專利名稱：生物學(xué)分子的定量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及用于多肽鑒定和定量的分析技術(shù)。
背景技術(shù)：
多年以來，二維凝膠電泳(2D GE)一直是用于蛋白質(zhì)混合物的分離和定量的標(biāo)準(zhǔn)方法。使蛋白質(zhì)結(jié)合不同染料(染色)，例如考馬斯藍(lán)，或者使用放射性標(biāo)記，例如32P，使之有可能顯現(xiàn)凝膠上的蛋白質(zhì)斑點。對膠掃描后，使用光密度測定法測量斑點的“暗度”，并獲得定量信息。二十世紀(jì)九十年代，質(zhì)譜(MS)成為膠內(nèi)消化后鑒定蛋白質(zhì)的流行工具。盡管廣泛使用，然而2D GE-MS在處理很大或很小的蛋白質(zhì)、極端pI等級的蛋白質(zhì)、膜和低豐度蛋白質(zhì)時受到限制。染料的附著量與濃度不成正比，因此這種定量的可靠性仍然可疑。另外，一次2D凝膠電泳可能需要2天或更長時間，而且質(zhì)譜前的染色和脫色還需要額外的時間。放射線照相術(shù)也是非常冗長的流程。最后，切下凝膠斑點，消化蛋白質(zhì)，提取蛋白水解產(chǎn)物，并通過質(zhì)譜分析每一個個別斑點，這些都是費時費力的步驟。
通過質(zhì)譜對肽和蛋白質(zhì)混合物的定量已經(jīng)成為具有挑戰(zhàn)性的分析問題，主要是因為共洗脫種類間的離子化抑制。為了解決這些問題，已采用穩(wěn)定的同位素標(biāo)記肽作為質(zhì)譜的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。這些化合物是誘人的標(biāo)準(zhǔn)，因為，雖然它們的分子量不同，但是它們的化學(xué)和物理特性(諸如層析保持時間和離子化效率)與它們的未標(biāo)記對應(yīng)物相似。這些技術(shù)避免了對2D GE和光密度測定法的需要，但是產(chǎn)生了完全不同的一組問題。可能難以實現(xiàn)用稀有的穩(wěn)定同位素(如180)完全替代天然同位素(如160)以生成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物，這導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)分子中只有一部分預(yù)期原子得到了替代。稀有同位素標(biāo)記試劑還是昂貴的，而且操作這些試劑需要額外的安全措施和技術(shù)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于相對定量生物學(xué)混合物中的分子的技術(shù)。一般而言，一方面，本發(fā)明提供了執(zhí)行用于定量肽混合物中的肽中的技術(shù)的方法和裝置，包括電腦程序。該技術(shù)包括接收包含多種肽的第一肽混合物，在一段時間里分離第一肽混合物所含多種肽中的一種或多種，在一段時間的特定時間對第一肽混合物中的一種或多種分離肽進(jìn)行質(zhì)荷分析，計算第一肽混合物中的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度，并通過比較計算得出的第一肽混合物中的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度與參照樣品中一種或多種肽的豐度，計算第一肽混合物中的所述一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的相對量。所述參照樣品對于第一肽混合物而言是外部的。
具體的實施方案可以包括一個或多個以下特色。接收包含多種肽的第一肽混合物可以包括消化第一多肽樣品以生成第一肽混合物。該技術(shù)可以包括通過消化第二多肽樣品來制備參照樣品，由經(jīng)過消化的第二多肽樣品分離一種或多種肽，對由經(jīng)過消化的第二多肽樣品分離的肽進(jìn)行質(zhì)量分析，并計算第二多肽樣品中的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度。計算第一肽混合物中的所述一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的相對量可以包括將計算得出的第一肽混合物中的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度與計算得出的第二多肽樣品的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的相應(yīng)肽的豐度進(jìn)行比較。分離一種或多種肽可以包括通過液相層析分離該一種或多種肽。
分離一種或多種肽可以包括在特定時間分離液相層析洗脫液，而且對第一肽混合物的一種或多種分離肽進(jìn)行質(zhì)量分析可以包括對分離洗脫液中的一種或多種肽進(jìn)行質(zhì)量分析。
該技術(shù)可以包括鑒定第一肽混合物中的一種或多種肽。鑒定第一肽混合物中的一種或多種肽可以包括根據(jù)質(zhì)量分析信息鑒定一種或多種分離肽。對一種或多種分離肽進(jìn)行質(zhì)量分析可以包括對由所述一種或多種分離肽中的肽衍生的離子進(jìn)行片段化并對該離子的片段進(jìn)行質(zhì)量分析。鑒定第一樣品中的一種或多種肽可以包括根據(jù)片段的質(zhì)量分析信息搜索序列數(shù)據(jù)庫。
計算一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度可以包括根據(jù)肽的質(zhì)量分析信息重建肽的層析峰。計算肽的豐度可以包括根據(jù)肽的重建層析峰面積計算肽的豐度。計算肽的豐度可以包括只使用位于特定時間重建層析圖中閾值距離以內(nèi)的層析峰計算肽的豐度。
計算所述一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的相對量可以包括將通過重建第一肽混合物的肽的層析峰面積計算得出的豐度與通過重建參照樣品中的肽的層析峰面積計算得出的豐度進(jìn)行比較。
該技術(shù)可以包括對計算得出的第一肽混合物的所述一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。對計算得出的豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化可以包括根據(jù)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)對計算得出的豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，該內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)包括添加到第一多肽樣品中的一種或多種肽。對計算得出的豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化可以包括根據(jù)包含一種或多種肽的外部標(biāo)準(zhǔn)對計算得出的豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
該技術(shù)可以包括根據(jù)質(zhì)量分析鑒定第一肽混合物中的多種肽，其中計算一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的相對量包括計算每一種經(jīng)鑒定肽的相對量。根據(jù)第一肽混合物中的一組肽的重建層析峰面積計算校準(zhǔn)系數(shù)(這組肽中的每一種肽在多次實驗中具有恒定的層析峰面積)，并將校準(zhǔn)系數(shù)應(yīng)用于計算得出的每一種經(jīng)鑒定肽的豐度，從而可以對計算得出的每一種經(jīng)鑒定肽的豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
可以在單次自動化實驗中進(jìn)行質(zhì)量分析和計算步驟，以鑒定第一肽混合物中的每一種肽并計算其相對量。
進(jìn)行質(zhì)荷分析和計算步驟的所述一種或多種分離肽可以是天然存在的肽。參照樣品中的所述一種或多種肽可以是天然存在的肽。對一種或多種分離肽進(jìn)行質(zhì)荷分析并計算一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度可以包括對第一種混合物中的一種或多種任意肽進(jìn)行質(zhì)荷分析并計算豐度?？梢赃@樣執(zhí)行該技術(shù)，使得分離、質(zhì)荷分析、和計算步驟不局限于受試肽的特定氨基酸組成。
一般而言，另一方面，本發(fā)明提供了執(zhí)行用于定量混合物中的一種或多種肽的技術(shù)的方法和裝置，包括電腦程序。該技術(shù)包括消化蛋白質(zhì)樣品以生成肽混合物，使用液相層析分離肽混合物中的一種或多種肽，對一種或多種分離肽進(jìn)行質(zhì)量分析，根據(jù)肽的質(zhì)譜鑒定一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽，計算經(jīng)鑒定肽的層析峰面積，根據(jù)計算得出的經(jīng)鑒定肽的峰面積計算與相應(yīng)肽對應(yīng)的一種或多種蛋白質(zhì)的層析峰面積，根據(jù)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的層析峰面積對蛋白質(zhì)的層析峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并通過比較該蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化層析峰面積與參照樣品中的相應(yīng)蛋白質(zhì)的層析峰面積，確定一種或多種蛋白質(zhì)的相對量。
一般而言，又一方面，本發(fā)明的特色是執(zhí)行用于定量生物學(xué)樣品中的一種或多種化合物的技術(shù)的方法和裝置，包括電腦程序。該技術(shù)包括接收包含多種化合物的生物學(xué)樣品，在一段時間里分離生物學(xué)樣品所含多種化合物中的一種或多種，在一段時間的特定時間對生物學(xué)樣品的一種或多種分離化合物進(jìn)行質(zhì)荷分析，計算生物學(xué)樣品的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的化合物的豐度，并通過比較計算得出的生物學(xué)樣品中一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的化合物的豐度與參照樣品中一種或多種化合物的豐度，計算生物學(xué)樣品中一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的化合物的相對量，所述參照樣品對于生物學(xué)樣品而言是外部的。
