專利名稱：用于磁結(jié)合測(cè)定的自校正系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的背景技術(shù)目前在分析檢測(cè)中通常采用各種分析方法和裝置以確定測(cè)試樣品中分析物的存在和/或不存在。例如，免疫測(cè)定利用免疫系統(tǒng)的機(jī)制，其中響應(yīng)抗原的存在生成抗體，所述抗原對(duì)于有機(jī)體來(lái)說(shuō)是致病性的或者異源性的。這些抗體和抗原，即免疫反應(yīng)物，能夠相互結(jié)合，從而引起高度特異的反應(yīng)機(jī)制，其可用于確定生物樣品中特定抗原的存在或濃度。
目前有幾種公知的免疫測(cè)定方法，其使用了經(jīng)可檢測(cè)組分標(biāo)記的免疫反應(yīng)物，從而可以在分析上檢測(cè)分析物。例如，“夾層體式”檢測(cè)通常涉及將測(cè)試樣品與分析物的抗體相混合。這些抗體是移動(dòng)的并與標(biāo)記物或探針連接，例如染色乳膠、膠體狀金屬溶膠或放射性同位素。然后，所述混合物與色譜分離介質(zhì)接觸，所述介質(zhì)含有分析物的固定抗體的條或帶。所述色譜分離介質(zhì)通常為類似于量桿的條狀物。當(dāng)分析物和標(biāo)記抗體的復(fù)合物到達(dá)色譜分離介質(zhì)上的固定抗體區(qū)域，發(fā)生結(jié)合，所結(jié)合的標(biāo)記抗體定位在所述區(qū)域內(nèi)。其指示了分析物的存在。該方法可以用于獲得定量或半定量結(jié)果。所述夾層體式檢測(cè)方法的某些例子參見(jiàn)Grubb等的美國(guó)專利申請(qǐng)No.4168146和Tom等的美國(guó)專利申請(qǐng)No.4366241。
另一種技術(shù)為“競(jìng)爭(zhēng)性”檢測(cè)。在競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)中，標(biāo)記物通常為標(biāo)記的分析物或分析物類似物，其與樣品中存在的任意未標(biāo)記分析物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體。競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)通常用于檢測(cè)例如半抗原的分析物，每個(gè)半抗原為單價(jià)，僅能結(jié)合一個(gè)抗體分子。競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定裝置的例子參見(jiàn)Deutsch等的美國(guó)專利申請(qǐng)No.4235601，Liotta的美國(guó)專利申請(qǐng)No.4442204和Buechler等的美國(guó)專利申請(qǐng)No.5208535。
磁結(jié)合測(cè)定廣泛用于從復(fù)雜樣品中分離生物物質(zhì)(例如，蛋白、細(xì)胞和微生物)，其原因是，可以非常容易地通過(guò)磁場(chǎng)對(duì)所述分析測(cè)定進(jìn)行操作，不需要特殊和昂貴的設(shè)備。這樣，磁免疫測(cè)定可以提供一種快速簡(jiǎn)便的方法以確定物質(zhì)的存在與否。在上述檢測(cè)中，采用了各種信號(hào)生成機(jī)制，包括顏色(吸收和反射)、熒光、化學(xué)發(fā)光、放射性和酶。
然而，常規(guī)的磁免疫測(cè)定通常需要對(duì)照樣品，從而得到校正曲線，用于每次獲得分析物的定量信息。尤其是，當(dāng)分析測(cè)試樣品中的生物物質(zhì)的存在與否時(shí)，對(duì)已知量的物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)對(duì)照樣品，從而在近似相同的條件下校正所述檢測(cè)。不幸的是，所述校正方法通常不是很方便、成本較高，對(duì)測(cè)試者來(lái)說(shuō)比較麻煩。
因此，當(dāng)前需要有一種準(zhǔn)確的用于分析測(cè)定的校正系統(tǒng)，其易于控制，而且相對(duì)較為便宜。
本發(fā)明的簡(jiǎn)要描述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，公開(kāi)了一種自校正的磁結(jié)合測(cè)定(例如，夾層體式、競(jìng)爭(zhēng)性等)，用于檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在或量。所述磁結(jié)合測(cè)定包括能夠生成檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)探針和能夠生成校正信號(hào)的磁校正探針，其中測(cè)試樣品中分析物的量與經(jīng)校正信號(hào)強(qiáng)度校正的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度成比例(例如，正比或反比)。在某些實(shí)施方式中，檢測(cè)探針、校正探針或它們的組合與特定結(jié)合組分結(jié)合。所述特定結(jié)合組分可以例如選自由以下構(gòu)成的組，包括抗原、半抗原、抗體及它們的復(fù)合物。
通常來(lái)說(shuō)，檢測(cè)探針和校正探針可以由能夠生成可檢測(cè)信號(hào)的任意材料構(gòu)成。例如，在某些實(shí)施方式中，所述探針選自以下組，所述組包括生色團(tuán)、催化劑、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、磷光化合物、放射性化合物、直接目測(cè)的標(biāo)記物、脂質(zhì)體以及它們的組合。例如，所述檢測(cè)探針和校正探針可以是熒光化合物，例如熒光顆粒。在一特定實(shí)施方式中，檢測(cè)探針為熒光非磁性化合物，校正探針為熒光磁性顆粒。如果需要，所述熒光磁性顆粒可以與特定結(jié)合組分結(jié)合或被阻斷。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，公開(kāi)了一種檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在或量的方法。所述方法包括i)提供一種磁結(jié)合測(cè)定，包括能夠生成檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)探針和能夠生成校正信號(hào)的磁性校正探針；ii)使含有所述分析物的測(cè)試樣品與檢測(cè)探針和校正探針接觸；iii)采用磁性裝置從測(cè)試樣品中分離出檢測(cè)探針和校正探針；iv)激發(fā)分離出的檢測(cè)探針(復(fù)合和/或未復(fù)合的)和分離出的校正探針(復(fù)合和/或未復(fù)合的)，其中所述激發(fā)使得所述分離出的檢測(cè)探針發(fā)出檢測(cè)信號(hào)，使得分離出的校正探針發(fā)出校正信號(hào)；v)測(cè)量檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度和校正信號(hào)的強(qiáng)度；以及vi)比較檢測(cè)信號(hào)和校正信號(hào)的強(qiáng)度，其中測(cè)試樣品中的分析物量與經(jīng)校正信號(hào)強(qiáng)度校正的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度成比例。
因此，所述分離出的檢測(cè)和校正探針(復(fù)合和/或未復(fù)合的)能夠指示測(cè)試樣品中的分析物的存在或量。尤其是，測(cè)試樣品中分析物的量與檢測(cè)區(qū)內(nèi)分離出的檢測(cè)探針(復(fù)合和/或未復(fù)合的)所產(chǎn)生的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度成比例，所述檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度經(jīng)過(guò)檢測(cè)區(qū)內(nèi)分離出的校正探針(復(fù)合和/或未復(fù)合的)所產(chǎn)生的校正信號(hào)強(qiáng)度校正。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，測(cè)試樣品中分析物的量與檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度和校正信號(hào)強(qiáng)度的商成比例。
可以同時(shí)或者單獨(dú)激發(fā)所述分離出的檢測(cè)探針和校正探針。類似地，可以同時(shí)或者單獨(dú)測(cè)量檢測(cè)信號(hào)和校正信號(hào)的強(qiáng)度。進(jìn)一步地，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步生成校正曲線，就多個(gè)預(yù)定分析物濃度對(duì)經(jīng)校正信號(hào)強(qiáng)度校正的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行作圖，從而得到所述曲線。
