)成的固定了抗人血紅蛋白抗體(第1特異結(jié)合物質(zhì))的磁性粒子、抗人白蛋白抗體(第2特異結(jié)合物質(zhì))、各個緩沖液進行組合，可以構(gòu)成免疫反應用試劑。
以下給出了上述構(gòu)成的試劑的使用方法。首先，將含有2種被測定物質(zhì)(人血紅蛋白和人白蛋白)的樣品、固定了抗人血紅蛋白抗體(第1特異結(jié)合物質(zhì))的磁性粒子、第1緩沖液進行混合，構(gòu)建反應體系。然后對反應體系的光學特性進行測定。測定結(jié)束后，通過磁力，將由血紅蛋白(第1被測定物質(zhì))、抗人血紅蛋白抗體(第1特異結(jié)合物質(zhì))和磁性粒子構(gòu)成的凝集復合物、以及沒有形成凝集復合物的磁性粒子進行收集，消除反應體系的混濁。
接下來將抗人白蛋白抗體(第2特異結(jié)合物質(zhì))溶液和第2緩沖液混合在反應體系中。然后對反應體系的光學特性進行測定。通過以上操作程序可以知道樣品中的被測定物質(zhì)的濃度。
另外雖然本實施例中沒有給出，但也可以使抗人血清白蛋白抗體(第2特異結(jié)合物質(zhì))固定于膠乳、膠體金等非磁性粒子上。例如使抗體向膠乳粒子固定的方法可以直接運用上述敘述的在磁性粒子中使用的方法。
另外在本實施例中，雖然是用鈉酪蛋白對沒有固定抗體的粒子表面進行了封閉，但也可以用明膠、脫脂乳等代替鈉酪蛋白。使用的濃度可以與鈉酪蛋白一樣。
另外在本實施例中為了構(gòu)建反應體系，對每個被測定物質(zhì)都準備了緩沖液，也可以通過添加了聚乙二醇等水溶性高分子的一類緩沖液構(gòu)成各個反應體系。
另外抗體溶液的緩沖劑成分和pH只要對通過抗原和抗體的結(jié)合發(fā)生的免疫反應不帶來壞的影響，并不限定于上述組成和pH。
另外為了取出紅血球中含有的血紅蛋白，向反應體系中添加例如氯化鉀等溶血劑，或在試劑盒中附加含有溶血劑的溶液也可以。
以上，利用本發(fā)明的免疫反應測定方法和試劑盒，可以在一個反應容器內(nèi)對2種被測定物質(zhì)進行測定。
本發(fā)明可以提供能夠在一個反應容器內(nèi)對2種以上被測定物質(zhì)進行測定、能夠減少測定需要的樣品的特異結(jié)合反應測定方法和該方法中使用的試劑盒以及測定裝置。
本發(fā)明的特異結(jié)合反應測定方法、該方法中使用的試劑盒以及特異結(jié)合反應測定裝置可用于各種各樣疾病的診斷以及病狀過程的調(diào)查。例如，如果將本發(fā)明的構(gòu)成作為對來自一個樣品的人血紅蛋白和人白蛋白進行測定的構(gòu)成，可用于腎臟疾病的診斷。
權(quán)利要求
1.一種特異結(jié)合反應測定方法，對樣品中被測定物質(zhì)的含量進行測定，包括以下工序構(gòu)建含有所述樣品、固定了與所述被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的磁性粒子的反應體系的工序(a)；對所述反應體系的光學特性進行測定的工序(b)；利用磁力從所述反應體系中除去含有所述被測定物質(zhì)、所述特異結(jié)合物質(zhì)以及所述磁性粒子的凝集復合物的工序(c)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異結(jié)合反應測定方法，其中，所述光學特性是散射光強度或透射光量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異結(jié)合反應測定方法，其中，所述磁性粒子的直徑大約在0.05～2μm范圍內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異結(jié)合反應測定方法，其中，在所述工序(c)中，從所述反應體系除去殘存于所述反應體系中的所述磁性粒子。
5.一種特異結(jié)合反應測定方法，對樣品中第1被測定物質(zhì)和第2被測定物質(zhì)的含量進行測定，包括以下工序構(gòu)建含有所述樣品、固定了與所述第1被測定物質(zhì)特異結(jié)合的第1特異結(jié)合物質(zhì)的磁性粒子的反應體系的工序(a)；在所述工序(a)后，對所述反應體系的光學特性進行測定的工序(b)；利用磁力從所述反應體系中收集含有所述第1被測定物質(zhì)和所述第1特異結(jié)合物質(zhì)以及所述磁性粒子的凝集復合物的工序(c)；向所述反應體系中添加與所述第2被測定物質(zhì)特異結(jié)合的第2特異結(jié)合物質(zhì)的工序(d)；在所述工序(d)后，對所述反應體系的光學特性進行測定的工序(e)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的特異結(jié)合反應測定方法，其中，在所述工序(d)中，反應體系含有2～6重量％的聚乙二醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的特異結(jié)合反應測定方法，其中，所述第2特異結(jié)合物質(zhì)由與所述第2被測定物質(zhì)特異結(jié)合的抗原或抗體以及由固定了所述抗原或抗體的非磁性粒子構(gòu)成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的特異結(jié)合反應測定方法，其中，所述磁性粒子的直徑大約在0.05～2μm范圍內(nèi)，所述非磁性粒子的直徑大約在0.05～2μm范圍內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的特異結(jié)合反應測定方法，其中，所述的第1被測定物質(zhì)和所述第2被測定物質(zhì)的組合是人血紅蛋白和人白蛋白的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的特異結(jié)合反應測定方法，其中，在所述工序(c)中收集殘存于所述反應體系的所述磁性粒子。