可以執(zhí)行本發(fā)明以實現(xiàn)以下優(yōu)勢中的一項或多項。使用公開技術(shù)，可以將例如經(jīng)過藥物、營養(yǎng)素、毒素等處理的一組細(xì)胞中的蛋白質(zhì)相對豐度與來自對照細(xì)胞組的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，從而找出受到試劑的影響而過度表達(dá)或表達(dá)不足的那些蛋白質(zhì)?？梢詧?zhí)行該技術(shù)來尋找并定量疾病標(biāo)記或藥物靶，和/或篩選潛在藥物。可以執(zhí)行所述技術(shù)以避免現(xiàn)有凝膠電泳方法中存在的對獲得極端分子量和pI等級的蛋白質(zhì)的限制。該技術(shù)不受樣品含量或多肽性質(zhì)、特定氨基酸等限制，而且可以對天然存在的蛋白質(zhì)和肽執(zhí)行。分析前不需要費時費力的樣品標(biāo)記。同樣，不像同位素編碼親和標(biāo)簽(ICAT)或類似方法那樣需要昂貴試劑來生成內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。該技術(shù)不限于包含特定氨基酸(諸如半胱氨酸)的蛋白質(zhì)。可以比較無限數(shù)目的樣品。在分開的實驗中分析每份樣品，而且，如果需要，每次可以參考相同的參照樣品。樣品和參照樣品的實驗是不同的實驗。通過二維液相層析技術(shù)與串聯(lián)質(zhì)譜的聯(lián)合，有可能鑒定摻入未知修飾的蛋白質(zhì)以及具有相同分子量的不同蛋白質(zhì)并定量。不需要對肽完全分離；相反，在使用本文所述技術(shù)時甚至肽的部分分離就可能足以進(jìn)行定量。通過該技術(shù)的執(zhí)行，可以在一個自動化步驟中鑒定混合物中的所有蛋白質(zhì)。
下文附圖和詳述列出了本發(fā)明的一個或多個實施方案的細(xì)節(jié)。除非另有說明，本文所用所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。將本文提及的所有發(fā)表物、專利申請、專利、和其它參考文獻(xiàn)完整收入本文作為參考。如有沖突，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。本發(fā)明的其它特色和優(yōu)勢將通過詳述、附圖、和權(quán)利要求變得清晰。
附圖簡述

圖1是流程圖，例示了依照本發(fā)明的一個方面用于定量肽混合物中的肽的方法的一種執(zhí)行方式。
圖2是示意圖，例示了依照本發(fā)明的一個方面定量肽混合物中的肽的可操作系統(tǒng)。
圖3是更詳細(xì)的流程圖，例示了依照本發(fā)明的一個方面用于定量肽混合物中的肽的方法的一種執(zhí)行方式。
圖4例示了通過本發(fā)明一個方面的一種執(zhí)行提供的五蛋白質(zhì)混合物的典型離子層析圖(序列“TGPNLHGLFGR”是SEQ ID NO25)。
圖5A和5B例示了通過本發(fā)明一個方面的一次執(zhí)行提供的典型片段化質(zhì)譜及其解釋(序列“TGPNLHGLFGR”是SEQ ID NO25)。
圖6是依照本發(fā)明一個方面的一次執(zhí)行重建的層析峰面積的實例(序列“TGPNLHGLFGR”是SEQ ID NO25)。
圖7例示了依照本發(fā)明的一個方面重建的肌紅蛋白肽和清蛋白肽離子的八份層析圖。
圖8例示了依照本發(fā)明一個方面的肌紅蛋白消化物的校準(zhǔn)曲線。
圖9例示了依照本發(fā)明一個方面的細(xì)胞色素C的校準(zhǔn)曲線。
圖10(a)和(b)分別例示了依照本發(fā)明的一個方面用250和500fmol肌紅蛋白強(qiáng)化的人血漿消化物的基峰離子層析圖。
圖10(c)和(d)分別例示了依照本發(fā)明的一個方面用250和500fmol肌紅蛋白強(qiáng)化的人血漿中的經(jīng)鑒定肌紅蛋白肽的重建離子層析圖。
圖11例示了依照本發(fā)明的一個方面不同注入量的肌紅蛋白的合并層析峰面積的變化。
不同圖中的相同參考編號和名稱指相同元素。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于定量肽和蛋白質(zhì)的方法和裝置，包括電腦程序。參照圖1，依照本發(fā)明的一個方面，定量肽混合物中的肽的方法100首先分離由蛋白質(zhì)樣品衍生的肽集合(步驟110)。對分離肽進(jìn)行質(zhì)量分析(步驟120)。將分離和質(zhì)量分析信息用于計算混合物中一種或多種肽各自的豐度(步驟130)。通過比較計算得出的肽的豐度與計算得出的參照樣品的豐度，計算指定肽的相對量(步驟140)?？梢酝ㄟ^對參照樣品執(zhí)行步驟110至130來計算參照樣品的豐度，正如下文將要更加詳細(xì)描述的?？梢詫θ魏螖?shù)目的樣品重復(fù)方法100，從而可以對任意(即潛在無限)數(shù)目的樣品彼此和與參照樣品進(jìn)行比較。在分開的實驗中分析每份樣品，而且，如果需要，各樣品可以參考相同的參照樣品。樣品和參照樣品實驗是不同的實驗。
在用于本說明書時，肽或多肽指包含兩個或多個經(jīng)肽(酰胺)鍵相連的氨基酸的聚合分子。在用于本說明書時，肽通常指親本蛋白質(zhì)或多肽的亞基，諸如通過酶的蛋白水解切割或者使用化學(xué)或物理手段生成的片段。肽和多肽可以是天然存在(如蛋白質(zhì)或其片段)的或合成的。多肽還可以包括天然存在的氨基酸與非天然存在的氨基酸的組合。肽和多肽可以衍生自任何來源，諸如動物(如人)、植物、真菌、細(xì)菌、和/或病毒，而且可以得自細(xì)胞樣品、組織樣品、器官、體液、或環(huán)境樣品，諸如土壤、水、和空氣樣品。多肽可以是膜結(jié)合的(即跨越脂雙層或吸附于脂雙層表面)。膜結(jié)合多肽可以結(jié)合例如質(zhì)膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞器膜、和病毒衣殼。多肽可以是細(xì)胞質(zhì)的或細(xì)胞器的。多肽可以是細(xì)胞外的，存在于細(xì)胞間隙或體液(如血漿、和脊髓液)中。多肽可以是生物學(xué)催化劑、多種分子的轉(zhuǎn)運蛋白或載體、細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信號的受體、激素、以及細(xì)胞、組織和器官的結(jié)構(gòu)元件。一些多肽是腫瘤標(biāo)記。在用于本說明書時，蛋白質(zhì)即多肽。
需要指出的是，在質(zhì)譜領(lǐng)域中針對離子的“質(zhì)量”常常使用縮略方式，盡管更準(zhǔn)確的說是離子的質(zhì)荷比，這才是真正測量的。出于方便，本說明書采用了此常用實踐，并且頻繁使用術(shù)語“質(zhì)量”來指質(zhì)荷比或由所述質(zhì)荷比數(shù)學(xué)衍生的量。
圖2例示了依照本發(fā)明的一個方面用于定量肽混合物中的肽的系統(tǒng)200的一種執(zhí)行。系統(tǒng)200包括常規(guī)構(gòu)造的一般用途可編程數(shù)字電腦系統(tǒng)210，它可以包括存儲器和運行分析程序220的一個或多個處理器。電腦系統(tǒng)210連通質(zhì)譜數(shù)據(jù)來源230，它可以是質(zhì)譜儀，諸如LC-MS/MS質(zhì)譜儀。或者/另外，可以由可與電腦系統(tǒng)210連通的數(shù)據(jù)庫取出質(zhì)譜數(shù)據(jù)。電腦系統(tǒng)210還偶聯(lián)序列信息來源240，諸如氨基酸或核苷酸序列信息的公開數(shù)據(jù)庫。系統(tǒng)200還可以包括輸入設(shè)備諸如鍵盤和/或鼠標(biāo)，和輸出設(shè)備諸如顯示器，以及常規(guī)的通訊硬件和軟件，由此電腦系統(tǒng)210可以連接其它電腦系統(tǒng)(或質(zhì)量分析儀230和/或數(shù)據(jù)庫240)，諸如通過網(wǎng)絡(luò)。
圖3更詳細(xì)的例示了依照本發(fā)明一個方面的方法300的一種執(zhí)行。消化將相對于參照樣品進(jìn)行定量的一種或多種蛋白質(zhì)的實驗樣品，以生成肽混合物(步驟310)。樣品可以是例如凝膠電泳斑點中所包含的只含一種或兩種蛋白質(zhì)的簡單混合物；或者，樣品可以是更復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物-例如人血漿中所包含的蛋白質(zhì)樣品。樣品可以衍生自任何來源，諸如動物(如人)、植物、真菌、細(xì)菌、和/或病毒，而且可以得自細(xì)胞樣品、組織樣品、體液、或環(huán)境樣品，諸如土壤、水、和空氣樣品。實驗樣品中的一種或多種蛋白質(zhì)的量、常常還有身份通常是未知的?？梢允褂靡阎夹g(shù)利用多種蛋白水解酶中的任何種類或者使用已知化學(xué)或物理手段消化樣品，包括添加的任何內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。
分離肽混合物(步驟320)?？梢酝ㄟ^多種已知分離方法分離混合物，包括但不限于液相層析、氣相層析、電泳、和毛細(xì)管電泳，它們可以單獨或聯(lián)合使用。可以根據(jù)具體實驗和期望的分離選擇分離的具體條件，包括例如介質(zhì)和柱的類型、溶劑和流速。在一個實施方案中，使用反相毛細(xì)管柱經(jīng)一維液相層析分離肽混合物。如果需要更復(fù)雜的分離，那么可以采用額外維數(shù)的液相層析，諸如二維液相層析，其中包括在強(qiáng)陽離子交換柱上進(jìn)行的初步分離以及隨后的反相毛細(xì)管柱層析。在一些情況中，可以進(jìn)行分離從而由肽混合物分離出一種或多種個別肽，但這并不是必須的。然而，在使用本文所述技術(shù)時，甚至肽的部分分離可能就足以進(jìn)行定量，因為分離過程中兩種或多種肽的共洗脫應(yīng)當(dāng)不會干擾后續(xù)定量。這可能是相對于其它技術(shù)而言的重要優(yōu)點，后者諸如使用UV檢測的層析分離，它需要完全的峰分離以進(jìn)行定量。一般而言，分離越好產(chǎn)生的最終結(jié)果將越好(即更好的相對定量信息)。