以下將對(duì)本發(fā)明的其它特征和方面進(jìn)行詳細(xì)描述。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明在以下說(shuō)明書(shū)部分中，針對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，參考以下附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行全面公開(kāi)，包括最佳方法，其中附

圖1為本發(fā)明檢測(cè)裝置的一個(gè)實(shí)施方式的透視圖；附圖2為本發(fā)明夾層體式檢測(cè)的一個(gè)實(shí)施方式的反應(yīng)機(jī)制圖形說(shuō)明；附圖3為本發(fā)明夾層體式檢測(cè)的另一實(shí)施方式的反應(yīng)機(jī)制圖形說(shuō)明；附圖4為本發(fā)明競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)的一個(gè)實(shí)施方式的反應(yīng)機(jī)制圖形說(shuō)明；附圖5為本發(fā)明競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)的另一實(shí)施方式的反應(yīng)機(jī)制圖形說(shuō)明；附圖6為將抗體共價(jià)結(jié)合至羧酸鹽納米顆粒的一個(gè)實(shí)施方式的圖形說(shuō)明；
附圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的校正探針(C)和檢測(cè)探針(FP)的激勵(lì)(EX)和發(fā)射(EM)光譜；附圖8顯示了例1中所討論的標(biāo)化熒光強(qiáng)度對(duì)促黃體生成素(LH)的量之間的關(guān)系；附圖9顯示了例2中所討論的標(biāo)化熒光強(qiáng)度對(duì)促黃體生成素(LH)的量之間的關(guān)系；附圖10顯示了例4中所討論的標(biāo)化熒光強(qiáng)度對(duì)C反應(yīng)蛋白(CRP)的量之間的關(guān)系。
在本說(shuō)明書(shū)和附圖中重復(fù)使用的參考標(biāo)記代表本發(fā)明的相同或相似特征或元件。
代表性實(shí)施方式的詳細(xì)描述定義在本文中，術(shù)語(yǔ)“分析物”通常是指待檢測(cè)物質(zhì)。例如，分析物可以包括抗原性物質(zhì)，半抗原，抗體以及它們的組合。分析物包括但不限于毒素、有機(jī)化合物、蛋白質(zhì)、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、類固醇、維生素、藥物(包括出于治療目的以及違法目的服用的藥物)、細(xì)菌、病毒顆粒、以及上述物質(zhì)的代謝物或者抗體。某些分析物的特定例子包括鐵蛋白；肌酐激酶MIB(CK-MB)；地高辛；苯妥英；魯米那；酰胺咪嗪；萬(wàn)古霉素；慶大霉素；茶堿；丙戊酸；奎尼丁；促黃體生成素(LH)；卵泡刺激素(FSH)；雌二醇，黃體酮；IgE抗體；維生素B2微球蛋白；糖化血紅蛋白(Gly，Hb)；皮質(zhì)醇；洋地黃毒甙；N-乙酰普魯卡因胺(NAPA)；普魯卡因胺；風(fēng)疹病毒抗體，例如風(fēng)疹病毒IgG和風(fēng)疹病毒IgM；弓形蟲(chóng)抗體，例如弓形蟲(chóng)IgG(Toxo-IgG)和弓形蟲(chóng)IgM(Toxo-IgM)；睪丸激素；水楊酸鹽；對(duì)乙酰氨基酚；乙肝病毒表面抗原(HBsAg)；乙肝病毒核心抗原的抗體，例如抗乙肝病毒核心抗原IgG和IgM(抗-HBC)；人類免疫缺陷病毒1和2(HIV1和2)；人類T細(xì)胞白血病毒1和2(HTLV)；乙肝病毒e抗原(HBeAg)；抗乙肝病毒e抗原的抗體(抗-HBe)；甲狀腺刺激素(TSH)；甲狀腺素(T4)；總?cè)饧谞钕侔彼?總T3)；游離三碘甲狀腺氨酸(游離T3)；癌胚抗原(CEA)；和α甲胎蛋白(AFP)。濫用的藥物和被控制的物質(zhì)包括但不限于，苯丙胺；甲基苯異丙胺；巴比妥類，例如異戊巴比妥，司可巴比妥，戊巴比妥和巴比妥；苯二氮，例如甲氨二氮卓和安定；大麻成分，例如大麻粉和大麻毒品；可卡因；芬太尼；LSD；安眠酮；鴉片劑，例如海洛因、嗎啡、可待因、二氫嗎啡酮、氫可酮、美沙酮、14-羥基二氫可待因酮、氧嗎啡酮和鴉片；苯環(huán)己哌啶；和丙氧酚。其它潛在的分析物參見(jiàn)Tom等的美國(guó)專利No.4366241。
本文中，術(shù)語(yǔ)“測(cè)試樣品”通常是指懷疑含有分析物的材料。所述測(cè)試樣品可以從其來(lái)源直接應(yīng)用，或者對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理從而修飾樣品的特征。測(cè)試樣品可以來(lái)自任何生物來(lái)源，例如生理液體，包括血液、唾液、接觸鏡液體、腦脊液、汗液、尿液、乳汁、腹水、raucous、滑液、腹膜液、羊水等。在使用前可以對(duì)測(cè)試樣品進(jìn)行預(yù)處理，例如從血液制備血漿、稀釋粘性液體等等。處理的方法涉及過(guò)濾、蒸餾、濃縮、對(duì)干擾組分的滅活以及加入試劑。除了生理液體之外，也可以使用其它液體樣品，例如水、食物等等，從而進(jìn)行環(huán)境或食品生產(chǎn)檢測(cè)。另外，懷疑含有分析物的固體材料也可以用作測(cè)試樣品。在某些情況下，對(duì)固體測(cè)試樣品進(jìn)行修飾從而形成液體介質(zhì)或釋放分析物是有利的。
詳細(xì)描述現(xiàn)在對(duì)本發(fā)明的不同實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)參考，以下描述了一個(gè)或幾個(gè)例子。本發(fā)明對(duì)每個(gè)例子進(jìn)行了解釋，但不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)際上，在不脫離本發(fā)明的范圍或精神的情況下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，是顯而易見(jiàn)的。例如，舉例或者描述的作為實(shí)施方式一部分的特征可以用于另一實(shí)施方式中，從而得到其它實(shí)施方式。因此，在以下權(quán)利要求及其等同物的范圍內(nèi)，本發(fā)明包括了上述修改和變化。
總的來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及自校正的磁結(jié)合測(cè)定(例如，夾層體式、競(jìng)爭(zhēng)性等)，用于檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在或量。所述磁結(jié)合測(cè)定包括能夠生成檢測(cè)信號(hào)(例如，熒光非磁性顆粒)的檢測(cè)探針和能夠產(chǎn)生校正信號(hào)(例如，熒光磁性顆粒)的校正探針。測(cè)試樣品中分析物的量與經(jīng)校正信號(hào)強(qiáng)度校正的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度成比例(例如，正比或反比)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，所述自校正系統(tǒng)提供了一種準(zhǔn)確、便宜而且易于控制的方法，用于確定測(cè)試樣品中分析物的存在。
例如參照附圖1-2，對(duì)可以根據(jù)本發(fā)明形成的流式夾層體式檢測(cè)裝置20的一個(gè)實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。如圖所示，檢測(cè)裝置20包括多孔膜23，其可選擇地由剛性材料21支撐。通常，所述多孔膜23可以由多種材料中的任一種構(gòu)成，測(cè)試樣品能夠通過(guò)所述材料。例如，用于形成多孔膜23的材料可以包括但不限于，天然、合成或者經(jīng)合成修飾的天然生成的材料，例如多糖(例如纖維素材料，例如紙和纖維素衍生物，例如醋酸纖維素和硝酸纖維素)；硅土；無(wú)機(jī)材料，例如去活性的氧化鋁、硅藻土、MgSO4、或其它均勻分散在多孔聚合物基質(zhì)中的無(wú)機(jī)細(xì)小分離材料，聚合物例如氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物、和氯乙烯-醋酸乙烯共聚物；布料，包括天然形成(例如棉花)和合成的(例如尼龍和人造絲)；多孔膠，例如硅膠、瓊脂糖膠、葡聚糖和白明膠；聚合物膜，例如聚丙烯酰胺；等等。在一特定實(shí)施方式中，所述多孔膜23由硝酸纖維素和/或聚酯砜材料構(gòu)成。應(yīng)這樣理解，術(shù)語(yǔ)“硝酸纖維素”是指纖維素的硝酸酯，其可以是單獨(dú)的硝酸纖維素，或者硝酸和其它酸的混合酯，例如具有1至7個(gè)碳原子的脂族羧酸。
