專利名稱：用于分析的方法和生物傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析方法。本發(fā)明還涉及用于進(jìn)行所述方法的生物傳感器。
背景技術(shù)：
對(duì)于幫助臨床診斷和環(huán)境分析的簡(jiǎn)單、快速和易于使用的傳感器的需求在不斷增加。
在傳統(tǒng)上，在臨床實(shí)驗(yàn)室中已經(jīng)通過放射免疫分析、固相酶免疫分析和熒光免疫分析方法來測(cè)定抗體與抗原之間非常特異和緊密的結(jié)合?？贵w-抗原復(fù)合物的定量測(cè)定依賴于標(biāo)記分子例如放射同位素、酶或熒光探針。在大多數(shù)情況下，只有在進(jìn)行了幾次培養(yǎng)、洗滌和分離步驟之后才能獲得結(jié)果。
目前正在開發(fā)可借助于被固定的抗體來即時(shí)監(jiān)測(cè)抗體濃度，并且不需要使用標(biāo)記物的免疫傳感器。然而，在使用常規(guī)固定方法時(shí)，對(duì)于抗體定向缺乏控制限制了可利用的結(jié)合位點(diǎn)的比例[Attili，B.；Suleiman，A.；Microchemical Journal 54(1996)174]。另一方面，位點(diǎn)特異性固定帶來較高的活性。對(duì)于抗體的控制固定的選擇包括抗體的Fc區(qū)與蛋白A或蛋白G的特異性結(jié)合，經(jīng)由抗體Fab′-片段上的游離巰基共價(jià)連接到支持層上，和通過生物素/(鏈霉)抗生物素蛋白化學(xué)將生物素化的抗體偶聯(lián)到表面上[Morgan，H.；Taylor，D.M.；Biosensors & Bioelectronics 7(1992)405；Vikholm，I.；Albers，W.M.；Langmuir 14(1998)3865；Fischer，B.；Heyn，S.P.；Egger，M.；Gaub，H.E.；Langmuir(9)(1993)136；Schnhoff，M.；Lsche，M.；Meyer，M.；Wilhelm，C.；Progr.Colloid Polym.Sci.(1992)243；Krull，U.J.；Brown，R.S.；Vandenberg，E.T.；Heckl，W.M.；J.，Electr.Microscopy Technique 18(1991)212；Heyn，S.P.；Egger，M.；Gaub，H.E.；J.Phys.Chem.94(1990)5073]。
仍然，最近已經(jīng)表明，F(xiàn)ab′-片段可以以高表位密度直接吸附到金上[O′Brien，J.；Jones，V.；Porter，M.；Anal.Chem.72(2000)703]。金屬表面的高表面能通常導(dǎo)致生物分子變性，從而使活性下降。已對(duì)該吸附機(jī)理進(jìn)行了充分研究，并且其涉及材料的表面與生物分子表面上的疏水性膜片之間的疏水性相互作用。初始吸附之后，蛋白可變性，并解折疊以暴露出更多的疏水性基團(tuán)，由此失去活性[Andrade，J.D.，Hlady，V.，Adv.Polym.Sci.79(1986)1-63]。
描述使用在表面上形成用于連接生物分子的單層的各種連接分子，來制備其中可通過表面胞質(zhì)基因組共振來進(jìn)行檢測(cè)的生物傳感器的專利文件包括US專利5242828與歐洲專利442922和485874。
能夠以定向和可再現(xiàn)方式以最小解折疊連接到轉(zhuǎn)導(dǎo)物介面上的受體分子可最佳地保持活性和特異性，并且可在需要高靈敏度的傳感器應(yīng)用中使用。這類受體分子的位點(diǎn)定向固定將保證最大結(jié)合效率。
在生物傳感器應(yīng)用中必須克服的另一個(gè)問題是非特異性結(jié)合。在如生化、生物、生物技術(shù)和健康護(hù)理的領(lǐng)域中，生物排斥表面已成為引起很大關(guān)注的主題，這是因?yàn)樾枰刂粕锓肿雍图?xì)胞與各種表面的相互作用。蛋白排斥表面對(duì)于接觸血液的植入裝置、分離操作用膜、色譜載體、隱形眼鏡和血液以及蛋白貯存裝置非常重要。