對分離肽進(jìn)行質(zhì)量分析(步驟330)?？梢允褂镁哂心軌蚵?lián)合液相層析運行的MS和/或MS/MS能力以記錄MS和MS/MS數(shù)據(jù)的任何質(zhì)譜儀對分離肽進(jìn)行質(zhì)量分析。在特定執(zhí)行中，質(zhì)譜儀可以是離子捕獲質(zhì)譜儀、三聯(lián)式四極質(zhì)譜儀、q-TOF質(zhì)譜儀、捕獲-TOP質(zhì)譜儀、FT-ICR質(zhì)譜儀、PSD TOF質(zhì)譜儀、TOF-TOF質(zhì)譜儀、或環(huán)狀捕獲(orbitrap)質(zhì)譜儀。對步驟320中分離的每一種肽或肽組合(如液相層析中的每一個峰)獲得完全掃描質(zhì)譜。然后對完全掃描質(zhì)譜中的一種或多種離子獲得MS/MS譜。
根據(jù)對肽生成的串聯(lián)質(zhì)譜鑒定一種或多種分離肽及其對應(yīng)的蛋白質(zhì)(步驟340)?？梢酝ㄟ^將實驗性的串聯(lián)質(zhì)譜與由數(shù)據(jù)庫(諸如核苷酸或氨基酸序列的公開數(shù)據(jù)庫)的序列信息衍生的理論片段化模式相聯(lián)系來鑒定肽及其對應(yīng)的蛋白質(zhì)。例如，可以使用商品化數(shù)據(jù)庫搜索引擎軟件(諸如可以由加利福尼亞州圣何塞市Thermo Finnigan獲得的TorboSEQUEST蛋白質(zhì)鑒定軟件)比較針對肽獲得的串聯(lián)質(zhì)譜與針對序列信息數(shù)據(jù)庫(諸如國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)、GenBank/GenPept、PIR、SWISS-PROT和PDB數(shù)據(jù)庫)中蛋白質(zhì)(及其片段)鑒定的理論質(zhì)譜，從而鑒定肽和蛋白質(zhì)。也可以使用其它數(shù)據(jù)庫搜索引擎，諸如Mascot、ProFound、SpectrumMill、RADARS、Sonar軟件等?？梢允褂盟阉饕娴臄M合密切程度或關(guān)聯(lián)評分結(jié)果來鑒定肽和蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一個方面，采用傅立葉變換和質(zhì)量指紋圖譜技術(shù)由完全質(zhì)譜鑒定一種或多種分離肽及其對應(yīng)的蛋白質(zhì)。然后將經(jīng)鑒定的所述一種或多種質(zhì)量與公開數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)相匹配。
或者，可以使用從頭測序技術(shù)對分離肽中的肽進(jìn)行部分或完全測序，隨后在公開數(shù)據(jù)庫中定位由此生成的序列，從而鑒定肽和蛋白質(zhì)。
然后將步驟330中獲得的質(zhì)譜用于計算經(jīng)鑒定肽離子的豐度(步驟350)。可以根據(jù)在肽的質(zhì)譜中測量得出的離子強(qiáng)度重建相應(yīng)的經(jīng)鑒定肽離子的層析圖，從而由每一種經(jīng)鑒定肽的峰面積計算離子豐度?？梢杂赏耆|(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜測定峰面積。任選的是，可以將重建層析圖和/或計算得出的峰面積圖示給用戶。
在一種執(zhí)行中，只根據(jù)與鑒定時間緊密相鄰的層析峰計算指定肽離子的豐度，以避免由并非特定蛋白質(zhì)蛋白水解產(chǎn)物的種類生成的但具有相似m/z值的假峰。由此，例如，只能使用鑒定時間的預(yù)定閾值距離(即時間)內(nèi)的峰?？梢愿鶕?jù)肽在特定層析圖區(qū)域的典型洗脫時間來確定閾值，這取決于例如所采用的流速、分離技術(shù)、柱和分離介質(zhì)，而且范圍可以是由幾秒鐘到幾分鐘。消除假峰能夠顯著改進(jìn)峰面積測量的精度。在一種執(zhí)行中，可以使用商品化軟件諸如可以由加利福尼亞州圣何塞市Thermo Finnigan獲得的Xcalibur軟件來計算經(jīng)鑒定肽離子的峰面積?；蛘撸梢愿鶕?jù)峰高而非峰面積來計算離子豐度。
將指定蛋白質(zhì)的所有經(jīng)鑒定肽的峰面積加到一起以確定該蛋白質(zhì)的重建峰面積(步驟360)?；蛘?，可以將每一種經(jīng)鑒定肽或多肽的峰面積直接與參照樣品進(jìn)行比較。
通過計算實驗樣品與參照樣品中的肽或蛋白質(zhì)的峰面積的比率來確定實驗樣品中的指定蛋白質(zhì)的相對量(步驟370)。參照樣品可以是由蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)混合物衍生的肽混合物。在一些執(zhí)行中，預(yù)計參照樣品包含具有期望獲得定量信息的蛋白質(zhì)。例如，參照樣品可以是由已知來源(如健康受試者)采集的肽混合物(如細(xì)胞樣品、組織樣品、體液、等)，而實驗樣品可以是由未知來源(如患病受試者)采集的相似混合物。在一種執(zhí)行中，實驗樣品與參照樣品基本相似，例如來自健康的活著的受試者的血漿樣品與來自患病受試者的血漿樣品，預(yù)計它們只因少數(shù)蛋白質(zhì)而不同?？梢杂膳c圖3所示和上文所述相似的順序衍生參照樣品的峰面積-即消化參照樣品，分離蛋白質(zhì)消化物，質(zhì)量分析，肽鑒定，和層析圖重建，以確定參照樣品的肽和蛋白質(zhì)的峰面積方法300可以重復(fù)多次(N)以提供多份樣品的相對量，而所使用的參照少于N份。由此，例如，可以對在多種條件下采集的蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行本文所述技術(shù)，以測定蛋白質(zhì)在那些條件下的相對量。
相同樣品中肽的峰面積在不同運行之間可能不同。這些差異可能是由多種實驗依賴性參數(shù)引起的，諸如樣品制備的差異(取樣誤差、不完全消化)或不精確的樣品注入。盡管這些實驗依賴性參數(shù)在任何指定實驗中都是未知的，然而預(yù)計它們在一次運行中以相同方式影響所有蛋白質(zhì)。由此可以對針對混合物中的每一種蛋白質(zhì)計算得出的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以校準(zhǔn)這些系統(tǒng)誤差。
在一些執(zhí)行中，可以將所有峰面積相對于已知蛋白質(zhì)的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。樣品可以包含內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)可以是并非樣品中天然存在的而是添加到樣品中擔(dān)當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)化參照物的一種或多種蛋白質(zhì)-例如以已知量添加到樣品中的非天然蛋白質(zhì)?；蛘?，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)可以包括持家蛋白-即在樣品來源的介質(zhì)中通常以相對恒定的濃度存在的蛋白質(zhì)。在這些情況中，可以將每一種蛋白質(zhì)的峰面積相對于內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化?；蛘撸梢詫⒚恳环N蛋白質(zhì)的峰面積相對于混合物中的所有經(jīng)鑒定蛋白質(zhì)的總峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。為了比較只有少數(shù)蛋白質(zhì)濃度不同的相似樣品，諸如經(jīng)過不同藥物處理的細(xì)胞培養(yǎng)物，可以將峰面積或比率針對明顯趨勢進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。例如，如果特定實驗中蛋白質(zhì)的預(yù)期峰面積與計算峰面積之間的差異有可能是由于樣品制備差異引起的，并且預(yù)計以相同方式影響一次運行中的所有蛋白質(zhì)，那么可以根據(jù)在兩次或多次實驗中(或者在實驗樣品與參照樣品之間)保持恒定的所有蛋白質(zhì)的平均峰面積比率對峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化?？梢酝ㄟ^計算峰面積比率的標(biāo)準(zhǔn)偏差(如中值標(biāo)準(zhǔn)偏差(median standarddeviation))，排除比率處于中值標(biāo)準(zhǔn)偏差以外的所有蛋白質(zhì)，并再次計算其余蛋白質(zhì)的比率的平均值(如中值)，來排除在不同實驗中以不同量存在的蛋白質(zhì)(如需要相對定量信息的蛋白質(zhì))。在一種執(zhí)行中，計算峰面積比率的對數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。在另一種執(zhí)行中，使用比率的中值，因為它更不易受例外的影響，而且預(yù)計是廣泛應(yīng)用領(lǐng)域的最佳方法。也可以使用對峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的其它已知方法。整個流程可以重復(fù)一次或多次以提高相對定量測量的精度。
在本發(fā)明的另一個方面，實驗樣品中的肽的相對定量可以提供實質(zhì)性的絕對差異信息，因為肽的峰面積與其濃度之間存在線性關(guān)系。這將更詳細(xì)的描述于實施例3、表4和圖11。
可以在數(shù)字電子線路中或者在電腦硬件、固件、軟件中或其聯(lián)合中執(zhí)行本發(fā)明的各個方面。可以作為電腦程序來執(zhí)行本發(fā)明的一些或所有方面，即確實錄入信息載體(如機(jī)器可讀存儲設(shè)備或傳播信號)的電腦程序，它由數(shù)據(jù)處理設(shè)備(如可編程處理器、電腦、或多部電腦)運行或控制數(shù)據(jù)處理設(shè)備的運轉(zhuǎn)。電腦程序可以書寫成任何形式的編程語言，包括編譯或解釋語言，而且它可以采用任何形式，包括獨立程序或者模塊、組件、子程序、或適用于計算環(huán)境的其它單元?？梢圆捎秒娔X程序而在一部電腦上或者在一處場所或遍布多處場所且通過通訊網(wǎng)絡(luò)互相連接的多部電腦上執(zhí)行。
可以由執(zhí)行電腦程序的一個或多個可編程處理器來執(zhí)行本發(fā)明的一些或所有方法步驟，從而通過操作輸入數(shù)據(jù)和生成輸出結(jié)果而執(zhí)行本發(fā)明的功能。還可以通過特殊用途邏輯線路如FPGA(現(xiàn)場可編程門陣列)或ASIC(應(yīng)用特異集成線路)來執(zhí)行本發(fā)明的方法步驟和本發(fā)明的儀器?？梢宰鳛殡娔X控制的自動執(zhí)行步驟與用戶諸如科學(xué)家操作的手工執(zhí)行步驟的聯(lián)合來執(zhí)行本發(fā)明的方法。