檢測(cè)裝置20還可以含有芯吸墊28。所述芯吸墊28通常接受遷移經(jīng)過(guò)整個(gè)多孔膜23的液體。如本領(lǐng)域所公知的，芯吸墊28可以幫助促進(jìn)毛細(xì)管作用以及液體流經(jīng)膜23。
為了開(kāi)始檢測(cè)測(cè)試樣品中的分析物，用戶可以直接將測(cè)試樣品施加至多孔膜23的一部分，樣品可以經(jīng)過(guò)該部分遷移至一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)和校正區(qū)(如下所述)?；蛘?，首先將測(cè)試樣品施加于加樣墊(未示出)，所述加樣墊與多孔膜23流體連接?？梢孕纬杉訕訅|的一些適當(dāng)材料包括但不限于，硝酸纖維素、纖維素、多孔聚乙烯墊、和玻璃纖維濾紙。如果需要，所述加樣墊可以含有一個(gè)或多個(gè)測(cè)定預(yù)處理試劑，所述試劑可以是擴(kuò)散性或非擴(kuò)散性的附著在加樣墊上。
在所描述的實(shí)施方式中，測(cè)試樣品從加樣墊(未示出)遷移至結(jié)合墊22，所述結(jié)合點(diǎn)與加樣墊的一端流體連接。結(jié)合墊22由測(cè)試樣品能夠通過(guò)的材料構(gòu)成。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合墊22由玻璃纖維構(gòu)成。盡管只顯示了一個(gè)結(jié)合墊22，但是應(yīng)這樣理解，在本發(fā)明中也可以采用其它的結(jié)合墊。
為了有利于檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在與否，可以在結(jié)合墊22上施加不同的檢測(cè)探針41。當(dāng)探針被包含在結(jié)合墊2上時(shí)，當(dāng)分析物從加樣墊經(jīng)過(guò)結(jié)合墊22時(shí)，這些探針41能夠結(jié)合分析物。一旦與分析物結(jié)合，探針41在隨后可以用于確定分析物的存在與否。檢測(cè)探針41可以用于裝置20的檢測(cè)和校正。然而，在其它實(shí)施方式中，還可以在結(jié)合墊22上施加獨(dú)立的校正探針43，與檢測(cè)探針41一起同時(shí)進(jìn)行校正和檢測(cè)，從而消除通常由常規(guī)檢測(cè)校正系統(tǒng)導(dǎo)致的不精確性。但是，應(yīng)當(dāng)這樣理解，檢測(cè)探針41和/或校正探針43可以一起或者單獨(dú)施加于裝置20的任意位置，而不需要施加至結(jié)合墊22上。進(jìn)一步地，應(yīng)當(dāng)這樣理解，檢測(cè)探針41和/或校正探針43可以施加至相同或不同結(jié)合墊上。
通常能夠產(chǎn)生可視覺(jué)檢測(cè)或通過(guò)儀器裝置檢測(cè)的信號(hào)的任意物質(zhì)可以用作檢測(cè)探針41和/或校正探針43。各種適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)包括生色團(tuán)；催化劑；熒光化合物；化學(xué)發(fā)光化合物；磷光化合物；放射性化合物；直接目測(cè)的標(biāo)記物，包括膠體金屬(例如金)和非金屬顆粒、染料顆粒、酶或底物，或有機(jī)聚合物乳膠顆粒；脂質(zhì)體或其它含有信號(hào)生成物質(zhì)的囊泡；等等。例如，Litamen等的美國(guó)專利No.4275149中公開(kāi)了適合用作探針的酶，出于所有目的，該申請(qǐng)?jiān)诒疚闹薪Y(jié)合并引用。酶/底物系統(tǒng)的一個(gè)例子為堿性磷酸酶和底物硝基藍(lán)四唑-5-溴-4-氯-3-引哚磷酸鹽，或其衍生物或類似物，或者底物4-甲基umbelliferyl-磷酸鹽。其它適當(dāng)?shù)奶结樤贘ou等的美國(guó)專利申請(qǐng)No.5670381和Tarcha等的美國(guó)專利申請(qǐng)No.5252459中進(jìn)行了描述，出于所有目的，所述申請(qǐng)全文在本文中結(jié)合并引用。
在某些實(shí)施方式中，檢測(cè)探針41和/或校正探針43可以含有生成可檢測(cè)信號(hào)的熒光化合物。所述熒光化合物可以是熒光分子、聚合物、樹(shù)狀物、顆粒等等。某些適當(dāng)熒光分子的例子例如包括但不限于，熒光素、銪螯合物、藻膽蛋白、若丹明和它們的衍生物及類似物。而且，某些商業(yè)可得的適當(dāng)熒光顆粒的例子包括Molecular Probes公司出售的熒光羧化微球，其商品名為“FluoSphere”(Red580/605)和“TransfluoSphere”(543/620)，以及“Texas Red”和5-及6-羧基四甲基若丹明，它們同樣由Molecular Probes公司出售。
不論采用那種方法使探針具有產(chǎn)生信號(hào)的能力，通常所需要的是，檢測(cè)探針41和/或校正探針43為磁響應(yīng)探針。通常，如果材料受施加的磁場(chǎng)的影響，例如，其被吸引或排斥或具有可檢測(cè)的磁易感性或誘導(dǎo)，則認(rèn)為該材料為“磁響應(yīng)的”或“磁性的”。例如，可用于使探針具有磁屬性的適當(dāng)磁性響應(yīng)材料的某些例子包括但不限于，順磁性材料、超順磁性材料、鐵磁性材料、亞鐵磁性材料和變磁性材料。特定的例子為金屬，例如鐵、鎳、鈷、鉻、錳等；鑭系元素，例如釹、鉺等；合金，例如鋁、鎳、鈷、銅等的磁性合金；氧化物，例如氧化鐵(Fe3O4)、氧化亞鐵(Fe2O3)、氧化鉻(CrO2)、氧化鈷(CoO)、氧化鎳(NiO2)、氧化錳(Mn2O3)等；復(fù)合材料，例如鐵氧體等；以及固溶體，例如氧化鐵的磁鐵礦等。
在某些實(shí)施方式中，檢測(cè)探針41和/或校正探針43為熒光的和磁性的。熒光磁性探針是本領(lǐng)域公知的，通常包括磁響應(yīng)組分和熒光組分。在某些實(shí)施方式中，例如，可以將一個(gè)或多個(gè)熒光染料加至磁性顆粒上形成探針，而在其它實(shí)施方式中，可以將熒光染料加至非磁性顆粒上，所述非磁性顆粒和磁性顆粒結(jié)合。某些熒光染料的適當(dāng)例子包括但不限于，單次甲基染料、三次甲基染料、五次甲基染料、喹啉染料、基于方形酸的染料等等。作為單次甲基染料的吡啶通常具有藍(lán)色或藍(lán)綠熒光發(fā)射，而喹啉通常具有綠色或黃綠熒光發(fā)射。所述三次甲基染料基本上向紅色波長(zhǎng)漂移，而五次甲基染料漂移地更遠(yuǎn)，通常顯示紅外熒光發(fā)射。所述熒光染料的特殊例子包括但不限于，酞菁、2，3-萘亞甲基菁、squaraine和克酮酸衍生物。其它適當(dāng)?shù)臒晒獯判灶w粒的例子見(jiàn)Luotola等的美國(guó)專利No.4731337和Chandler等的No.6268222，出于所有目的，所述中請(qǐng)的全文在本文中引用并結(jié)合。
當(dāng)檢測(cè)探針41和/或校正探針43為顆粒時(shí)，如上所述，根據(jù)不同因素，例如所選擇的顆粒的類型、膜的孔徑以及膜的組成，所述顆粒狀探針的平均直徑通?？梢愿鶕?jù)需要而改變。例如，在某些實(shí)施方式中，所述顆粒狀探針的平均直徑為大約0.01微米至大約1000微米，在某些實(shí)施方式中為大約0.01微米至大約100微米，在某些實(shí)施方式中為大約0.01微米至大約10微米。在一特定實(shí)施方式中，所述顆粒狀探針的平均直徑為大約1微米至大約2微米。通常，所述顆粒的形狀基本為球形，但是其它形狀也適用于本發(fā)明，包括但不限于，盤狀、桿狀、條狀、不規(guī)則形等等。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉的，顆粒的組成、形狀、大小和/或密度可以廣泛變化。
檢測(cè)探針41和/或校正探針43能夠結(jié)合(共價(jià)或非共價(jià))或物理吸附分析物。但是，通常所需要的是，以某種方式對(duì)探針進(jìn)行修飾，從而所述探針更加易于結(jié)合分析物。在這種情況下，檢測(cè)探針41和/或校正探針43可以用特定結(jié)合組分90a和/或90b進(jìn)行修飾，所述特定結(jié)合組分粘附其上形成探針結(jié)合物。
特定結(jié)合組分通常是指特定結(jié)合對(duì)中的一個(gè)組分，所述結(jié)合對(duì)即兩個(gè)不同分子，其中一個(gè)分子與第二個(gè)分子化學(xué)和/或物理結(jié)合。例如，免疫反應(yīng)性特定結(jié)合組分可以包括抗原、半抗原、寡核苷酸配基(aptamer)、抗體以及它們的復(fù)合物，包括由重組DNA方法或肽合成形成的復(fù)合物。抗體可以是單克隆或多克隆抗體、重組蛋白或它們的混合物或片段，以及抗體和其它特定結(jié)合組分的混合物。上述抗體的制備和用作特定結(jié)合組分的適用性的細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
其它常見(jiàn)的特定結(jié)合對(duì)包括但不限于，生物素和抗生物素蛋白、碳水化合物和凝集素、互補(bǔ)核苷酸序列(包括在DNA雜交檢測(cè)中使用的探針和捕獲核酸序列，用于檢測(cè)靶核酸序列)、互補(bǔ)肽序列(包括用重組方法形成的肽序列)、效應(yīng)物和受體分子、激素和激素結(jié)合蛋白、酶協(xié)同因子和酶、酶抑制劑和酶，等等。而且，特定結(jié)合對(duì)包括的組分可以是原始特定結(jié)合組分的類似物。例如，可以使用分析物的衍生物或片段，即分析物類似物，只要其與分析物具有至少一個(gè)相同的表位。