生物分子排斥表面可通過將非離子親水性聚合物例如聚(丙烯酰胺)、聚(N，N-二甲基丙烯基胺)、聚(乙烯醇)、乙烯-乙烯基醇共聚物、聚(羥基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(氧化乙烯)和聚(乙二醇)固定來制得[Kberle，P.；Laschewsky，A.；van den Boogaard，D.；Polymer 33(1992)4029；Saito，N.；Sugawara，T.；Matsuda，T.；Macromolecules 29(1996)313]。對(duì)蛋白吸附的抵抗性是基于生物排斥表面的柔性分子鏈與溶液生物分子的熵和流體動(dòng)力排斥力大于組合吸引力。已通過物理包被(coating)、化學(xué)偶聯(lián)或接枝共聚來將聚合物吸附。
對(duì)于生物傳感器應(yīng)用，已有人將提供低聚(乙二醇)的自我裝配型(self-assembled)烷硫醇與其中可連接生物分子的具有適當(dāng)連接基團(tuán)的分子混合[E.Ostuni，L.Yan，G.Whitesides，Colloids和Surfaces BBiointerfaces 15(1999)3-30]。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供用于分析的方法和生物傳感器，所述方法和生物傳感器對(duì)于分析物具有高特異性結(jié)合。
可將在單體/聚合物骨架上具有合適的末端錨基團(tuán)，或具有攜帶末端錨基團(tuán)的親水性單體/聚合物“刷”的生物分子排斥分子與連接在同一表面上的生物分子，尤其是免疫結(jié)合分子(受體)例如抗體片段一起化學(xué)接枝到固體例如Au、Ag、Cu、Al、Pd和GaAs上以形成單層。這些生物分子排斥分子直接接枝到與生物分子，尤其是免疫結(jié)合分子(受體)例如抗體片段相同的表面上，這樣它們形成混合單層。生物分子排斥分子防止了在生物分子之間留下的空間中的分析物的非特異性結(jié)合。免疫反應(yīng)可用技術(shù)例如表面胞質(zhì)基因組共振、石英晶體微量天平，和阻抗來檢測(cè)。固定操作可顯著降低分析物的生物大分子的非特異性結(jié)合，因?yàn)樵贔ab′-片段之間的表面將是高親水性和非離子性的，并且抗體片段的適當(dāng)定向也將導(dǎo)致抗原的高度結(jié)合。
可將生物分子例如免疫結(jié)合分子(受體)以定向方式固定，以提供定量分析連接在生物分子上的分析物分子的適宜方法。O′Brien，J.；Jones，V.；Porter，M.；Anal.Chem.72(2000)703中描述了一種固定抗體片段的方法，該文獻(xiàn)引入本文以供參考。
在分析中使用這樣的測(cè)定方法，其與具有固體表面的基質(zhì)相容，并且與所用的基質(zhì)一起能夠給出低的檢測(cè)限(detection limit)。生物分子與對(duì)固體表面具有親和力的基團(tuán)一起直接結(jié)合在其上面的固體表面可以是這樣的類型，其能夠誘導(dǎo)信號(hào)改變，這種信號(hào)改變被發(fā)射到基質(zhì)上，以與基質(zhì)、固定的生物分子和結(jié)合的分析物的組合相互作用，隨后檢測(cè)作為基質(zhì)固體表面上的物質(zhì)增加(選擇性地與固定在基質(zhì)表面上的生物分子結(jié)合的分析物分子的蓄積)的指示的信號(hào)改變。
特別適于達(dá)到良好靈敏度和改善方法功效的檢測(cè)方法是表面胞質(zhì)基因組共振、厚度剪切模式、表面聲波和電化學(xué)測(cè)定。
附圖簡(jiǎn)述通過下列結(jié)合附圖的描述，本發(fā)明的目的和特征可得到更好的理解，其中附