適用于執(zhí)行電腦程序的處理器包括例如一般和特殊用途的微處理器，以及任何種類的數(shù)字電腦的任何一種或多種處理器。一般而言，處理器將由只讀存儲器或隨機(jī)存取存儲器或二者接收指示和數(shù)據(jù)。電腦的必需元件是用于執(zhí)行指令的處理器和用于存儲指令和數(shù)據(jù)的一個或多個存儲設(shè)備。一般而言，電腦還將包括或操作性地偶聯(lián)用于存儲數(shù)據(jù)的一個或多個海量存儲設(shè)備(如磁性、磁-光盤、或光盤)以接收或轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)或二者兼之。適用于收錄電腦程序指令和數(shù)據(jù)的信息載體包括所有形式的永久存儲器，包括例如半導(dǎo)體存儲設(shè)備，如EPROM、EEPROM、和閃存設(shè)備；磁盤，如內(nèi)部硬盤或可移動盤；磁光盤；以及CD-ROM和DVD-ROM盤?？梢栽谔厥庥猛具壿嬀€路中補(bǔ)充或摻入處理器和存儲器。
為了提供與用戶的交互作用，可以在具有顯示設(shè)備與鍵盤和定點設(shè)備的電腦上執(zhí)行本發(fā)明，顯示設(shè)備用于向用戶顯示信息，如CRT(陰極射線管)或LCD(液晶顯示)顯示器，通過定點設(shè)備用戶可以向電腦提供輸入，如鼠標(biāo)或軌跡球。其它種類的設(shè)備同樣可用于提供與用戶的交互作用。
下文實施例將進(jìn)一步描述本發(fā)明，但只是例示性的，而且并非意欲限制權(quán)利要求中描述的發(fā)明范圍。
實施例實施例1將公開的方法用于五種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的混合物-牛清蛋白、馬血紅蛋白、馬鐵蛋白、馬細(xì)胞色素、和馬肌紅蛋白。前四種蛋白質(zhì)維持恒定濃度(200fmol)，而第五種蛋白質(zhì)(肌紅蛋白)的濃度則大幅變化。將蛋白質(zhì)消化物的峰面積相對于清蛋白消化物的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。整個流程重復(fù)三次。三次測量后RSD為20％，對四種恒定濃度蛋白質(zhì)消化物計算得出的峰面積是恒定的。第五種蛋白質(zhì)(肌紅蛋白)的相對峰面積隨著濃度由10fmol升高至1000fmol顯示線性增大。
樣品制備五種蛋白質(zhì)以凍干粉的形式購自Sigma公司(圣路易，密蘇里州)牛清蛋白，A-7638；馬血紅蛋白，H-4632；馬鐵蛋白，A-3641；馬肌紅蛋白，M-0630；馬細(xì)胞色素C，C-7752。溶劑和試劑購自以下不同供應(yīng)商乙腈，目錄編號015-1，Burdick & Jackson，馬斯基根，密歇根州；水，目錄編號4218-02，JT Backer，菲利浦斯勃格，新澤西州；甲酸，目錄編號11670，EM Science，Gibbstown，新澤西州；碳酸氫銨，目錄編號A-6141，Sigma；測序級經(jīng)修飾胰蛋白酶，目錄編號V5113，Promega，麥迪遜，威斯康星州；碘乙酸，目錄編號35603和二硫蘇糖醇(DTT)，目錄編號20290，均購自Pierce，羅克福德，伊利諾斯州。
如下制備蛋白質(zhì)消化物的貯液。將每一種蛋白質(zhì)溶于100mM碳酸氫銨緩沖液，并添加DTT進(jìn)行還原。在用胰蛋白酶消化之前先用碘乙酸將半胱氨酸殘基羧甲基化。烷基化步驟使半胱氨酸的分子量增加了58Da。將五種蛋白質(zhì)消化物的貯液進(jìn)一步稀釋并混合在一起以制備肌紅蛋白稀釋系列，包括8種混合物。這些混合物的4μl注入等分試樣分別包含1、5、10、50、100、200、500、和1000fmol肌紅蛋白。每一種注入混合物中都存在200fmol清蛋白、血紅蛋白、鐵蛋白、和細(xì)胞色素C。將五種蛋白質(zhì)的相同貯液用于制備細(xì)胞色素C稀釋系列，包括8種混合物。在此系列中，每一種混合物中的細(xì)胞色素C的注入量是不同的，分別為1、5、10、50、100、200、500、和1000fmol。在此系列中，清蛋白、血紅蛋白、鐵蛋白、和肌紅蛋白的濃度是恒定的，而且這些蛋白質(zhì)每一種的注入量都是200fmol。
LC/MS/MSSurveyor HPLC系統(tǒng)(Thermo Finnigan公司，圣何塞，加利福尼亞州)包括自動取樣器和高壓泵。將肌紅蛋白稀釋系列的8個4μl等分試樣和細(xì)胞色素C稀釋系列的8個4μl等分試樣置于以聚酯密封帶(目錄號236366，Nalge Nunc，內(nèi)珀維爾，伊利諾斯州)覆蓋的錐形底96孔板(目錄號249946，Nalge Nunc)的孔中，然后插入維持于4℃的自動取樣器中。依照以下流程在一天內(nèi)分析所有16份樣品。在連續(xù)三天內(nèi)重復(fù)分析同一系列，因此來自各個稀釋系列的每一種蛋白質(zhì)混合物都分析了三次。將樣品的4μl等分試樣由孔底吸入自動取樣器針頭，并注入20μl樣品環(huán)中。剩余環(huán)注滿甲酸在水中的0.1％溶液(“溶劑A”)。在自動取樣器針頭中和在樣品環(huán)中，將樣品的4μl等分試樣夾在兩個1μl氣泡之間。這種所謂的“無浪費注射”路徑能夠完全注入小量樣品。注入后，關(guān)閉自動取樣器的閥，并將來自環(huán)的樣品直接加載到75μm ID×10cm毛細(xì)管HPLC柱上，它具有15μm電噴射尖端，裝填BioBasic C18固定相，5μm顆粒，300A孔徑(New Objective公司，劍橋，馬薩諸塞州)。給毛細(xì)管柱加載2μl/min的溶劑A等度液流。為了梯度洗脫，將來自泵的50μl/min液流分流成流經(jīng)柱的0.1μl/min液流。用0.1％甲酸在乙腈中的0-60％線性梯度(“溶劑B”)由柱洗脫肽。使用配備了納米級電子噴射離子源的LCQ DECA離子捕獲質(zhì)譜儀(都購自Thermo Finnigan，圣何塞，加利福尼亞州)分析洗脫的肽。質(zhì)譜儀以數(shù)據(jù)依賴性LC/MS/MS模式操作，其中前體離子選自先前的完全掃描質(zhì)譜。對選定離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，并將其m/z值在1分鐘里動態(tài)排除進(jìn)一步片段化。這種自動化分析特點能夠在對復(fù)雜混合物的LC/MS/MS分析過程中進(jìn)行多種肽的洗脫(常常是共洗脫)。
使用TurboSequest軟件對串聯(lián)質(zhì)譜與由國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)頁http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Database/index.html下載的包含馬和牛蛋白質(zhì)的4400種序列的數(shù)據(jù)庫的相關(guān)性進(jìn)行分析。使用通過TurboSequest算法得出的三種相關(guān)系數(shù)的統(tǒng)一評分(評分＝(10000×DelCn2)+Sp)×Xcorr)進(jìn)一步總結(jié)來自相關(guān)性分析的輸出文件，產(chǎn)生經(jīng)鑒定肽和相應(yīng)蛋白質(zhì)的列表。
五種蛋白質(zhì)消化物的混合物的典型離子層析圖400顯示于圖4。在此混合物中，所有蛋白質(zhì)以200fmol水平存在。在LC/MS/MS分析過程中，洗脫肽的完全掃描質(zhì)譜之后繼以串聯(lián)質(zhì)譜，在層析圖上產(chǎn)生一系列波峰，其中完全掃描質(zhì)譜與峰高度有關(guān)。在分離了單一前體峰并獲得了MS/MS時，離子電流下降，在兩個波峰之間產(chǎn)生波谷。為了定量測定峰面積，使用來自完全掃描質(zhì)譜的前體離子強(qiáng)度-即如圖4中所示，經(jīng)過波峰頂端畫一條平滑線使離子層析圖上的峰平滑。所有經(jīng)鑒定的消化產(chǎn)物都是在7分鐘間隔中洗脫的。在這段時間里獲得了大約300份光譜(即每份譜1.4秒鐘)，一半是MS，另一半是MS/MS。圖4還顯示了在第33.50分鐘洗脫的消化產(chǎn)物的完全掃描MS譜410，以及m/z 585.1的前體離子的MS/MS譜420。后一份質(zhì)譜中占優(yōu)勢的是b和y型片段，這是離子捕獲中碰撞誘導(dǎo)解離的典型模式。使用TurboSequest軟件將m/z 585.1的峰鑒定為細(xì)胞色素C肽TGPNLHGLFGR(SEQ ID NO25)2+離子。選擇m/z 1168.6的峰用于下一個MS/MS掃描中進(jìn)行片段化，并鑒定為相同肽的單電荷離子，從而確認(rèn)了鑒定結(jié)果。
圖5A顯示了使用TurboSequest軟件自動進(jìn)行的典型片段化質(zhì)譜及其解釋的實例。該軟件將實驗性片段化質(zhì)譜與來自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的所有肽的理論片段化模式相關(guān)聯(lián)，并報告掃描數(shù)目、電荷狀態(tài)、(M+H)值、由TurboSequest產(chǎn)生的三個主要相關(guān)系數(shù)(即Xcorr、DeltaCn、Sp)、蛋白質(zhì)名稱、經(jīng)鑒定的序列、和數(shù)個其它參數(shù)(圖5B)。利用這些參數(shù)由假鑒定中過濾出真鑒定。
圖4中整個洗脫系列(包括等摩爾混合物)的LC/MS/MS分析重復(fù)三次?？偣?4種肽鑒定為五種蛋白質(zhì)的混合物的消化產(chǎn)物，包括16種來自清蛋白的肽、7種來自血紅蛋白的肽、1種來自鐵蛋白的肽、3種來自細(xì)胞色素C的肽、和5種肌紅蛋白肽。這些肽中的許多種種表現(xiàn)為兩種或多種電荷形式。在假定它可能是由帶1個、2個、或3個電荷的前體離子產(chǎn)生的前提下，將每一份獲得的串聯(lián)質(zhì)譜與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析三次。將細(xì)胞色素C肽TGPNLHGLFGR(SEQ ID NO25)的兩種電荷形式在該肽的洗脫過程中進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，以增加TurboSequest鑒定的額外置信度。總共61種離子鑒定為五種蛋白質(zhì)的混合物的消化產(chǎn)物，或者說每一種肽大約兩種離子形式。表1列出了經(jīng)鑒定肽的序列、它們的電荷狀態(tài)和m/z值、每一份MS/MS譜與由數(shù)據(jù)庫衍生的理論片段化模式之間的交叉相關(guān)系數(shù)、以及經(jīng)鑒定肽的名稱及其在NCBI數(shù)據(jù)庫中的gi編號。所有五種蛋白質(zhì)在三個不同的日子里都得到了明確的鑒定。只有那些鑒定超過一次的肽包括在表1中。