所述特定結(jié)合組分90a和/或90b通?？梢圆捎酶鞣N公知的技術(shù)附著于探針41和/或43上。例如，采用羧基、氨基、醛基、溴乙酰基、碘乙酰基、硫醇基、環(huán)氧基以及其它反應(yīng)或連接功能團(tuán)將特定結(jié)合組分90a和/或90b(例如微粒)共價(jià)連接至探針41和/或43上(例如微粒)，以及通過(guò)剩余游離基和游離陽(yáng)離子發(fā)生蛋白耦合反應(yīng)從而將特定結(jié)合組分共價(jià)連接至探針上。表面功能基團(tuán)還可以結(jié)合作為功能化的共聚單體，這是由于微粒的表面可以具有相對(duì)高的極化基團(tuán)表面濃度。另外，雖然微粒探針通常在合成后進(jìn)行功能化，在特定情況下，例如聚苯硫酚，微粒能夠直接與蛋白共價(jià)連接，不需要進(jìn)一步的修飾。例如，附圖6中描述了本發(fā)明的共價(jià)結(jié)合探針的一個(gè)實(shí)施方式。如圖所示，結(jié)合的第一步是采用碳化二亞胺活化探針表面的羧基。第二步，活化的羧酸基團(tuán)與抗體的氨基反應(yīng)從而形成酰胺結(jié)合?？梢栽诰彌_液中進(jìn)行活化和/或抗體耦合，例如磷酸鹽緩沖液(PBS)(例如，PH為7.2)或2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES，例如PH5.3)。如圖所示，然后用例如乙醇胺阻斷所得到的探針，從而形成探針共軛物。除了共價(jià)結(jié)合之外，本發(fā)明中還可以采用其它連接方法，例如物理吸附。
再次參照附圖1-2，開(kāi)始時(shí)可以將含有分析物的測(cè)試樣品施加至加樣墊上。然后，所述測(cè)試樣品從加樣墊遷移至結(jié)合墊22，其中分析物與檢測(cè)探針41和/或校正探針43混合。根據(jù)所選擇的探針類型，分析物可以與檢測(cè)探針41和/或校正探針43結(jié)合從而形成復(fù)合物49(見(jiàn)附圖2)。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，含有分析物的測(cè)試樣品與(1)熒光非磁性顆粒41混合和(2)熒光磁性顆粒43混合，所述熒光非磁性顆粒41與第一結(jié)合組分90a結(jié)合，所述熒光磁性顆粒43與第二結(jié)合組分90b結(jié)合。在上述例子中，分析物與熒光非磁性顆粒41和熒光磁性顆粒43形成夾層體式復(fù)合物49。而且，由于結(jié)合墊22與多孔膜23流體連接，復(fù)合物49可以從結(jié)合墊22遷移至多孔膜23上的檢測(cè)區(qū)31。
在檢測(cè)區(qū)31處，復(fù)合物49和任意游離的結(jié)合熒光磁性顆粒43被磁性裝置60捕獲，并采用常規(guī)技術(shù)從其余樣品中分離除去。例如磁場(chǎng)發(fā)生器可用于產(chǎn)生磁場(chǎng)，其引發(fā)磁響應(yīng)探針的響應(yīng)。適當(dāng)?shù)拇艌?chǎng)發(fā)生器包括但不限于，永磁體和電磁體。所述磁分離過(guò)程通常涉及將樣品與液體介質(zhì)中的磁性顆?；旌?，從而通過(guò)親和反應(yīng)結(jié)合分析物，然后，通過(guò)施加磁場(chǎng)從樣品介質(zhì)中分離未結(jié)合的磁性顆粒和分析物復(fù)合物。如果不是所有磁性顆粒，除了膠體顆粒外，大部分磁性顆粒及時(shí)沉降。因此，可以攪拌所述液體介質(zhì)，使顆粒懸浮充足時(shí)間，從而發(fā)生生物親和結(jié)合反應(yīng)。已知的攪拌方法包括振蕩、渦旋、搖動(dòng)、旋轉(zhuǎn)或者在部分充滿的容器中進(jìn)行類似操作。某些適當(dāng)磁分離裝置的商業(yè)上可購(gòu)得的例子包括紐約Daynal公司，Lake Success生產(chǎn)的Dynal MPC分離器系列，所述裝置在容納測(cè)試介質(zhì)的容器外部設(shè)置永磁體，其僅僅用于分離。單獨(dú)對(duì)測(cè)試介質(zhì)中的磁性顆粒進(jìn)行混合從而用于親和結(jié)合反應(yīng)。此外，其它捕獲磁性顆粒的方法參見(jiàn)Liberti等的美國(guó)專利申請(qǐng)No.5200084、Tuunanen等的No.5647994、Wang等的No.5795470以及Siddiqi等的No.6033574，出于所有目的，所述申請(qǐng)的全文在本文中結(jié)合并引用。
一旦被捕獲，可以用常規(guī)技術(shù)測(cè)量復(fù)合和未復(fù)合的熒光磁性顆粒43和復(fù)合物49的熒光信號(hào)。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，顆粒43和復(fù)合物49可用同樣外部源進(jìn)行激發(fā)。在該實(shí)施方式中，所述源提供位于激發(fā)波長(zhǎng)處的輻射，從而使顆粒43發(fā)出光，所述光的波長(zhǎng)不同于復(fù)合物49所發(fā)出的波長(zhǎng)。這樣，可以單獨(dú)測(cè)量復(fù)合物49和顆粒41的存在。另外，還可以采用單獨(dú)的外部源單獨(dú)測(cè)量顆粒43和復(fù)合物49。
通常而言，熒光為特定熒光化合物發(fā)生的三階段過(guò)程的結(jié)果。在第一階段，由外部源提供能量，例如白熾燈或激光，能量被熒光化合物吸收，得到激發(fā)的電子單重態(tài)。在第二階段，激發(fā)態(tài)持續(xù)一有限時(shí)間，在此期間，熒光化合物發(fā)生構(gòu)型改變，同時(shí)還與其分子環(huán)境發(fā)生多種相互作用。在此時(shí)間內(nèi)，激發(fā)態(tài)的能量部分被消耗，產(chǎn)生松弛態(tài)，由此產(chǎn)生熒光發(fā)射。第三階段為熒光發(fā)射階段，發(fā)射能量，將熒光化合物返回至基態(tài)。發(fā)射出的能量低于其激發(fā)能(燈或激光)，因此具有較長(zhǎng)的波長(zhǎng)。這種能量或波長(zhǎng)的漂移或不同使得發(fā)射能能夠被檢測(cè)出來(lái)，并與激發(fā)能分離開(kāi)。
熒光檢測(cè)通常利用波長(zhǎng)過(guò)濾將發(fā)射光子同激發(fā)光子區(qū)分開(kāi)來(lái)，以及檢測(cè)器將發(fā)射光子記錄下來(lái)并生成可記錄的輸出，所述輸出通常為電信號(hào)或攝影圖像。通常有四種類型的公認(rèn)檢測(cè)器分光熒光計(jì)和微板讀數(shù)器；熒光顯微鏡；熒光掃描儀；和流式細(xì)胞計(jì)。本發(fā)明中采用的一個(gè)適當(dāng)熒光檢測(cè)器為Fluorolog III分光熒光計(jì)，其由新澤西州的SPEX Industiries，Inc.of Edison出售。
盡管不需要，特別需要的檢測(cè)和校正探針對(duì)的選擇原則包括(1)吸收光譜或熒光光譜之間很少或沒(méi)有光譜重疊，從而可以分別測(cè)量發(fā)射強(qiáng)度；(2)當(dāng)檢測(cè)和校正探針緊鄰放置在一起時(shí)，檢測(cè)和校正探針之間沒(méi)有顯著的熒光能量轉(zhuǎn)移，從而它們可以獨(dú)立發(fā)射；和(3)具有相對(duì)較長(zhǎng)的發(fā)射波長(zhǎng)(例如大于大約600nm)，從而生物液體的自熒光對(duì)熒光測(cè)量具有最小的影響。例如，附圖7顯示了示例性的校正探針和檢測(cè)探針，它們的激發(fā)光譜具有很少的重疊，從而校正探針和檢測(cè)探針可以獨(dú)立地被激發(fā)。
進(jìn)一步地，如果需要，在本發(fā)明中還可以采用稱為“時(shí)間分辨熒光檢測(cè)”的技術(shù)。時(shí)間分辨熒光檢測(cè)設(shè)計(jì)用于減少來(lái)自發(fā)射源或來(lái)自散射過(guò)程(來(lái)自激勵(lì)輻射的散射)的背景信號(hào)，其利用了特定熒光材料的熒光特性，例如銪(Eu(III)和鋱(Tb(III))的鑭系螯合物。在非常短的波長(zhǎng)激發(fā)所述螯合物之后，其可以顯示較強(qiáng)的紅色漂移、窄帶、壽命較長(zhǎng)的發(fā)射。通常，由于生色團(tuán)鄰近所述分子中的鑭系元素，因此所述螯合物具有強(qiáng)的紫外吸收波段。在生色團(tuán)的光吸收之后，所述激勵(lì)能量從被激發(fā)的生色團(tuán)轉(zhuǎn)移至鑭系元素。之后為所述鑭系元素的熒光發(fā)射特性。采用脈沖式激勵(lì)和按時(shí)選通的檢測(cè)，以及窄波帶發(fā)射濾光器，能夠僅僅對(duì)來(lái)自鑭系螯合物的熒光進(jìn)行特定檢測(cè)，而排除來(lái)自樣品中其它物質(zhì)的發(fā)射，所述發(fā)射通常存在時(shí)間較短或具有較短的波長(zhǎng)發(fā)射。其它用于測(cè)量熒光的時(shí)間分辨技術(shù)參見(jiàn)Davidson的美國(guó)專利申請(qǐng)No.5585279和Hemmila等的No.5637509，出于所有目的，所述申請(qǐng)的全文在本文中結(jié)合并引用。