圖1是傳感器表面的圖示表現(xiàn)，其中抗體Fab′-片段與生物分子排斥分子一起連接在表面上，并且傳感器與抗原相互作用，附圖2是附圖1的表現(xiàn)，其表示的是，使用膠體/納米顆粒來放大檢測(cè)，附圖3表示的是依據(jù)一個(gè)本發(fā)明實(shí)施方案的測(cè)定裝置，附圖4表示的是依據(jù)另一個(gè)本發(fā)明實(shí)施方案的測(cè)定裝置，
附圖5表示的是在將不同大分子連接在金薄膜上時(shí)SPR的改變，附圖6表示的是用本發(fā)明傳感器獲得的SPR結(jié)合等溫線，附圖7表示的是在不同大分子結(jié)合到金薄膜上時(shí)SPR強(qiáng)度的總變化。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述將生物分子與官能團(tuán)一起直接固定在基質(zhì)固體表面上以形成用于分析的一層定向受體。生物分子可以是蛋白、肽、酶、抗體、抗體片段(例如Fab′)、抗原或抗原的一部分。為了進(jìn)行分析，這些分子應(yīng)當(dāng)具有對(duì)待檢測(cè)的分析物有特異性的結(jié)合位點(diǎn)，并且它們還可以是下文描述的結(jié)合分子或受體。
生物分子與連接在同一表面上的生物分子排斥單體/聚合物分子一起經(jīng)由官能團(tuán)直接連接在基質(zhì)的固體表面上，這樣生物分子在具有暴露的活性分析物選擇性結(jié)合位點(diǎn)(例如抗原結(jié)合位點(diǎn)、表位等)的表面上自我裝配，并且也自我裝配的生物分子排斥分子將在生物分子之間留下的固體表面覆蓋，以防止在生物分子的活性結(jié)合位點(diǎn)之間發(fā)生分析物分子的非特異性結(jié)合。生物分子和生物分子排斥單體/聚合物具有官能團(tuán)，所述官能團(tuán)對(duì)于基質(zhì)的固體表面具有親和力，并起末端錨基團(tuán)的作用。例如，末端具有巰基的有機(jī)分子可通過在金屬與硫原子之間形成共價(jià)鍵而化學(xué)吸附到金屬例如Au、Ag、Cu、Al和Pd的表面上，并形成單層包被。以上述方式表現(xiàn)出自我裝配的系統(tǒng)包括通過含有硫的官能團(tuán)來自動(dòng)化學(xué)吸附到金屬表面上的硫醇、二硫化物和硫化物。
如果分析方法是SPR測(cè)定，則所用基質(zhì)是SPR相容性材料例如金、銀、銅、鋁和鈀的膜。然而，本發(fā)明不限于任何具體分析方法。
可通過將生物分子的結(jié)構(gòu)部分轉(zhuǎn)化成官能團(tuán)，例如通過將前體基團(tuán)還原成巰基來給生物分子提供官能團(tuán)。或者，可將含有官能團(tuán)或其前體的連接分子連接到生物分子上，以給其提供適于自我裝配的官能團(tuán)，然后將生物分子從溶液中化學(xué)吸附到表面上。由此在一個(gè)步驟中將具有官能團(tuán)的生物分子直接吸附到基質(zhì)的固體表面上，以形成其中生物分子以定向方式形成單層的生物傳感器。通過化學(xué)吸附將生物分子排斥單體/聚合物分子連接在表面上，也以定向方式形成單層。可在同一步驟中或者在將生物分子固定之后將生物分子排斥分子連接在同一表面上。
可通過簡(jiǎn)單的化學(xué)吸附將生物分子排斥分子連接在表面上。優(yōu)選通過在一個(gè)聚合物鏈末端上的合適的官能團(tuán)(末端錨基團(tuán))例如硫化物、二硫化物或巰基將生物分子排斥分子共價(jià)連接在表面上。所用的生物分子排斥聚合物通常在另一端含有OH基團(tuán)。表面與待排斥的生物分子的合并吸引力例如范德華力、靜電力、熵力和氫鍵力應(yīng)當(dāng)小于由于固體表面上的柔性分子鏈與溶液中生物分子的熱運(yùn)動(dòng)所帶來的熵和流體動(dòng)力排斥力。這樣的表面可通過將中性親水性聚合物，包括聚丙烯酰胺、聚-N，N-二甲基丙烯酰胺、聚乙烯基醇、乙烯-乙烯基醇共聚物、聚(羥基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(氧化乙烯)和聚(乙二醇)固定來制得。此外，對(duì)于其生物相容性，也使用了其它聚合物例如聚對(duì)苯二甲酸乙二酯、聚四氟乙烯、聚氨酯等。