表1


使用Xcalibur軟件，應(yīng)用來自相應(yīng)完全掃描質(zhì)譜的離子強(qiáng)度重建每一種經(jīng)鑒定離子的層析峰面積。圖6是細(xì)胞色素C肽TGPNLHGLFGR(SEQ ID NO25)2+離子的這種重建離子層析圖的實例。此重建離子層析圖是只使用m/z 585.1±0.5的質(zhì)譜峰強(qiáng)度進(jìn)行作圖得到的。自動計算得出的峰面積值(AA值)顯示于圖6，其中峰面積以任意單位的離子強(qiáng)度乘以秒來報告。
盡管真正的細(xì)胞色素C肽在第33.50分鐘以0.2分鐘峰寬洗脫，然而層析圖還顯示在第31.66分鐘的另一未鑒定峰。此假峰在重建離子層析圖上出現(xiàn)，因為它的m/z值585.4接近(在±0.5Da以內(nèi))細(xì)胞色素C的經(jīng)鑒定離子的m/z值。如下將此假峰排除在考慮之外。平均而言，層析峰在我們的30分鐘0-60％梯度B的基部的寬度為0.2分鐘(圖6)。因此，只考慮在重建離子層析圖上位于它們鑒定時間±0.2分鐘以內(nèi)的峰。這能夠排除由并非經(jīng)鑒定的胰蛋白酶消化產(chǎn)物的種類生成的但具有相似m/z值的假峰。相同規(guī)則可用于其它經(jīng)鑒定離子。這能夠顯著改進(jìn)峰面積測量的精度。
圖7例示了m/z 748.6(1+)的肌紅蛋白肽ALELFR(SEQ ID NO31)(表1中的標(biāo)號31)和m/z 474.7(3+)、711.0(2+)、和1420.5(1+)的清蛋白肽SLHTLFGDELCK(SEQ ID NO15)(表1中的標(biāo)號15)的離子的八份重建層析圖。這兩個峰均在洗脫時只重建第34分鐘洗脫時間附近1分鐘的小部分層析圖。清蛋白濃度在所有八份層析圖中都是200fmol，而肌紅蛋白濃度則由1fmol至100fmol變化，如圖所示。觀察到肌紅蛋白肽的重建層析峰面積隨著肌紅蛋白濃度漸增而線性增大，相對對清蛋白肽保持恒定濃度。盡管將重建層析圖例示于圖7，然而不需要真實展示重建層析圖和/或計算的峰面積。
圖8例示了與恒定量(200fmol)的清蛋白、血紅蛋白、鐵蛋白、和細(xì)胞色素C混合的肌紅蛋白消化物(數(shù)量為1、5、10、50、100、200、500、和1000fmol)的校準(zhǔn)曲線。y軸是相對于每一份LC/MS/MS數(shù)據(jù)文件中的清蛋白峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并將不同日子里的三次測量進(jìn)行平均的每一種蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)消化物峰面積。誤差條顯示了不同日子里的三個測量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(一個∑)。1fmol和5fmol肌紅蛋白的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值是60％以上，指示這些測量處于噪音水平。10fmol的RSD是36％，然后在稀釋系列的較高濃度跌至15％以下，使得圖上大多數(shù)數(shù)據(jù)點的RSD值低于20％。肌紅蛋白(未顯示)線性走勢線的R2＝0.9895值指示肌紅蛋白消化物的相對峰面積在量由10fmol增至1000fmol時線性增大。對于混合物中以恒定水平存在的蛋白質(zhì)消化物，在每一天里還測量了8次注入的可重復(fù)性，顯示優(yōu)于20％RSD。
對五種蛋白質(zhì)的混合物重復(fù)同組24份LC/MS/MS分析和計算，其中改變細(xì)胞色素C的量(1、5、10、50、100、200、500、和1000fmol)，并保持清蛋白、血紅蛋白、鐵蛋白、和肌紅蛋白消化物恒定(200fmol)。在不同的日子里將8份LC/MS/MS分析系列重復(fù)三次。圖9給出了細(xì)胞色素C的校準(zhǔn)曲線。在圖9中，每一個數(shù)據(jù)點是三次測量的平均值。在肌紅蛋白系列中，1fmol和5fmol細(xì)胞色素C數(shù)據(jù)點的RSD很高，指示這些濃度的測量不可重復(fù)。10fmol數(shù)據(jù)點具有33％的RSD，此后可重復(fù)性提高至RSD低于20％。R2＝0.994是細(xì)胞色素C(未顯示)校準(zhǔn)曲線的線性走勢線的參數(shù)值。
實施例2將凍干的蛋白質(zhì)樣品(1mg人血清和1mg馬肌紅蛋白，Sigma-Aldrich，圣路易斯，密蘇里州，美國)在1ml碳酸氫銨緩沖液(100mM pH8.5)和3μl DTT(1M，Sigma-Aldrich，圣路易斯，密蘇里州，美國)中重溶。將混合物于37℃保溫30分鐘。為了烷化蛋白質(zhì)，添加7μl碘乙酸(1M，溶于1M KOH，Sigma-Aldrich，圣路易斯，密蘇里州，美國)，并將混合物在黑暗中于室溫繼續(xù)保溫30分鐘。添加13μl DTT(1M)以淬滅碘乙酸。添加20μl胰蛋白酶(0.5mg/ml，Promega，麥迪遜，威斯康星州，美國)以消化還原且烷化的蛋白質(zhì)。將混合物于37℃保溫6小時，然后補(bǔ)加20μl胰蛋白酶(0.5mg/ml)，并于37℃繼續(xù)保溫16小時。
將樣品消化物的等分試樣(如下文所示)置于96孔板的孔中。將板用塑料膜密封以減少蒸發(fā)，并置于Surveyor自動取樣器中，在此維持于4℃并等待分析。Surveyor自動取樣器具備不浪費的注入能力，使得注射體積可以低至1μl。首先以10μl/min的較高流速用3分鐘時間將注入肽加載到小型反相肽捕獲器聚(苯乙烯-二乙烯基苯)(Michrom Bioresources)上。分流后，由捕獲器洗脫肽，隨后在反相毛細(xì)管柱(Picofrit；5μm BioBasic C18，300A孔徑；75μm×10cm；尖端15μm，New Objective)上用30分鐘乙腈在0.1％含水甲酸中的0-60％線性梯度進(jìn)行分離，流速為0.1μl/min。將Surveyor HPLC系統(tǒng)直接偶聯(lián)Thermo Finnigan LCQ Deca XP離子捕獲質(zhì)譜儀，它配備了納米級LC電子噴射離子化源。噴射電壓是2.0kV，毛細(xì)管溫度是150℃，并通過35個單位的碰撞能獲得了離子捕獲碰撞片段化譜。每一個完整質(zhì)譜之后是三個最強(qiáng)峰的三個MS/MS光譜。啟動動態(tài)排除。每份樣品之后注入10μ1 0.1％含水甲酸進(jìn)行分析以確保系統(tǒng)的正確平衡。
使用電腦程序Sequest自動鑒定肽和蛋白質(zhì)，它將實驗性的串聯(lián)質(zhì)譜與根據(jù)氨基酸序列由國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)序列數(shù)據(jù)庫獲得的理論串聯(lián)質(zhì)譜相關(guān)聯(lián)。通過聯(lián)合由Sequest產(chǎn)生的所有三項相關(guān)系數(shù)的統(tǒng)一評分進(jìn)一步評估肽鑒定。根據(jù)下面的公式計算評分評分＝(10000×DelCn2)+Sp)×Xcorr。對于蛋白質(zhì)，將每一種肽的評分加在一起，并通過將總評分除以肽的數(shù)目來計算標(biāo)準(zhǔn)化評分。只接受評分超過2000的肽。使用Xcalibur軟件中的Genesis算法來檢測峰和計算峰面積。
為了進(jìn)一步評估用于復(fù)雜混合物的蛋白質(zhì)剖析的定量方法，將人血清(大約1μg總蛋白質(zhì))與不同量的馬肌紅蛋白(250fmol和500fmol)混合，并分析這兩種混合物。將胰蛋白酶消化肽在C18柱上用30分鐘的0-60％乙腈梯度進(jìn)行分離。層析圖顯示于圖10。使用來自MS/MS譜和自動化搜索程序Sequest的片段化信息鑒定肽和蛋白質(zhì)。所有的經(jīng)鑒定蛋白質(zhì)概述于表2。在兩種樣品中能夠鑒定與20種不同蛋白質(zhì)對應(yīng)的總共56種肽。在兩種樣品中鑒定了相同的蛋白質(zhì)，肽的覆蓋范圍只有微弱差異(數(shù)據(jù)未顯示)?？紤]到蛋白質(zhì)注入量和用于肽分離梯度，在這項研究中鑒定到的肽以及相應(yīng)地蛋白質(zhì)的數(shù)目很少也就不令人驚訝的。這項研究的焦點不是鑒定樣品中最大數(shù)目的肽，而是確保在一小段時間里洗脫所有的肽。在使用長達(dá)8小時的較長梯度且使用更多材料的類似實驗中，可以鑒定超過300種蛋白質(zhì)。
對于定量分析，由包括5種來自人血清的蛋白質(zhì)(血清清蛋白、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、Igγ4鏈C區(qū)和脫輔基脂蛋白A-1)和馬肌紅蛋白在內(nèi)的這6種不同蛋白質(zhì)選擇總共16種肽。超過一種肽得到鑒定的所有蛋白質(zhì)都包括在定量分析中。如上所述計算這些肽的峰面積，并比較兩種樣品。兩種樣品之間的唯一差異是馬肌紅蛋白的濃度。理論上，人蛋白質(zhì)的峰面積應(yīng)當(dāng)是恒定的，而且只有馬肌紅蛋白的峰面積應(yīng)當(dāng)是變化的。
這次實驗的結(jié)果概述于表3中。樣品1(250fmol肌紅蛋白)與樣品2(500fmol肌紅蛋白)的比較顯示樣品2的人肽峰面積都大致相同或較小(比率由1.04至0.69)，而肌紅蛋白肽都較高(比率由1.27至2.29)。將峰面積的比率相對于實驗依賴性校準(zhǔn)系數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。此校準(zhǔn)系數(shù)是如下計算的，排除在中值(0.92)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(0.42)以外的所有比率。計算剩余比率的平均值為0.87，并將所有峰面積比率相對于此系數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。人蛋白質(zhì)濃度是恒定的，因此峰面積應(yīng)當(dāng)具有比率1。血清清蛋白經(jīng)計算具有比率0.91，血清轉(zhuǎn)鐵蛋白經(jīng)計算是1.05，抗胰蛋白酶經(jīng)計算是0.84，Igγ4鏈C區(qū)經(jīng)計算是0.95，而脫輔基脂蛋白A-1經(jīng)計算是1.10。第二份樣品中的肌紅蛋白濃度是第一份樣品中肌紅蛋白濃度的兩倍，因此峰面積比率應(yīng)當(dāng)是2。事實上，馬肌紅蛋白的峰面積經(jīng)計算是1.91。峰面積的計算比率與峰面積的預(yù)期比率處于計算蛋白質(zhì)的16％以內(nèi)。這些結(jié)果確認(rèn)了肽的峰面積可用于定量評估復(fù)雜混合物中的蛋白質(zhì)。這種方法可用于檢測不同樣品之間蛋白質(zhì)濃度的微小變化，并給出關(guān)于變化發(fā)生的比率的信息。