不論所采用的測(cè)量熒光的技術(shù)，通過(guò)比較捕獲的熒光非磁性顆粒41和捕獲的熒光磁性顆粒43的熒光信號(hào)，可以確定分析物的絕對(duì)量。所述捕獲的熒光非磁性顆粒41的熒光強(qiáng)度Is可以與捕獲的熒光磁性顆粒43的熒光強(qiáng)度Ic進(jìn)行比較。被捕獲的熒光磁性顆粒43的總量是預(yù)定的而且已知的，從而可以用于校正。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，分析物的量與Is和Ic的比率成正比?；跈z測(cè)區(qū)31所位于的強(qiáng)度范圍，可以確定分析物的總濃度范圍。因此，可以同時(shí)在近似相同的條件下進(jìn)行校正和樣品檢測(cè)，從而提供可靠的定量或半定量結(jié)果，同時(shí)其靈敏度增加。
如果需要，Is與Ic的比率可以在已知分析物濃度范圍內(nèi)對(duì)分析物的濃度進(jìn)行作圖，從而得到校正曲線。為了確定未知測(cè)試樣品中分析物的量，所述信號(hào)比率可以根據(jù)校正曲線轉(zhuǎn)換為分析物濃度。應(yīng)注意的是，所述復(fù)合和未復(fù)合熒光磁性顆粒的捕獲效率對(duì)于任意給定樣品通常是相同的。因此，捕獲效率的變化對(duì)來(lái)自一個(gè)樣品接一個(gè)樣品的結(jié)果沒(méi)有顯著干擾，這是因?yàn)椴捎昧藷晒鈴?qiáng)度比率(即Is/Ic)而不是絕對(duì)熒光。還應(yīng)注意的是，還可以對(duì)Is和Ic之間的其它數(shù)學(xué)關(guān)系和分析物濃度進(jìn)行作圖，從而得到校正曲線。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，可以對(duì)Is/(Is+Ic)的值和分析物濃度進(jìn)行作圖，從而得到校正曲線。
本發(fā)明還考慮了其它不同的實(shí)施方式。例如，參照附圖3，可以對(duì)上文所述的附圖1中的檢測(cè)裝置20進(jìn)行修改，從而形成另一夾層體式檢測(cè)模式。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如可以一開(kāi)始將含有分析物的測(cè)試樣品與(1)和第一結(jié)合組分190a結(jié)合的熒光非磁性顆粒141a，(2)熒光磁性顆粒143，(3)和第二結(jié)合組分190b結(jié)合的非熒光磁性顆粒141b混合。在該特定實(shí)施方式中，所述熒光磁性顆粒143可以被阻斷劑阻斷，例如β-酪蛋白，從而防止與分析物的非特異性結(jié)合，從而使得所述顆粒143僅僅作為校正探針。進(jìn)一步地，第一特定結(jié)合組分190a和第二特定結(jié)合組分190b可以是分析物的類似物。
術(shù)語(yǔ)“阻斷劑”是指附著于探針表面上的試劑，從而其“阻斷”或防止非分析物材料結(jié)合至所述表面。阻斷劑可以包括但不限于，β-酪蛋白、白蛋白例如牛血清白蛋白、pluronic或其它表面活性劑、聚乙二醇、聚乙烯醇、或上述化合物的硫化衍生物以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意阻斷材料。
再次參照附圖3，所述分析物、結(jié)合熒光非磁性顆粒141a和結(jié)合非熒光磁性顆粒141b形成夾層體式復(fù)合物149。由于結(jié)合墊22與多孔膜23流體接觸，所述復(fù)合物149可以從結(jié)合墊22遷移至多孔膜23上的檢測(cè)區(qū)31。在檢測(cè)區(qū)31，復(fù)合物149和任意未結(jié)合顆粒143和/或141b被磁性裝置60捕獲，并從其它樣品中分離出來(lái)。如上所述，通過(guò)比較捕獲的熒光非磁性顆粒141a的熒光強(qiáng)度Is和捕獲的熒光磁性顆粒143的熒光強(qiáng)度Ic，可以確定分析物的絕對(duì)量。特別是，捕獲的熒光磁性顆粒143的總量是事先確定而且已知的，從而可以用于校正。因此，該實(shí)施方式中分析物的量與Is和Ic的比率成正比。
而且，參照附圖4，可以對(duì)上文所述的附圖1中的檢測(cè)裝置20進(jìn)行修改，從而形成競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如，可以一開(kāi)始將含有分析物的測(cè)試樣品與(1)和第一結(jié)合組分290a結(jié)合的熒光非磁性顆粒241，(2)和第二結(jié)合組分290b結(jié)合的熒光磁性顆粒243混合。在該特定實(shí)施方式中，第一結(jié)合組分290a可以與分析物相同，而第二結(jié)合組分290b可以是分析物的類似物。
一旦混合，分析物與結(jié)合的熒光非磁性顆粒241競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的熒光磁性顆粒243，從而形成了分析物和熒光磁性顆粒243的復(fù)合物249a以及熒光磁性顆粒243和熒光非磁性顆粒241的復(fù)合物249b。由于結(jié)合墊22與多孔膜23流體連接，復(fù)合物249a和249b可以從結(jié)合墊22遷移至多孔膜23上的檢測(cè)區(qū)31。在檢測(cè)區(qū)31處，復(fù)合物249a和249b以及任意未結(jié)合顆粒243被磁性裝置60捕獲，并與其它樣品分離。如上所述，通過(guò)比較捕獲的熒光非磁性顆粒241的熒光強(qiáng)度Is和捕獲的復(fù)合或未復(fù)合的熒光磁性顆粒243的熒光強(qiáng)度Ic，可以確定分析物的絕對(duì)量。特別是，捕獲的熒光磁性顆粒243的總量是事先確定而且已知的，從而可以用于校正。因此，該實(shí)施方式中分析物的量與Is和Ic的比率成正比。
參照附圖5，可以對(duì)上文所述的附圖1中的檢測(cè)裝置20進(jìn)行修改，從而形成另一競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)模式。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如，可以一開(kāi)始將含有分析物的測(cè)試樣品與(1)和第一結(jié)合組分390a結(jié)合的熒光非磁性顆粒341a，(2)熒光磁性顆粒343，(3)和第二結(jié)合組分390b結(jié)合的非熒光磁性顆粒341b混合。在該特定實(shí)施方式中，第一結(jié)合組分390a可以與分析物相同，而第二結(jié)合組分390b可以是分析物的類似物。進(jìn)一步地，可以用阻斷劑阻斷熒光磁性顆粒343，例如β-酪蛋白，從而防止與分析物的非特異性結(jié)合，從而使得所述顆粒僅僅作為校正探針。
一旦混合，所述分析物與結(jié)合的熒光非磁性顆粒341a競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的非熒光磁性顆粒341b，從而形成了分析物和非熒光磁性顆粒341b的復(fù)合物349a以及非熒光磁性顆粒341b和熒光非磁性顆粒341a的復(fù)合物349b。由于結(jié)合墊22與多孔膜23流體連接，復(fù)合物349a和349b可以從結(jié)合墊22遷移至多孔膜23上的檢測(cè)區(qū)31。在檢測(cè)區(qū)31處，復(fù)合物349a和349b以及任意未結(jié)合顆粒343和/或341b被磁性裝置60捕獲，并與其它樣品分離。如上所述，通過(guò)比較捕獲的熒光非磁性顆粒341a的熒光強(qiáng)度Is和捕獲的熒光磁性顆粒343的熒光強(qiáng)度Ic，可以確定分析物的絕對(duì)量。特別是，捕獲的熒光磁性顆粒343的總量是事先確定而且已知的，從而可以用于校正。因此，該實(shí)施方式中分析物的量與Is和Ic的比率成反比。
盡管上文已經(jīng)對(duì)檢測(cè)裝置結(jié)構(gòu)的不同實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)這樣理解，本發(fā)明的檢測(cè)裝置通常具有任意所需要的結(jié)構(gòu)。例如，可以形成如附圖4所示和上文所述的競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)裝置，除了顆粒241是熒光磁性顆粒，顆粒243是熒光非磁性顆粒。同樣，可以形成如附圖5所示和上文所述的競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)裝置，除了顆粒341a為非熒光的磁性顆粒，顆粒341b為熒光的非磁性顆粒。另外，除了流式基于膜的檢測(cè)裝置，本發(fā)明中還可以使用其它類型的檢測(cè)裝置，例如毛細(xì)管、基于流體和基于溶液的檢測(cè)裝置。Lambotte等的美國(guó)專利申請(qǐng)No.5395754，Jou等No.5670381和Malick等No.6194220中還描述了其它不同的檢測(cè)裝置結(jié)構(gòu)，出于所有目的，所述中請(qǐng)的全文在本文中結(jié)合并引用。