在傳感器應(yīng)用中，根據(jù)附圖1所示的一個(gè)本發(fā)明實(shí)施方案，作為受體3的Fab′-片段經(jīng)由在該抗體的結(jié)合域?qū)γ娴挠坞x巰基連接，和/或具有暴露的游離巰基的抗體/受體直接連接在金屬、半導(dǎo)體或(傳導(dǎo)性)聚合物表面或這些表面的混合物，即基質(zhì)1的表面上。產(chǎn)生親水性生物分子排斥表面的聚合物分子5以定向方式連接到結(jié)合有受體的同一金屬、半導(dǎo)體或(傳導(dǎo)性)聚合物表面的生物分子之間的空余位置上，由此將基質(zhì)表面屏蔽起來，使其不能與分析物分子非特異性結(jié)合。
在本文中，術(shù)語“生物分子排斥”是指將被分析的溶液中的生物分子排斥，以防止在受體生物分子之間發(fā)生非特異性結(jié)合。
聚合物分子5這樣定向，其聚合物鏈從表面凸出來，在聚合物鏈末端的其官能團(tuán)(例如巰基、硫化物或二硫化物)作為連接位點(diǎn)。生物分子排斥分子層在表面上的厚度優(yōu)選比基質(zhì)1表面上的生物分子的厚度L(生物分子高度)低一些。
作為受體3的生物分子和生物分子排斥聚合物分子5連接在其外表面上的固體基質(zhì)1是具有適當(dāng)厚度的由合適材料構(gòu)成的膜，其可用于通過一種下文描述的方法檢測(cè)在其表面上的增多的物質(zhì)。在溶液中與基質(zhì)1接觸的分析物4(抗原)將與在基質(zhì)1上的受體3(Fab′-片段)之間發(fā)生免疫反應(yīng)。分析物的檢測(cè)方法尤其包括基于表面胞質(zhì)基因組共振，厚度剪切模式共振器技術(shù)的方法，其一個(gè)實(shí)例是石英晶體微量天平(OCM)，表面聲波(SAM裝置)和電化學(xué)測(cè)定。然而，使用生物分子排斥單體/聚合物分子來阻斷生物分子的特異性結(jié)合位點(diǎn)之間的非特異性結(jié)合位點(diǎn)的本發(fā)明不限于任何具體分析檢測(cè)方法。
上面已經(jīng)提出了抗體片段作為可連接表面的生物分子的一個(gè)實(shí)例。也在本發(fā)明范圍內(nèi)的是，將完整抗體固定在基質(zhì)表面上，例如經(jīng)由在其Fc區(qū)中提供的游離巰基來固定在基質(zhì)表面上。
根據(jù)另一個(gè)本發(fā)明實(shí)施方案，以類似方式使用受體3/Fab′-片段來包被分隔的顆粒2，例如由上述相同材料構(gòu)成的膠體和納米顆粒，這是通過將其經(jīng)由游離巰基連接在顆粒2上來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)必須檢測(cè)相對(duì)較小分子和較低濃度的分析物時(shí)，使用這些顆粒來放大檢測(cè)信號(hào)(附圖2)。在溶液中的分析物4/抗原將與在基質(zhì)表面上的受體3/Fab′-片段之間發(fā)生免疫反應(yīng)，另一方面，分析物4/抗原將與連接有結(jié)合性生物分子的顆粒2例如受體/Fab′-片段包被的膠體/納米顆粒相互作用。按照與上述類似的方式，在基質(zhì)表面上的受體3之間使用生物分子排斥聚合物分子5。由此形成了將信號(hào)放大的膠體/納米顆粒網(wǎng)絡(luò)。附圖2表明了包被的顆粒2是如何經(jīng)由分析物4(抗原)與在基質(zhì)表面上的受體3結(jié)合的。其中受體3可以經(jīng)由游離巰基與之結(jié)合的這樣的顆粒2的一個(gè)實(shí)例是金顆粒。