表2

表3

實施例3通過LC/MS/MS分析11份包含不同量(范圍由10fmol至100pmol)的肌紅蛋白消化物的等分試樣，并計算五種選定肽的峰面積。實驗重復(fù)三次以確?？芍貜?fù)性。峰面積隨著注入肽濃度的升高而增大。在這個實驗中，對峰檢測的下限是10fmol，上限是100pmol。合并所有五種肌紅蛋白肽的峰面積，并針對肌紅蛋白的量作圖。由10fmol至100pmol，峰面積與肌紅蛋白濃度線性相關(guān)(r2＝0.991)，而且結(jié)果可重復(fù)。關(guān)于結(jié)果的概述顯示于表4和圖11。應(yīng)當(dāng)注意數(shù)值為0的峰面積(見表4)不能在對數(shù)刻度上顯示，但是包括在線性回歸中。
表4馬肌紅蛋白經(jīng)過胰蛋白酶消化后的肌紅蛋白蛋白水解片段的ESI-MS分析

上文就具體實施方案描述了本發(fā)明。其它實施方案屬于下文權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。例如，可以以不同順序執(zhí)行本發(fā)明的步驟，和/或進(jìn)行聯(lián)合，仍然實現(xiàn)期望結(jié)果。
另外，上文就與肽、多肽和蛋白質(zhì)有關(guān)的實施方案描述了本發(fā)明，它們可以是天然存在的、合成的或其它方式生成的。顯然，本文所述技術(shù)還可應(yīng)用于其它物質(zhì)，例如脂肪酸、DNA、RNA、寡核苷酸、有機(jī)或無機(jī)分子等。
序列表<110>Thermo Finnigan Corporation<120>生物學(xué)分子的定量<130>12671-007WO1<150>US 60/373,007<151>2002-04-15<160>47<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>9<212>PRT<213>Bos taurus<400>1Ala Leu Lys Ala Trp Ser Val Ala Arg1 5<210>2<211>10<212>PRT<213>Bos taurus<400>2Glu Ala Cys Phe Ala Val Glu Gly Pro Lys1 5 10<210>3<211>16<212>PRT<213>Bos taurus<400>3Asn Glu Cys Phe Leu Ser His Lys Asp Asp Ser Pro Asp Leu Pro Lys1 5 10 15<210>4<211>17<212>PRT<213>Bos taurus<400>4Cys Cys Ala Ala Asp Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala Val Glu Gly Pro1 5 10 15Lys<210>5<211>11<212>PRT<213>Bos taurus<400>5His Leu Val Asp Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys
1 5 10<210>6<211>14<212>PRT<213>Bos taurus<400>6Tyr Asn Gly Val Phe Gln Glu Cys Cys Gln Ala Glu Asp Lys1 5 10<210>7<211>7<212>PRT<213>Bos taurus<400>7Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg1 5<210>8<211>13<212>PRT<213>Bos taurus<400>8Asp Asp pro His Ala Cys Tyr Ser Thr Val Phe Asp Lys1 5 10<210>9<211>15<212>PRT<213>Bos taurus<400>9Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg1 5 10 15<210>10<211>12<212>PRT<213>Bos taurus<400>10Arg His Pro Glu Tyr Ala Val Ser Val Leu Leu Arg1 5 10<210>11<211>13<212>PRT<213>Bos taurus<400>11Leu Lys Pro Asp Pro Asn Thr Leu Cys Asp Glu Phe Lys1 5 10<210>12<211>14<212>PRT<213>Bos taurus
<400>12Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg1 5 10<210>13<211>10<212>PRT<213>Bos taurus<400>13Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys1 5 10<210>14<211>10<212>PRT<213>Bos taurus<400>14Leu Val Asn Glu Leu Thr Glu Phe Ala Lys1 5 10<210>15<211>12<212>PRT<213>Bos taurus<400>15Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Glu Leu Cys Lys1 5 10<210>16<211>9<212>PRT<213>Bos taurus<400>16Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys1 5<210>17<211>15<212>PRT<213>Equus caballus<400>17Val Gly Gly His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg1 5 10 15<210>18<211>12<212>PRT<213>Equus caballus<400>18Asp Phe Thr Pro Glu Leu Gln Ala Ser Tyr Gln Lys1 5 10<210>19<211>16<212>PRT
<213>Equus caballus<400>19Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys1 5 10 15<210>20<211>12<212>PRT<213>Equus caballus<400>20Phe Leu Ser Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys1 5 10<210>21<211>9<212>PRT<213>Equus caballus<400>21Ala Ala Val Leu Ala Leu Trp Asp Lys1 5<210>22<211>9<212>PRT<213>Equus caballus<400>22Met Phe Leu Gly Phe Pro Thr Thr Lys1 5<210>23<211>12<212>PRT<213>Equus caballus<400>23Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Val Val Leu Ala Arg1 5 10<210>24<211>13<212>PRT<213>Equus caballus<400>24Gln Asn Tyr Ser Thr Glu Val Glu Ala Ala Val Asn Arg1 5 10<210>25<211>11<212>PRT<213>Equus caballus<400>25Thr Gly Pro Asn Leu His Gly Leu Phe Gly Arg1 5 10<210>26
<211>7<212>PRT<213>Equus caballus<400>26Met Ile Phe Ala Gly Ile Lys1 5<210>27<211>8<212>PRT<213>Equus caballus<400>27Glu Asp Leu Ile Ala Tyr Leu Lys1 5<210>28<211>6<212>PRT<213>Equus caballus<400>28Glu Leu Gly Phe Gln Gly1 5<210>29<211>8<212>PRT<213>Equus caballus<400>29Tyr Lys Glu Leu Gly Phe Gln Gly1 5<210>30<211>15<212>PRT<213>Equus caballus<400>30Val Glu Ala Asp Ile Ala Gly His Gly Gln Glu Val Leu Ile Arg1 5 10 15<210>31<211>6<212>PRT<213>Equus caballus<400>31Ala Leu Glu Leu Phe Arg1 5<210>32<211>15<212>PRT<213>Equus caballus<400>32His Gly Thr Val Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys Lys1 5 10 15