而且，盡管上文已經(jīng)描述了尤其涉及熒光在校正和檢測(cè)中的應(yīng)用的各種實(shí)施方式，但是，其它公知的檢測(cè)機(jī)制也同樣適用于本發(fā)明。例如，在某些實(shí)施方式中，檢測(cè)和/或校正探針可以為化學(xué)發(fā)光或磷光化合物?；瘜W(xué)發(fā)光探針，例如可以通過(guò)采用適當(dāng)?shù)谋绢I(lǐng)域公知的反應(yīng)物進(jìn)行激發(fā)。本發(fā)明還考慮了其它的實(shí)施方式和結(jié)構(gòu)。
因此，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以利用對(duì)磁性顆粒的操控建立對(duì)分析物的分離和檢測(cè)。尤其是，在一完整系統(tǒng)中結(jié)合磁分離和檢測(cè)技術(shù)(例如，熒光)。進(jìn)一步地，所述系統(tǒng)為自校正的，從而當(dāng)采用常規(guī)外部校正技術(shù)時(shí)不需要使用對(duì)照校正樣品。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)采用熒光磁性探針實(shí)現(xiàn)了自校正。在同一樣品中可以分別測(cè)量所述熒光磁性顆粒和熒光非磁性顆粒發(fā)出的熒光。由于磁性顆粒的數(shù)量是預(yù)先確定的，因此當(dāng)確定捕獲的熒光非磁性探針的量以及隨后的分析物量時(shí)，所述系統(tǒng)是自校正的。而且，由于在相同條件下對(duì)校正和檢測(cè)探針發(fā)出的熒光進(jìn)行同時(shí)測(cè)量，可以避免來(lái)自多種變化的潛在干擾，例如溫度和儀器的不穩(wěn)定性，從而提高了檢測(cè)的可靠性和一致性。
參照以下例子可以更好地理解本發(fā)明。
實(shí)施例1顯示了本發(fā)明利用如附圖3所示的夾層體式檢測(cè)測(cè)定分析物存在的能力。開(kāi)始，將以下組分加入六個(gè)Eppendorf小瓶中(1)25微升共價(jià)結(jié)合的非熒光磁性顆粒(每毫升PBS緩沖液中3毫克)；(2)15微升共價(jià)結(jié)合的熒光非磁性顆粒(每毫升PBS緩沖液中2毫克)；(3)10微升被β-酪蛋白阻斷的熒光磁性顆粒(每毫升PBS緩沖液中3毫克)；以及(4)0，10微升(每毫升1微克)，20微升(每毫升1微克)，40微升(每毫升1微克)，40微升(每毫升2毫克)和80微升(每毫升2毫克)的促黃體生成素(LH)分析物。
在每個(gè)Eppendorf小瓶中加入適當(dāng)量的PBS緩沖液從而使終體積達(dá)到150微升。在室溫下孵化所述樣品10分鐘，并進(jìn)行輕微振蕩。然后用Dyanl公司的磁分離器分離磁性顆粒。棄去每個(gè)小瓶的上清液，將磁性顆粒重新懸浮于1.5毫升PBS中。將300微升所述熒光磁性顆粒懸浮液用于每個(gè)熒光測(cè)量中。采用SPEX Industries，Inc.of Edison，N.J.的Flourolog III Spectrofluorometer利用直角模式測(cè)量樣品的熒光。對(duì)于熒光磁性顆粒，激勵(lì)波長(zhǎng)為470納米，發(fā)射波長(zhǎng)為560納米，而對(duì)于熒光非磁性顆粒，激勵(lì)波長(zhǎng)為570納米，發(fā)射波長(zhǎng)為605納米。所述積分時(shí)間為0.2秒。
附圖8顯示了作為每個(gè)樣品中LH劑量的函數(shù)的標(biāo)化和校正熒光強(qiáng)度。標(biāo)化強(qiáng)度由樣品的經(jīng)測(cè)量的熒光強(qiáng)度除以對(duì)照樣品的熒光強(qiáng)度得到。所述對(duì)照樣品是不含有分析物的樣品。
實(shí)施例1中使用的顆粒由以下形成非熒光磁性顆粒125微升的10％經(jīng)羧化修飾的順磁性顆粒(0.35微米，Estapor超順磁性微球，來(lái)自Bang’s Laboratories公司)用1.5毫升碳酸鹽緩沖液清洗一次，并采用磁分離器用PBS清洗兩次。清洗過(guò)的顆粒重新懸浮于0.6毫升PBS和15毫克碳化二亞胺中(來(lái)自Polysciences公司)。在振蕩器上將所述混合物在室溫(RT)下反應(yīng)30分鐘。經(jīng)活化的顆粒用硼酸鹽緩沖液清洗兩次。所述活化顆粒再次懸浮于1.2毫升硼酸鹽緩沖液中。之后，在活化顆粒中加入30微升LHβ-單克隆抗體(9.8mg/ml，來(lái)自Fitzgerald Industries International，Inc.)。將反應(yīng)混合物置于振蕩器上在室溫下反應(yīng)過(guò)夜。然后收集活化顆粒，在1毫升0.1摩爾乙醇胺中孵化15分鐘，并輕微振蕩。然后，用PBS清洗所述顆粒兩次，在4℃下在含有0.1摩爾PBS、0.15摩爾NaCl、1％β-酪蛋白、5％甘油和0.1％NaN3的緩沖液中存儲(chǔ)。
熒光非磁性顆粒所述熒光非磁性顆粒根據(jù)上述過(guò)程共價(jià)結(jié)合，除了所述結(jié)合組分為L(zhǎng)Hα-單克隆抗體(9.8mg/ml，來(lái)自Fitzgerald IndustriesInternational，Inc.)，而不是LHβ-單克隆抗體。所使用的顆粒為FluoSpheres經(jīng)羧化修飾的微球，來(lái)自Molecular Probes公司。所述顆粒的粒度為0.5微米，激勵(lì)波長(zhǎng)為580納米，發(fā)射波長(zhǎng)為605納米，發(fā)出紅色熒光。
熒光磁性顆粒在Eppendorf管中加入100微升2.76％熒光超順磁性顆粒(來(lái)自Polysciences，Inc.of Warrington，賓夕法尼亞州)的固體懸浮液和1毫升硼酸鹽緩沖液(0.1摩爾，PH＝8.5)。所述顆粒的平均直徑為1至2微米，為含有鐵的微球，其聚苯乙烯表面可以進(jìn)行被動(dòng)吸附和與蛋白質(zhì)發(fā)生功能化基團(tuán)反應(yīng)。采用Dynal公司的磁分離器分離顆粒，并重新懸浮于200微升的10毫克每毫升β-酪蛋白溶液中(0.1摩爾的硼酸鹽緩沖液中)。所述懸浮液孵化30分鐘，并進(jìn)行輕微振蕩。重復(fù)上述步驟兩次。分離的顆粒在200微升PBS中重新懸浮，并在4℃下存儲(chǔ)。
促黃體生成素(LH)促黃體生成素(LH)來(lái)自Fitzgerald Industries International，Inc.。
實(shí)施例2顯示了本發(fā)明利用如附圖1所示的夾層體式檢測(cè)裝置檢測(cè)分析物存在的能力。開(kāi)始，將以下組分加入六個(gè)Eppendorf小瓶中(1)5微升共價(jià)結(jié)合的熒光非磁性顆粒(每毫升PBS緩沖液中2毫克)；(2)15微升物理吸附的結(jié)合熒光磁性顆粒(每毫升PBS緩沖液中3毫克)；和(3)0，5，10微升，20，40和100微升(每毫升2微克)的促黃體生成素(LH)分析物。
在每個(gè)Eppendorf小瓶中加入適當(dāng)量的PBS緩沖液從而使終體積達(dá)到150微升。在室溫下孵化所述樣品25分鐘，并進(jìn)行輕微振蕩。然后用Dyanl公司的磁分離器分離磁性顆粒。棄去每個(gè)小瓶的上清液，將磁性顆粒重新懸浮于1.5毫升PBS中。將300微升所述熒光磁性顆粒懸浮液用于每次熒光測(cè)量中。采用SPEX Industries，Inc.of Edison，N.J.的Flourolog III Spectrofluorometer利用直角模式測(cè)量樣品的熒光。對(duì)于熒光磁性顆粒，激勵(lì)波長(zhǎng)為470納米，發(fā)射波長(zhǎng)為560納米，而對(duì)于熒光非磁性顆粒，激勵(lì)波長(zhǎng)為570納米，發(fā)射波長(zhǎng)為605納米。所述積分時(shí)間為0.2秒至1秒。
附圖9顯示了作為每個(gè)樣品中LH劑量的函數(shù)的標(biāo)化和校正熒光強(qiáng)度。
實(shí)施例2中使用的顆粒由以下形成熒光非磁性顆粒如實(shí)施例1所述形成所述熒光非磁性顆粒。
熒光磁性顆粒從賓夕法尼亞州的Polysciences，Inc.of Warrington獲得2.76毫克的熒光超順磁性顆粒(水溶液中含有2.5％的固體)。用硼酸鹽溶液清洗所述顆粒三次，并用Dynal公司的磁分離器進(jìn)行分離。清洗過(guò)的顆粒重新懸浮于200微升硼酸鹽緩沖液中，加入82微克β-促黃體生成素(β-LH)單克隆抗體(1毫克每毫升，來(lái)自Fitgerald IndustriesInternational，Inc.)。輕微混合所述混合物在室溫下過(guò)夜。然后用磁分離器收集所述顆粒，并用200微升β-酪蛋白(100毫克每毫升硼酸鹽溶液)孵化30分鐘，并輕微振蕩，從而阻斷非特異性結(jié)合位。經(jīng)阻斷的顆粒用PBS清洗兩次，并存儲(chǔ)于0.1M PBS中。
促黃體生成素(LH)促黃體生成素(LH)來(lái)自Fitzgerald Industries International，Inc.。
實(shí)施例3對(duì)自校正磁結(jié)合測(cè)定與非校正磁結(jié)合測(cè)定進(jìn)行比較。
