專利名稱：用于同時檢測四種致畸胎疾病的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于同時檢測四種致畸胎疾病的試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
ToRCH是四種人類致病微生物英文名稱字頭的組合包括弓形蟲(TOX)、風(fēng)疹病毒(RV)、巨細胞病毒(CMV)以及單純皰疹病毒(HSV)I和II型。它們是四種最可能導(dǎo)致畸胎的傳染病的病原體。
巨細胞病毒屬皰疹病毒群，其傳染源是患者和無癥狀的隱性感染者。若孕婦感染單純皰疹易引起流產(chǎn)、死胎，后期感染主要引起小兒頭畸形、智力發(fā)育障礙，亦有報道可引起先天性心臟病、臍疝、足畸形和肝脾腫大等。
單純皰疹是由單純皰疹病毒所致的傳染性疾病，根據(jù)其抗原性質(zhì)的不同分為兩型即HSV I和HSV II。若孕婦感染單純皰疹，妊娠早期可引起死胎、流產(chǎn)、小兒頭畸形、小眼畸形、腦內(nèi)鈣化等神經(jīng)系統(tǒng)畸形，其癥狀與巨細胞病毒相似。
風(fēng)疹病毒是傳染性最強的致畸因子，亦是致畸作用最明顯的一種病毒。風(fēng)疹病毒誘發(fā)先天性畸形除白內(nèi)障外，還有心臟畸形(動脈導(dǎo)管未閉、心房和心室間隔缺損)、耳聾、青光眼、小眼、小頭、智能發(fā)育不全和牙釉質(zhì)缺損等。最近發(fā)現(xiàn)風(fēng)疹病毒還可以引起胎兒生長遲緩，心肌損害?；硷L(fēng)疹發(fā)生先天性畸形可達40％以上。
弓形蟲是專一性的細胞內(nèi)寄生蟲，它破壞人體除紅細胞以外的所有有核細胞。若孕婦感染弓形蟲，還可通過胎盤感染胎兒，造成早產(chǎn)、死產(chǎn)或胎兒畸形或其它先天性疾病，尤其是造成智力低下，帶來嚴重后果。在我國，每年出生100多萬與弓形蟲感染有關(guān)的畸形兒和先天性殘疾兒。
ToRCH患者造成孕婦流產(chǎn)、死胎，勉強出生后有嚴重的智力障礙，生活不能自理，并伴有復(fù)雜的心血管病，需要家人的長期照顧，造成極大的精神及經(jīng)濟負擔(dān)。我國每年約有1000萬個產(chǎn)婦，26000個ToRCH患兒出生，平均每小時就有3個。由于成人ToRCH感染的臨床癥狀不明顯，因此一般不易察覺。
世界上許多發(fā)達國家已將ToRCH列為孕期常規(guī)檢查項目，在優(yōu)生優(yōu)育方面發(fā)揮重要作用。在國內(nèi)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對優(yōu)生優(yōu)育的認識逐步提高，許多地區(qū)已將ToRCH檢測作為孕期常規(guī)檢查項目。
ToRCH在臨床診斷上通常檢測的是針對相應(yīng)病原物感染后人體內(nèi)產(chǎn)生的IgG或IgM。檢出特異性IgM說明患者為近期感染，或潛伏的病毒被激活產(chǎn)生復(fù)發(fā)感染；檢出特異性IgG則為繼往感染，已有一定的免疫水平。當患者復(fù)發(fā)感染時，IgM和IgG都會較快地上升到高滴度，其中IgG上升極其顯著(一般可上升4倍以上的水平)，因此臨床上若檢測出高滴度的IgG，則意味著再次感染。
目前ToRCH感染的實驗室診斷常規(guī)采用ELISA方法，另外還有PCR、金標等方法。PCR具有靈敏度極高的特點，能直接檢測病原體基因；金標法比較操作簡單，適合基層單位使用；而ELISA通常檢測病原的特異性抗體，靈敏度較高、特異性較強。但以上方法涉及的試劑較多，操作復(fù)雜，反應(yīng)時間長。
生物芯片技術(shù)是九十年代中期興起的一項新興生物技術(shù)，因其可在一次反應(yīng)中進行多種信息的平行分析，而受到眾多研究者的矚目，迅速在諸多生物學(xué)領(lǐng)域得到應(yīng)用。生物芯片技術(shù)按檢測對象分類，主要分為基因芯片和蛋白芯片兩類。蛋白芯片通過固定于支持介質(zhì)上的多種蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列，直接檢測特定功能物質(zhì)(標志性蛋白)。與傳統(tǒng)檢測方式相比，利用蛋白芯片技術(shù)對特殊致病微生物進行檢測具有以下優(yōu)點1)高通量，同時可進行多人份多指標的檢測，也可單獨使用；2)高敏感度和特異性；3)操作快速、簡便，適用于臨床即時檢測，只需一個半小時便能完成整個檢測反應(yīng)過程；4)所需樣本量少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于利用蛋白芯片技術(shù)，同時對巨細胞病毒(CMV)、單純皰疹病毒(HSV)、風(fēng)疹病毒(RV)和弓形蟲(TOX)進行檢測，提供一種靈敏、準確、迅速的孕婦血樣檢測的試劑盒。