<210>33<211>14<212>PRT<213>Equus caballus<400>33His Gly Thr Val Val Leu Thr Ala Leu Gly Gly Ile Leu Lys1 5 10<210>34<211>16<212>PRT<213>Equus caballus<400>34Gly Leu Ser Asp Gly Glu Trp Gln Gln Val Leu Asn Val Trp Gly Lysl 5 10 15<210>35<211>8<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>35Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg1 5<210>36<211>12<212>PRT<213>人<400>36Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys1 5 10<210>37<211>13<212>PRT<213>人<400>37Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys1 5 10<210>38<211>15<212>PRT<213>人<400>38Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Thr1 5 10 15<210>39<211>10<212>PRT<213>人<400>39
Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys1 5 10<210>40<211>14<212>PRT<213>人<400>40Ser Val Ile Pro Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys1 5 10<210>41<211>10<212>PRT<213>人<400>41Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys1 5 10<210>42<211>10<212>PRT<213>人<400>42Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys1 5 10<210>43<211>11<212>PRT<213>Equus caballus<400>43Leu Phe Thr Gly His Pro Glu Thr Leu Glu Lys1 5 10<210>44<211>12<212>PRT<213>人<400>44Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg1 5 10<210>45<211>10<212>PRT<213>人<400>45Asn Gln Val ser Leu Thr Cys Leu Val Lys1 5 10<210>46<211>11<212>PRT<213>人
Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg1 5 10<210>47<211>11<212>PRT<213>人<400>47Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys1 5 10
權(quán)利要求
1.用于對肽混合物中的一種或多種肽進(jìn)行定量的方法，包括接收包含多種肽的第一肽混合物；在一段時間里分離第一肽混合物所含多種肽中的一種或多種；在該段時間的特定時間對第一肽混合物的一種或多種分離肽進(jìn)行質(zhì)荷分析；計算第一肽混合物中一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度；并通過比較計算得出的第一肽混合物的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度與參照樣品中的一種或多種肽的豐度，計算第一肽混合物中所述一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的相對量，所述參照樣品對于第一肽混合物而言是外部的。
2.權(quán)利要求1的方法，其中接收包含多種肽的第一肽混合物包括消化第一多肽樣品以生成該第一肽混合物。
3.權(quán)利要求2的方法，還包括通過消化第二多肽樣品來制備參照樣品；由經(jīng)過消化的第二多肽樣品分離一種或多種肽；對由經(jīng)過消化的第二多肽樣品分離的肽進(jìn)行質(zhì)量分析；并計算第二多肽樣品中一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度；其中計算第一肽混合物中所述一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的相對量包括比較計算得出的第一肽混合物中所述一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度與計算得出的第二多肽樣品中一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的相應(yīng)肽的豐度。
4.權(quán)利要求1的方法，其中分離一種或多種肽包括通過液相層析分離該一種或多種肽。
5.權(quán)利要求4的方法，其中分離一種或多種肽包括在特定時間分離液相層析洗脫液；且對第一肽混合物中的一種或多種分離肽進(jìn)行質(zhì)量分析包括對分離洗脫液中的一種或多種肽進(jìn)行質(zhì)量分析。
6.權(quán)利要求1的方法，還包括鑒定第一肽混合物中的一種或多種肽。
7.權(quán)利要求6的方法，其中鑒定第一肽混合物中的一種或多種肽包括根據(jù)質(zhì)量分析信息鑒定一種或多種分離肽。
8.權(quán)利要求7的方法，其中對一種或多種分離肽進(jìn)行質(zhì)量分析包括對由所述一種或多種分離肽中的肽衍生的離子進(jìn)行片段化并對離子的片段進(jìn)行質(zhì)量分析；且鑒定第一樣品中的一種或多種肽包括根據(jù)片段的質(zhì)量分析信息搜索序列數(shù)據(jù)庫。
9.權(quán)利要求4的方法，其中計算一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度包括根據(jù)肽的質(zhì)量分析信息重建肽的層析峰。
10.權(quán)利要求9的方法，其中計算肽的豐度包括根據(jù)肽的重建層析峰面積計算肽的豐度。
11.權(quán)利要求10的方法，其中計算肽的豐度包括只使用位于特定時間的重建層析圖中閾值距離以內(nèi)的層析峰計算肽的豐度。
12.權(quán)利要求10的方法，其中計算所述一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的相對量包括比較通過重建第一肽混合物的肽的層析峰面積計算得出的豐度與通過重建參照樣品中的肽的層析峰面積計算得出的豐度。
13.權(quán)利要求2的方法，還包括對計算得出的第一肽混合物的所述一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
14.權(quán)利要求13的方法，其中對計算得出的豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化包括根據(jù)包含添加到第一多肽樣品中的一種或多種肽的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)對計算得出的豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
15.權(quán)利要求13的方法，其中對計算得出的豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化包括根據(jù)包含一種或多種肽的外部標(biāo)準(zhǔn)對計算得出的豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
16.權(quán)利要求2的方法，還包括根據(jù)質(zhì)量分析鑒定第一肽混合物中的多種肽；其中計算一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的相對量包括計算每一種經(jīng)鑒定肽的相對量。
17.權(quán)利要求16的方法，還包括根據(jù)第一肽混合物中的一組肽的重建層析峰面積計算校準(zhǔn)系數(shù)，這組肽中的每一種肽在多次實驗中具有恒定層析峰面積，并將該校準(zhǔn)系數(shù)應(yīng)用于計算得出的每一種經(jīng)鑒定肽的豐度，從而對計算得出的每一種經(jīng)鑒定肽的豐度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
18.權(quán)利要求1的方法，其中在單次自動化實驗中進(jìn)行質(zhì)量分析和計算步驟以鑒定第一肽混合物中的每一種肽并計算其相對量。
19.權(quán)利要求1的方法，其中進(jìn)行質(zhì)荷分析和計算步驟的所述一種或多種分離肽是天然存在的肽。
20.權(quán)利要求19的方法，其中參照樣品中的所述一種或多種肽是天然存在的肽。
21.權(quán)利要求1的方法，其中對一種或多種分離肽進(jìn)行質(zhì)荷分析并計算一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度包括對第一種混合物中的一種或多種任意肽進(jìn)行質(zhì)荷分析并計算豐度。
22.權(quán)利要求1的方法，其中分離、質(zhì)荷分析、和計算步驟不受受試肽的特定氨基酸組成的約束。
23.定量混合物中的一種或多種肽的方法，包括消化蛋白質(zhì)樣品以生成肽混合物；使用液相層析分離肽混合物中的一種或多種肽；對一種或多種分離肽進(jìn)行質(zhì)量分析；根據(jù)肽的質(zhì)譜鑒定一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽；計算經(jīng)鑒定肽的層析峰面積；根據(jù)計算得出的經(jīng)鑒定肽的峰面積計算與相應(yīng)肽對應(yīng)的一種或多種蛋白質(zhì)的層析峰面積；根據(jù)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的層析峰面積對蛋白質(zhì)的層析峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；并通過比較蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化層析峰面積與參照樣品中的相應(yīng)蛋白質(zhì)的層析峰面積，確定一種或多種蛋白質(zhì)的相對量。