無(wú)自校正開(kāi)始，將以下組分加入5個(gè)Eppendorf小瓶中(表I中的瓶No.2-6)(1)15微升共價(jià)結(jié)合的非熒光磁性顆粒(在0.1摩爾的PBS緩沖液中每毫升3毫克)；(2)15微升共價(jià)結(jié)合的熒光非磁性顆粒(每毫升PBS緩沖液中2毫克)；(3)20微升促黃體生成素(LH)分析物(1微克每毫升)；以及(4)20微升PBS。
對(duì)照的Eppendorf小瓶?jī)H僅含有20微升PBS(表I中的瓶No.1)。
在室溫下孵化所述樣品20分鐘，并輕微振蕩。然后用Dynal公司的磁分離器分離所述磁性顆粒。棄去每個(gè)小瓶的上清液，將磁性顆粒重新懸浮于1.5毫升PBS中。將300微升熒光磁性顆粒懸浮液用于每次熒光測(cè)量。采用SPEX Industries，Inc.of Edison，N.J.的Flourolog IIISpectrofluorometer利用直角模式測(cè)量樣品的熒光。在不同天內(nèi)進(jìn)行熒光測(cè)量，激勵(lì)波長(zhǎng)為570納米，發(fā)射波長(zhǎng)為605納米。
表I列出了每天的相對(duì)熒光數(shù)據(jù)。
表I熒光測(cè)量
具有自校正開(kāi)始，將以下組分加入5個(gè)Eppendorf小瓶中(表II中的瓶No.9-13)(1)15微升共價(jià)結(jié)合的非熒光磁性顆粒(在0.1摩爾的PBS緩沖液中每毫升3毫克)；(2)15微升共價(jià)結(jié)合的熒光非磁性顆粒(每毫升PBS緩沖液中2毫克)；(3)20微升被β-酪蛋白阻斷的熒光磁性顆粒(每毫升PBS緩沖液中3毫克)(4)20微升促黃體生成素(LH)分析物(1微克每毫升)；以及(5)20微升PBS。
對(duì)照的Eppendorf小瓶?jī)H僅含有20微升PBS(表II中的瓶No.8)。
在室溫下孵化所述樣品20分鐘，并輕微振蕩。然后用Dynal公司的磁分離器分離所述磁性顆粒。棄去每個(gè)小瓶的上清液，將磁性顆粒重新懸浮于1.5毫升PBS中。將300微升熒光磁性顆粒懸浮液用于每次熒光測(cè)量。采用SPEX Industries，Inc.of Edison，N.J.的Flourolog IIISpectrofluorometer利用直角模式測(cè)量樣品的熒光。對(duì)于熒光磁性顆粒，激勵(lì)波長(zhǎng)為470納米，發(fā)射波長(zhǎng)為560納米，而對(duì)于熒光非磁性顆粒，激勵(lì)波長(zhǎng)為570納米，發(fā)射波長(zhǎng)為605納米。表II列出了每天的相對(duì)熒光數(shù)據(jù)。
表II熒光測(cè)量
從對(duì)兩個(gè)系統(tǒng)每組樣品的比較可以看出，甚至在經(jīng)過(guò)細(xì)心控制的條件下，自校正系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)差(Std.Dev％)明顯小于無(wú)自校正的標(biāo)準(zhǔn)差。由于自校正系統(tǒng)較少依賴于測(cè)量條件，預(yù)計(jì)在未經(jīng)過(guò)仔細(xì)控制的條件下，所述自校正系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)差將更加小于無(wú)自校正的標(biāo)準(zhǔn)差。
實(shí)施例3中使用的顆粒由以下形成非熒光磁性顆粒如實(shí)施例1所述形成所述非熒光磁性顆粒。
熒光非磁性顆粒如實(shí)施例1所述形成所述熒光非磁性顆粒。
熒光磁性顆粒如實(shí)施例2所述形成所述熒光磁性顆粒。
促黃體生成素(LH)促黃體生成素(LH)來(lái)自Fitzgerald Industries International，Inc.。
實(shí)施例4顯示了本發(fā)明利用如附圖3所示的夾層體式檢測(cè)裝置測(cè)定分析物存在的能力。開(kāi)始，將以下組分加入六個(gè)Eppendorf小瓶中(1)30微升共價(jià)結(jié)合的非熒光磁性顆粒(每毫升PBS緩沖液中2毫克)；(2)20微升共價(jià)結(jié)合的熒光非磁性顆粒(每毫升PBS緩沖液中2毫克)；
(3)15微升被β-酪蛋白阻斷的熒光磁性顆粒(每毫升PBS緩沖液中1毫克)；以及(4)0，5，10，20，50和100微升(0.2微克每毫升PBS)的C反應(yīng)蛋白(CRP)分析物。
在室溫下孵化所述樣品20分鐘，并輕微振蕩。然后用Dyanl公司的磁分離器分離磁性顆粒。棄去每個(gè)小瓶的上清液，將磁性顆粒重新懸浮于1.5毫升PBS中。將300微升所述熒光磁性顆粒懸浮液用于每次熒光測(cè)量中。采用SPEX Industries，Inc.of Edison，N.J.的FlourologIII Spectroiluorometer利用直角模式測(cè)量樣品的熒光。對(duì)于熒光磁性顆粒，激勵(lì)波長(zhǎng)為470納米，發(fā)射波長(zhǎng)為560納米，而對(duì)于熒光非磁性顆粒，激勵(lì)波長(zhǎng)為570納米，發(fā)射波長(zhǎng)為605納米。所述積分時(shí)間為0.2秒至1秒。附圖10顯示了作為每個(gè)樣品中CRP劑量的函數(shù)的標(biāo)化熒光強(qiáng)度。
實(shí)施例4中使用的顆粒由以下形成非熒光磁性顆粒125微升的10％經(jīng)羧化修飾的順磁性顆粒(0.35微米，Estapor超順磁性微球，來(lái)自Bang’s Laboratories公司)用1.5毫升碳酸鹽緩沖液清洗一次，并采用磁分離器用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩次。清洗過(guò)的顆粒重新懸浮于0.6毫升PBS和15毫克碳化二亞胺中(來(lái)自Polysciences公司)。在振蕩器上將所述混合物在室溫(RT)下反應(yīng)30分鐘。經(jīng)活化的顆粒用硼酸鹽緩沖液清洗兩次。所述活化顆粒再次懸浮于1.2毫升硼酸鹽緩沖液中。之后，在活化顆粒中加入30微升抗C反應(yīng)蛋白(抗-CRP1)單克隆抗體(Mab A5804，2mg/ml，來(lái)自BiosPacific公司)。將反應(yīng)混合物置于振蕩器上在室溫下反應(yīng)過(guò)夜。然后收集活化顆粒，在1毫升0.1摩爾乙醇胺中孵化15分鐘，并輕微振蕩。然后，用PBS清洗所述顆粒兩次，在4℃下在含有0.1摩爾PBS、0.15摩爾NaCl、1％β-酪蛋白、5％甘油和0.1％NaN3的緩沖液中存儲(chǔ)。
熒光非磁性顆粒所述熒光非磁性顆粒根據(jù)如上過(guò)程共價(jià)結(jié)合，除了所述結(jié)合組分是抗C反應(yīng)蛋白(抗-CRP2)單克隆抗體(2mg/ml，來(lái)自BiosPacific公司)，而不是抗-CRP1。所使用的顆粒為FluoSpheres經(jīng)羧化修飾的微球，來(lái)自Molecular Probes公司。所述顆粒的粒度為0.5微米，激勵(lì)波長(zhǎng)為580納米，發(fā)射波長(zhǎng)為605納米，發(fā)出紅色熒光。
熒光磁性顆粒在Eppendor管中加入100微升2.76％熒光超順磁性顆粒(來(lái)自Polysciences，Inc.of Warrington，賓夕法尼亞州)的固體懸浮液。所述顆粒的平均直徑為1至2微米，為含有鐵的微球，其聚苯乙烯表面可以進(jìn)行被動(dòng)吸附和與蛋白質(zhì)發(fā)生功能化基團(tuán)反應(yīng)。然后在Eppendorf管中向顆粒加入1毫升硼酸鹽緩沖液(0.1摩爾，PH＝8.5).采用Dynal公司的磁分離器分離顆粒，并重新懸浮于200微升的10毫克每毫升的β-酪蛋白溶液中(0.1摩爾的硼酸鹽緩沖液)。所述懸浮液孵化30分鐘，并輕微振蕩。重復(fù)上述步驟兩次。分離的顆粒在200微升PBS中重新懸浮，并在4℃下存儲(chǔ)。
C-反應(yīng)蛋白(CRP)所述C-反應(yīng)蛋白(CRP)來(lái)自BiosPacific公司。
盡管根據(jù)特定實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，但是應(yīng)當(dāng)注意的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員在理解上述的同時(shí)，可以很容易地想到對(duì)這些實(shí)施方式的修改、變化及等同物。因此本發(fā)明的范圍應(yīng)為以下權(quán)利要求及其任意等同物的范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在或量的自校正磁結(jié)合測(cè)定，所述磁結(jié)合測(cè)定包括能夠生成檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)探針和能夠生成校正信號(hào)的校正探針，其中測(cè)試樣品中分析物的量與經(jīng)校正信號(hào)強(qiáng)度校正的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度成比例。
2.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定，其中所述檢測(cè)探針、校正探針或它們的組合與特定結(jié)合組分結(jié)合。