本發(fā)明公開的用于同時檢測ToRCH指標的試劑盒由蛋白芯片、反應(yīng)液、洗滌液組成。蛋白芯片由固相載體和固定在該載體上的與ToRCH相關(guān)蛋白組成。其中所述的固相載體選自經(jīng)硅烷化處理的載玻片或有機聚合物材料等；所述的ToRCH相關(guān)蛋白包括CMV特異性抗原，HSV I、II型特異性抗原、RV特異性抗原和TOX特異性抗原；各抗原點樣體積為1-100nl，點樣濃度為1×10-6-100mg/ml。
為提高檢測的準確度和可靠性，本發(fā)明蛋白芯片中還設(shè)計了陰性對照和一系列已知濃度的內(nèi)參照IgG，IgM。其中陰性對照為兔肌球蛋白(myosin)、肌動蛋白或膠原蛋白等。
本發(fā)明試劑盒中的反應(yīng)液為熒光試劑標記的抗人IgG、抗人IgM或熒光試劑標記的抗人IgG和抗人IgM的混合物。該熒光試劑可以為Fluorescein，Rhodamine，Coumarin，CY Dyes和Alexa Dyes，其中優(yōu)選CY Dyes和Alexa Dyes，與其他熒光試劑相比，上述兩種試劑具有更好的光穩(wěn)定性，高水溶性和高熒光效率。
本發(fā)明試劑盒中洗滌液至少含有一種下述濃度的溶液0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8、0.1-1.0％Tween20。
本發(fā)明所述固相載體為經(jīng)過硅烷化處理的載玻片，特別是經(jīng)過氨丙基三甲氧基硅烷試劑處理的玻片；有機聚合物材料是指聚苯乙烯等。
本發(fā)明所述的硅烷化處理的載玻片通過下述方法制得1)載玻片用鉻酸洗液浸泡過夜，蒸餾水洗，浸入10--30％氨水中過夜，蒸餾水洗；2)玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷(Aldrich)的50--95％乙醇溶液中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3-5，室溫處理，乙醇超聲清洗，水超聲清洗，140--180℃烘干2-24小時；
3)用2-8％戊二醛處理成醛基化；4)使用前0.01-5％SDS和清水各洗兩次，空氣干燥后0.01--5％NaBH4溶液還原5--30min，0.01-5％SDS洗一次，水洗一次，空氣干燥后用待用。
本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提供上述檢測試劑盒的制備方法。
一、蛋白芯片的制備方法1)用稀釋液將蛋白芯片上所要點制的蛋白質(zhì)稀釋到一定濃度；用芯片自動點樣系統(tǒng)將這些蛋白質(zhì)點制在固相基質(zhì)上，點樣密度在10-200點/cm2；HSV II型特異性抗原，RV特異性抗原，TOX特異性抗原的稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20；CMV特異性抗原稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20，0.01-30％蔗糖；HSV I型特異性抗原和標準IgG的稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20，0.01--20％聚烯吡酮(PVP)；標準IgM的稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.1-1.0％Tween20，0.01-0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)；2)用封閉液將蛋白芯片封閉處理，以避免固相載體上未固定蛋白的區(qū)域隨機吸附其它蛋白質(zhì)，影響反應(yīng)結(jié)果。干燥0.5-24小時；其中所述的封閉液配方為70-95％CBS，5-15％小牛血清，1-9％蔗糖；或1-9％BSA，1-9％蔗糖，0.1-1％NaN3的PBS。
為確保產(chǎn)品的質(zhì)量，蛋白芯片的制備過程應(yīng)嚴格控制環(huán)境溫度和環(huán)境濕度。溫度應(yīng)控制在18-28℃，濕度控制在35-70％。
二、反應(yīng)液的制備Alexa Dyes標記的抗IgG抗體和Alexa Dyes標記的抗IgM抗體外購，反應(yīng)液中熒光標記的IgM抗體和熒光標記的IgG抗體的比例為(0-1)∶0.5。
三、洗滌液的制備至少含有一種下述濃度的溶液0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8、0.1-1.0％Tween20。