11.一種特異結(jié)合反應測定方法，對樣品中n種、其中n為2以上的整數(shù)的被測定物質(zhì)的含量進行測定，包括以下工序構(gòu)建含有所述樣品、固定了與未測定的被測定物質(zhì)中的一種特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的磁性粒子的反應體系的工序(a)；在所述工序(a)后，對所述反應體系的光學特性進行測定的工序(b)；利用磁力從所述反應體系中除去含有所述一種被測定物質(zhì)和所述特異結(jié)合物質(zhì)以及所述磁性粒子的凝集復合物的工序(c)；在所述工序(c)后，進行判斷的工序(d)，以便使在所述工序(b)不到第(n-1)次時，再次進入到工序(a)；向所述反應體系中添加與所述反應體系中剩下的一種未測定的被測物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的工序(e)；在所述工序(e)后，對所述反應體系的光學特性進行測定的工序(f)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的特異結(jié)合反應測定方法，其中，在工序(c)中，從所述反應體系除去殘存于所述反應體系中的所述磁性粒子。
13.一種特異結(jié)合反應測定方法，對樣品中n種、其中n為2以上的整數(shù)的被測定物質(zhì)的含量進行測定，包括以下工序構(gòu)建含有所述樣品、固定了與未測定的被測定物質(zhì)中的一種特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的磁性粒子的反應體系的工序(a)；在所述工序(a)后，對所述反應體系的光學特性進行測定的工序(b)；向反應體系添加含有可與由所述一種被測定物質(zhì)和所述特異結(jié)合物質(zhì)構(gòu)成的凝集復合物結(jié)合的物質(zhì)和磁性粒子的磁性復合物的工序(c)；利用磁力從所述反應體系中除去結(jié)合了所述磁性復合物的所述凝集復合物的工序(d)；在所述工序(d)后，進行判斷工序的(e)，以便使在所述工序(b)不到第(n-1)次時，再次進入到工序(a)；向所述反應體系中添加與所述反應體系中剩下的一種未測定的被物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的工序(f)；在所述工序(e)后，對所述反應體系的光學特性進行測定的工序(g)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的特異結(jié)合反應測定方法，其中，在所述工序(c)中，從所述反應體系中除去沒有與所述凝集復合物結(jié)合的所述磁性復合物。
15一種試劑盒，用于對樣品中第1被測定物質(zhì)以及第2被測定物質(zhì)的含量進行測定，含有固定了與所述第1被測定物質(zhì)特異結(jié)合的第1特異結(jié)合物質(zhì)的磁性粒子；以及與所述第2被測定物質(zhì)特異結(jié)合的第2特異結(jié)合物質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中，所述磁性粒子的直徑大約在0.05～2μm范圍內(nèi)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中，所述第2特異結(jié)合物質(zhì)，由與所述第2特異結(jié)合物質(zhì)特異結(jié)合的抗原或抗體以及固定了所述抗原或抗體的非磁性粒子構(gòu)成。
18.一種試劑盒，用于對樣品中n種、其中n為2以上的整數(shù)的被測定物質(zhì)的含量進行測定，含有與所述n種被測定物質(zhì)中的一種被測定物質(zhì)特異結(jié)合的一種特異結(jié)合物質(zhì)；分別固定有與所述被測定物質(zhì)中剩下的(n-1)種被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的(n-1)種磁性粒子。
19.一種試劑盒，用于對樣品中n種、其中n為2以上的整數(shù)的被測定物質(zhì)的含量進行測定，含有分別與所述n種被測定物質(zhì)特異結(jié)合的n種特異結(jié)合物質(zhì)，由可與由所述n種被測定物質(zhì)中的(n-1)種被測定物質(zhì)和與這些物質(zhì)對應的(n-1)種特異結(jié)合物質(zhì)構(gòu)成的凝集復合物結(jié)合的物質(zhì)、以及固定有所述物質(zhì)的磁性粒子構(gòu)成的磁性復合物。
20.一種特異反應測定裝置，具有室；將光對照所述室進行照射的光源；所述室內(nèi)含有磁性粒子時，利用磁力從所述室內(nèi)除去所述磁性粒子的除去手段。
全文摘要
一種特異結(jié)合反應測定方法，對樣品中的被測定物質(zhì)的含量進行測定，包括構(gòu)建含有上述樣品、固定了與上述被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)的磁性粒子的反應體系的工序(a)；對上述反應體系的光學特性進行測定的工序(b)；以及利用磁力從上述反應體系中除去由上述被測定物質(zhì)和上述特異結(jié)合物質(zhì)以及上述磁性粒子構(gòu)成的凝集復合物的工序(c)。
文檔編號G01N33/543GK1499203SQ20031011427
公開日2004年5月26日 申請日期2003年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月12日
發(fā)明者龜井明仁, 重藤修行, 河村達朗, 朗, 行 申請人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社