3.如權(quán)利要求2所述的測(cè)定，其中所述特定結(jié)合組分選自由以下構(gòu)成的組，所述組包括抗原、半抗原、寡核苷酸配基、抗體和它們的復(fù)合物。
4.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定，其中所述檢測(cè)探針和校正探針選自由以下構(gòu)成的組，所述組包括熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、磷光化合物和它們的組合。
5.如權(quán)利要求4所述的測(cè)定，其中所述檢測(cè)探針和校正探針為熒光化合物。
6.如權(quán)利要求5所述的測(cè)定，其中所述熒光化合物為顆粒。
7.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定，其中所述檢測(cè)探針為熒光非磁性顆粒。
8.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定，其中所述校正探針為熒光磁性顆粒。
9.如權(quán)利要求8所述的測(cè)定，其中所述熒光磁性顆粒與特定結(jié)合組分結(jié)合。
10.如權(quán)利要求8所述的測(cè)定，其中所述熒光磁性顆粒被阻斷。
11.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定，其中所述檢測(cè)探針能夠結(jié)合分析物。
12.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定，進(jìn)一步包括非熒光磁性顆粒。
13.如權(quán)利要求12所述的測(cè)定，其中所述非熒光磁性顆粒能夠結(jié)合分析物。
14.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定，其中測(cè)試樣品中分析物的量與檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度和校正信號(hào)強(qiáng)度的商成比例。
15.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定，其中所述檢測(cè)為夾層體式檢測(cè)。
16.如權(quán)利要求1所述的測(cè)定，其中所述檢測(cè)為競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)。
17.一種用于檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在或量的自校正磁結(jié)合測(cè)定，所述磁結(jié)合測(cè)定包括能夠生成檢測(cè)信號(hào)的熒光非磁性檢測(cè)探針和能夠生成校正信號(hào)的熒光磁性校正探針，其中測(cè)試樣品中分析物的量與經(jīng)校正信號(hào)強(qiáng)度校正的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度成比例。
18.如權(quán)利要求17所述的測(cè)定，其中所述檢測(cè)探針、校正探針或它們的組合與特定結(jié)合組分結(jié)合。
19.如權(quán)利要求17所述的測(cè)定，其中所述檢測(cè)為夾層體式檢測(cè)。
20.如權(quán)利要求19所述的測(cè)定，其中測(cè)試樣品中分析物的量與經(jīng)校正信號(hào)強(qiáng)度校正的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度成正比。
21.如權(quán)利要求17所述的測(cè)定，其中所述檢測(cè)為競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)。
22.如權(quán)利要求21所述的測(cè)定，其中測(cè)試樣品中分析物的量與經(jīng)校正信號(hào)強(qiáng)度校正的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度成反比。
23.一種檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在或量的方法，所述方法包括i)提供磁結(jié)合測(cè)定，包括能夠生成檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)探針和能夠生成校正信號(hào)的校正探針；ii)使含有所述分析物的測(cè)試樣品與檢測(cè)探針和校正探針接觸；iii)采用磁性裝置從測(cè)試樣品中分離出檢測(cè)探針和校正探針；iv)激發(fā)分離出的檢測(cè)探針和分離出的校正探針，其中所述激發(fā)使得所述分離出的檢測(cè)探針發(fā)出檢測(cè)信號(hào)，使得分離出的校正探針發(fā)出校正信號(hào)；v)測(cè)量檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度和校正信號(hào)的強(qiáng)度；以及vi)比較檢測(cè)信號(hào)和校正信號(hào)的強(qiáng)度，其中測(cè)試樣品中的分析物量與經(jīng)校正信號(hào)的強(qiáng)度校正的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度成比例。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述檢測(cè)探針和校正探針為發(fā)出熒光的。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述檢測(cè)探針和校正探針為化學(xué)發(fā)光的。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述檢測(cè)探針和校正探針為發(fā)出磷光的。
27.如權(quán)利要求23所述的方法，其中在第一發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)量所述檢測(cè)信號(hào)。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中在第二發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)量所述校正信號(hào)。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中第一發(fā)射波長(zhǎng)不同于第二發(fā)射波長(zhǎng)。
30.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述檢測(cè)探針為非磁性的。
31.如權(quán)利要求23所述的方法，進(jìn)一步包括就多個(gè)預(yù)定分析物濃度對(duì)經(jīng)校正信號(hào)強(qiáng)度校正的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度作圖，從而得到校正曲線。
32.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述檢測(cè)為夾層體式檢測(cè)。
33.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述檢測(cè)為競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)。
34.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述分離的檢測(cè)探針和分離的校正探針同時(shí)被激發(fā)。
35.如權(quán)利要求23所述的方法，其中同時(shí)測(cè)量檢測(cè)信號(hào)和校正信號(hào)的強(qiáng)度。
全文摘要
提供了一種自校正磁結(jié)合測(cè)定(例如，夾層體式，競(jìng)爭(zhēng)性等)用于檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在或量。所述磁結(jié)合測(cè)定包括能夠生成檢測(cè)信號(hào)的檢測(cè)探針(例如熒光非磁性顆粒)和能夠生成校正信號(hào)的校正探針(例如熒光磁性顆粒)。測(cè)試樣品中分析物的量與經(jīng)校正信號(hào)強(qiáng)度校正的檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度成比例。
文檔編號(hào)G01N33/58GK1675544SQ03819386
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2003年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月27日
發(fā)明者宋旭東, R·凱洛 申請(qǐng)人:金伯利-克拉克環(huán)球有限公司