24.用于定量肽混合物中的一種或多種肽的裝置，包括用于接收包含多種肽的第一肽混合物的手段；用于在一段時間里分離第一肽混合物所含多種肽中的一種或多種肽的手段；用于在該段時間的特定時間對第一肽混合物的一種或多種分離肽進(jìn)行質(zhì)量分析的手段；用于計算第一肽混合物的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度的手段；和用于通過比較計算得出的第一肽混合物的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度與參照樣品中的一種或多種肽的豐度，計算第一肽混合物中一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的相對量的手段，所述參照樣品對于第一肽混合物而言是外部的。
25.權(quán)利要求24的裝置，其中用于計算豐度的手段和用于計算相對量的手段是相同的。
26.權(quán)利要求24的裝置，其中用于進(jìn)行質(zhì)量分析的手段是離子捕獲質(zhì)譜儀、三聯(lián)式四極質(zhì)譜儀、四極飛行時間質(zhì)譜儀、捕獲飛行時間質(zhì)譜儀、傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀、源衰變后飛行時間質(zhì)譜儀、飛行時間-飛行時間質(zhì)譜儀或環(huán)狀捕獲質(zhì)譜儀。
27.權(quán)利要求24的裝置，其中用于分離的手段包括液相層析、氣相層析、電泳和毛細(xì)管電泳中至少其一。
28.權(quán)利要求27的裝置，其中用于分離的手段包括至少二維分離。
29.權(quán)利要求24的裝置，其中用于計算的手段包括電腦系統(tǒng)。
30.權(quán)利要求24的裝置，還包括用于接收至少一種額外肽混合物的手段。
31.權(quán)利要求30的裝置，其中所述至少一種額外肽混合物包括參照樣品。
32.權(quán)利要求24的裝置，其中用于計算豐度的手段還包括參考信息。
33.權(quán)利要求24的裝置，其中用于進(jìn)行質(zhì)荷分析的手段和用于計算的手段被設(shè)置成對天然存在的肽進(jìn)行質(zhì)荷分析并計算豐度。
34.權(quán)利要求33的裝置，其中用于計算的手段被設(shè)置成將計算得出的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度與參照樣品中一種或多種天然存在的肽的豐度進(jìn)行比較。
34.權(quán)利要求24的裝置，其中用于進(jìn)行質(zhì)荷分析的手段和用于計算的手段被設(shè)置成對第一肽混合物中的一種或多種任意肽進(jìn)行質(zhì)荷分析并計算豐度。
35.權(quán)利要求24的裝置，其中用于分離、質(zhì)荷分析、和計算步驟的手段被設(shè)置成不依賴受試肽的特定氨基酸組成而對一種或多種肽進(jìn)行分離、質(zhì)荷分析并計算豐度。
36.用于定量第一肽混合物中的一種或多種肽的電腦可讀介質(zhì)上的電腦程序產(chǎn)品，包括可操作而引起可編程處理器執(zhí)行以下操作的指示接收代表在一段時間里分離第一肽混合物所含多種肽的一種或多種的分離信息；接收在一段時間的特定時間對第一肽混合物的一種或多種分離肽的質(zhì)荷分析信息；計算第一肽混合物的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度；并通過比較計算得出的第一肽混合物的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度與參照樣品中的一種或多種肽的豐度，計算第一肽混合物的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的相對量，所述參照樣品對于第一肽混合物而言是外部的。
37.用于定量第一肽混合物中的一種或多種肽的電腦可讀介質(zhì)上的電腦程序產(chǎn)品，包括可操作而引起可編程處理器進(jìn)行以下操作的指示接收代表在一段時間里分離第一肽混合物所含多種肽的一種或多種的分離信息；接收在該段時間的特定時間對第一肽混合物中一種或多種分離肽的質(zhì)荷分析信息；根據(jù)肽的質(zhì)荷分析信息鑒定一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽；計算經(jīng)鑒定肽的層析峰面積；根據(jù)計算得出的經(jīng)鑒定肽的峰面積計算與相應(yīng)肽對應(yīng)的一種或多種蛋白質(zhì)的層析峰面積；根據(jù)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的層析峰面積對蛋白質(zhì)的層析峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；并通過比較蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化層析峰面積與參照樣品中的相應(yīng)蛋白質(zhì)的層析峰面積，確定一種或多種蛋白質(zhì)的相對量。
38.用于定量第一肽混合物中的一種或多種肽的裝置，包括設(shè)置成執(zhí)行以下運算的數(shù)字電路接收代表在一段時間里分離第一肽混合物所含多種肽中的一種或多種的分離信息；接收在該段時間的特定時間對第一肽混合物的一種或多種分離肽的質(zhì)荷分析信息；計算第一肽混合物的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度；并通過比較計算得出的第一肽混合物的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度與參照樣品中的一種或多種肽的豐度，計算第一肽混合物的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的相對量，所述參照樣品對于第一肽混合物而言是外部的。
39.權(quán)利要求31的裝置，其中該裝置包括可編程處理器，而且通過保存在存儲器中的由處理器運行的指示來設(shè)置該裝置。
40.用于定量第一肽混合物中的一種或多種肽的裝置，包括設(shè)置成執(zhí)行以下運算的數(shù)字電路接收代表在一段時間里分離第一肽混合物所含多種肽中的一種或多種的分離信息；接收在一段時間的特定時間對第一肽混合物的一種或多種分離肽的質(zhì)荷分析信息；根據(jù)肽的質(zhì)荷分析信息鑒定一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽；計算經(jīng)鑒定肽的層析峰面積；根據(jù)計算得出的經(jīng)鑒定肽的峰面積計算與相應(yīng)肽對應(yīng)的一種或多種蛋白質(zhì)的層析峰面積；根據(jù)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的層析峰面積對蛋白質(zhì)的層析峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；并通過比較蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化層析峰面積與參照樣品中的相應(yīng)蛋白質(zhì)的層析峰面積，確定一種或多種蛋白質(zhì)的相對量。
41.權(quán)利要求41的裝置，其中該裝置包括可編程處理器，而且通過保存在存儲器中的由處理器運行的指示來設(shè)置該裝置。
42.用于定量生物學(xué)樣品中的一種或多種化合物的方法，包括接收包含多種化合物的生物學(xué)樣品；在一段時間里分離生物學(xué)樣品所含多種化合物的一種或多種；在一段時間的特定時間對生物學(xué)樣品的一種或多種分離化合物進(jìn)行質(zhì)荷分析；計算生物學(xué)樣品中一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的化合物的豐度；并通過比較計算得出的生物學(xué)樣品的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的化合物的豐度與參照樣品中的一種或多種化合物的豐度，計算生物學(xué)樣品的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的化合物的相對量，所述參照樣品對于生物學(xué)樣品而言是外部的。
43.用于定量生物學(xué)樣品中的一種或多種化合物的裝置，包括設(shè)置成執(zhí)行以下運算的數(shù)字電路接收包含多種化合物的生物學(xué)樣品；在一段時間里分離生物學(xué)樣品所含多種化合物的一種或多種；在一段時間的特定時間對生物學(xué)樣品的一種或多種分離化合物進(jìn)行質(zhì)荷分析；計算生物學(xué)樣品的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的化合物的豐度；并通過比較計算得出的生物學(xué)樣品的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的化合物的豐度與參照樣品中的一種或多種化合物的豐度，計算生物學(xué)樣品的一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的化合物的相對量，所述參照樣品對于生物學(xué)樣品而言是外部的。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于對肽混合物中的肽進(jìn)行定量的方法和裝置，包括電腦程序產(chǎn)品。其中接收包含多種肽的肽混合物。在一段時間里由肽混合物分離一種或多種肽。對特定時間分離的一種或多種肽進(jìn)行質(zhì)荷分析，并計算一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的豐度。通過比較計算得出的肽的豐度與相對于第一肽混合物而言屬外部的參照樣品中一種或多種肽的豐度，計算所述一種或多種經(jīng)過質(zhì)量分析的肽的相對量。該技術(shù)可用于任意肽，無需使用不同的質(zhì)量標(biāo)記，而且可用于其它生物學(xué)分子，諸如核酸和小分子。
文檔編號G01N30/88GK1692282SQ03813860
公開日2005年11月2日 申請日期2003年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月15日
發(fā)明者P·V·邦達(dá)爾科, T·A·沙爾特, D·H·徹里尤斯 申請人:薩莫芬尼根有限責(zé)任公司