本發(fā)明公開的同時檢測巨細胞病毒、單純皰疹病毒、風(fēng)疹病毒和弓形蟲所感染的試劑盒具體使用方法包括1)將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10倍；2)血樣用洗滌液按1∶50稀釋，吸取200μl加入芯片上；3)25--37℃振蕩反應(yīng)20--60分鐘，棄去液體；4)加滿稀釋后的洗滌液，溫育振蕩2--10分鐘，棄去洗滌液。共洗滌3次；5)加200μl反應(yīng)液于芯片上；6)用掃描儀采集數(shù)據(jù)，并進行數(shù)據(jù)分析。
本發(fā)明同時檢測四種致畸胎疾病的試劑盒，由于采用了經(jīng)特殊處理的固相載體和陰性對照，使對四種致畸胎疾病的檢測更為準確和靈敏。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的描述。


圖1 蛋白芯片點樣示意2 弓形蟲病人血樣檢測結(jié)果3 風(fēng)疹病毒病人血樣檢測結(jié)果4 IgM標準曲線圖5 IgG標準曲線
具體實施例方式實施例1硅烷化玻片的制備(1)載玻片用鉻酸洗液浸泡過夜，蒸餾水洗，浸入25％氨水中過夜，Milli-Q水洗。
(2)玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷(Aldrich)的95％乙醇溶液中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5，室溫處理，95％乙醇超聲清洗，水超聲清洗，160℃烘干4hrs。
(3)用5％戊二醛處理成醛基化。
使用前0.2％SDS和清水各洗兩次，空氣干燥后1％NaBH4溶液還原10min，0.2％SDS洗一次，水洗一次，空氣干燥后用待用。
實施例2用于檢測ToRCH相關(guān)指標蛋白芯片的制備嚴格控制生產(chǎn)過程溫度25±1℃，濕度控制在55±3％。
(1)用稀釋液將蛋白芯片上所要點制的蛋白質(zhì)稀釋到一定濃度；用芯片自動點樣系統(tǒng)將這些蛋白質(zhì)點制在固相基質(zhì)上，點樣密度在20點/cm2。點樣體積為20nl/點，點樣濃度為20mg/l。
(2)點陣排布如下(點樣示意圖見圖1)

HSV II型特異性抗原，RV特異性抗原，TOX特異性抗原，兔肌球蛋白的稀釋液的配方為0.15％KCl，1.4％Na2HPO4，0.2％KH2PO4，6％NaCl，pH為7.5，0.2％Tween20。
CMV特異性抗原稀釋液的配方為0.15％KCl，1.4％Na2HPO4，0.2％KH2PO4，6％NaCl，pH為7.5，0.2％Tween20，10％蔗糖。
HSV I型特異性抗原和標準IgG的稀釋液的配方為0.15％KCl，1.4％Na2HPO4，0.2％KH2PO4，6％NaCl，pH為7.5，0.2％Tween20，0.1-1.0％Tween20，10％聚烯吡酮(PVP)。
標準IgM的稀釋液的配方為0.15％KCl，1.4％Na2HPO4，0.2％KH2PO4，6％NaCl，pH為7.5，0.2％Tween20，0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)。
(3)用封閉液將蛋白芯片封閉處理30分鐘，干燥過夜。
其中所述的封閉液配方為6％BSA，4％蔗糖，0.3％NaN3的PBS。
實施例3ToRCH相關(guān)指標檢測試劑盒的制備方法1、蛋白芯片的制備同實施例22、濃縮洗滌液的制備按以下配方配制洗滌液0.3％KCl，1.2％Na2HPO4，0.8％KH2PO4，11％NaCl，0.6％Tween20，調(diào)pH值為7.4。
3、反應(yīng)液的制備Alexa Dyes標記的抗IgG抗體和Alexa Dyes標記的抗IgM抗體外購。反應(yīng)液中熒光標記的抗IgM抗體和熒光標記的抗IgG抗體的比例為1∶1。
實施例4ToRCH相關(guān)指標檢測試劑盒的使用方法用ToRCH相關(guān)指標檢測試劑盒對弓形蟲病人血樣、風(fēng)疹病毒病人血樣進行檢測(1)濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10倍。
(2)血樣用洗滌液按1∶50稀釋，吸取200μl加入芯片上。
(3)37℃振蕩反應(yīng)30分鐘，棄去液體。
(4)加滿稀釋后的洗滌液，溫育振蕩5分鐘，棄去洗滌液。共洗滌3次。
(5)加200μl反應(yīng)液于芯片上。
(6)用掃描儀采集數(shù)據(jù)，并進行數(shù)據(jù)分析IgM標準曲線如圖4所示，IgG標準曲線如圖5所示。檢測結(jié)果如圖2、圖3所示。
權(quán)利要求
1.一種同時檢測四種致畸胎疾病的試劑盒，該試劑盒包括蛋白芯片、反應(yīng)液和洗滌液，其中蛋白芯片由固相載體和固定在該載體上的與ToRCH相關(guān)蛋白組成，其特征在于其中的蛋白芯片的固相載體選自經(jīng)硅烷化處理的載玻片或有機聚合物材料；所述的與ToRCH相關(guān)蛋白包括CMV特異性抗原，HSVI、II型特異性抗原、RV特異性抗原和TOX特異性抗原，各抗原點樣體積為1-100nl，點樣濃度為1×10-6-100mg/ml；在蛋白芯片上還點有陰性對照和一系列已知濃度的內(nèi)參照IgG，IgM，陰性對照為兔肌球蛋白、肌動蛋白或膠原蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于其中所述的洗滌液至少含有一種下述濃度的溶液0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8、0.1-1.0％Tween20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于其中所述的反應(yīng)液為熒光試劑標記的抗人IgG、抗人IgM或熒光試劑標記的抗人IgG和抗人IgM的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于其中所述的反應(yīng)液為比例為(0-1)∶0.5的熒光標記IgM抗體和熒光標記IgG抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒的制備方法，其特征在于該試劑盒的蛋白芯片制備包括下述步驟(1)硅烷化處理的載玻片制備1)載玻片用鉻酸洗液浸泡過夜，蒸餾水洗，浸入10-30％氨水中過夜，蒸餾水洗；2)玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的50-95％乙醇溶液中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3-5，室溫處理，乙醇超聲清洗，水超聲清洗，140-180℃烘干2-24小時；3)用2-8％戊二醛處理成醛基化；4)使用前0.01-5％SDS和清水各洗兩次，空氣干燥后0.01-5％NaBH4溶液還原5-30min，0.01-5％SDS洗一次，水洗一次，空氣干燥后用待用；(2)蛋白芯片的制備方法1)用稀釋液將蛋白芯片上所要點制的蛋白質(zhì)稀釋到一定濃度；用芯片自動點樣系統(tǒng)將這些蛋白質(zhì)點制在步驟(1)制得的硅烷化處理的載玻片，點樣密度在10-200點/cm2；HSVII型特異性抗原，RV特異性抗原，TOX特異性抗原的稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20；CMV特異性抗原稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20，0.01-30％蔗糖；HSVI型特異性抗原和標準IgG的稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.01-1.0％Tween20，0.01-20％聚烯吡酮；標準IgM的稀釋液的配方包括0.01-1.0％KCl，0.01-3.0％Na2HPO4，0.01-1.0％KH2PO4，0.01-20.0％NaCl，pH為7.0-7.8，0.1-1.0％Tween20，0.01-0.5％十二烷基硫酸鈉；2)用封閉液將蛋白芯片封閉處理，以避免固相載體上未固定蛋白的區(qū)域隨機吸附其它蛋白質(zhì)，影響反應(yīng)結(jié)果，干燥0.5-24小時；其中所述的封閉液配方為70-95％CBS，5-15％小牛血清，1-9％蔗糖；或1-9％BSA，1-9％蔗糖，0.1-1％NaN3的PBS。3)制備時控制環(huán)境溫度在18-28℃，濕度控制在35-70％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于同時檢測四種致畸胎疾病的試劑盒及其制備方法。該試劑盒包括蛋白芯片、反應(yīng)液和洗滌液，其中蛋白芯片由固相載體和固定在該載體上的與ToRCH相關(guān)蛋白組成，其特征在于其中的蛋白芯片的固相載體選自經(jīng)硅烷化處理的載玻片或有機聚合物材料；所述的與ToRCH相關(guān)蛋白包括CMV特異性抗原，HSVI、II型特異性抗原、RV特異性抗原和TOX特異性抗原，各抗原點樣體積為1－100nl，點樣濃度為1＊10
文檔編號G01N33/53GK1595158SQ0315098
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月12日
發(fā)明者李潤生 申請人:上海前沿生物技術(shù)有限公司