附圖3顯示了在實(shí)施例1中使用的SPR測(cè)定的原理，并且也是依據(jù)一個(gè)本發(fā)明實(shí)施方案的生物傳感器的實(shí)例。至于SPR測(cè)定的原理和SPR相容性材料的性質(zhì)，可參見例如歐洲專利537252和相應(yīng)的US專利5322798，二者引入本文以供參考。Sadowski等人在Opt.Eng.34(1995)2581-2586中更詳細(xì)描述了所用SPR的結(jié)構(gòu)，該文獻(xiàn)引入本文以供參考。將發(fā)自He-Ne激光器的波長(zhǎng)為632.8nm的線性p-偏振光經(jīng)由棱鏡照射到用金薄膜包被的載物片上，其中載物片的位置是依據(jù)眾所周知的Kretschmann結(jié)構(gòu)確定的。測(cè)定在特定角度隨著時(shí)間而改變的光強(qiáng)度。光水平的非常小的改變可用兩個(gè)鎖定放大器來測(cè)定，這兩個(gè)放大器以不同截?cái)囝l率監(jiān)測(cè)從棱鏡發(fā)出的光(樣本光束)和從激光器發(fā)出的光(參照光束)。雖然在這種情況下SPR檢測(cè)的動(dòng)力學(xué)范圍是有限的，但是該方法特別適于在其中共振峰相當(dāng)寬的液體中測(cè)定。通過指數(shù)匹配的油將具有直接連接的Fab′-片段和生物分子排斥聚合物的Au基質(zhì)附著在棱鏡上。將流動(dòng)池放在膜的測(cè)定區(qū)域的上面，給其填充緩沖液。將蛋白溶液泵到該池中，在合適的入射角下測(cè)定約10-15mm的光強(qiáng)度改變。
附圖4顯示了QCM測(cè)定的原理，該測(cè)定使用厚度剪切模式共振器原理，并且也可以應(yīng)用于本發(fā)明傳感器。該測(cè)定的原理可參見Vikholm，I.；Albers，W.M.；Langmuir 14(1998)3865中的描述，該文獻(xiàn)引入本文以供參考。該檢測(cè)方法的一般原理是觀測(cè)共振頻率的下降，由于分析物與一個(gè)電極的表面上的生物分子結(jié)合而導(dǎo)致共振器質(zhì)量的改變與共振頻率的下降成正比。石英晶體微量天平具有由在共振器晶體C兩側(cè)上的導(dǎo)電層1組成的電極。生物分子3和生物分子排斥聚合物分子5以例如附圖1所示方式固定在一個(gè)電極的表面上(導(dǎo)電層1)，并且該電極表面與含有待測(cè)定分析物的溶液接觸。共振器的邊緣覆蓋著硅酮橡膠以保護(hù)導(dǎo)線和電接觸部件。通過電共振測(cè)定進(jìn)行該檢測(cè)，并且可使用與計(jì)算機(jī)連接的光譜/網(wǎng)絡(luò)分析儀來測(cè)定共振頻率。
其它可行的檢測(cè)方法包括使用表面聲波裝置或電化學(xué)石英晶體微量天平。
因此，依據(jù)本發(fā)明，可將生物分子排斥分子與抗體Fab′-片段共價(jià)接枝到金屬表面上以生成對(duì)于特異性抗原的反應(yīng)性的表面。一起使用親水性聚合物和Fab′-片段使得表面具有低的非特異性結(jié)合，由此改善了免疫測(cè)定的敏感性和選擇性。此外，該技術(shù)可易于在通過表面光學(xué)構(gòu)圖來進(jìn)行的多陣列篩選中使用。
下面描述某些試驗(yàn)來舉例說明本發(fā)明，它們不限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1模型抗體是多克隆山羊抗-人F(ab′)2(Jackson ImmunoResearch，色譜純化的)，該抗體與牛、馬、和小鼠血清蛋白具有最小的交叉反應(yīng)?？乖巧V純化的人IgG(Jackson ImmunoResearch)。在使用之前，如下所述用二硫蘇糖醇(DTT，Merck)將F(ab′)2裂解成Fab′-片段在微透析管中將濃度為1.2-1.3mg/ml(100ul)的F(ab′)2與50μlHEPES/EDTA緩沖液(150mM NaCl，10mM HEPES，5mM EDTA，pH＝6.0)和10μl 0.1M DTT在HEPES/EDTA緩沖液中的溶液混合。將透析管浸泡在250ml氬氣吹掃的HEPES/EDTA緩沖液中，在室溫于氬氣氛下透析約18小時(shí)。將Fab′-片段保持在氬氣氛下，并立即用于連接。
Fab′-片段在抗體結(jié)合域的對(duì)面具有非常易于反應(yīng)的巰基。
使用表面胞質(zhì)基因組共振裝置SPRDEVI來進(jìn)行測(cè)定(VTT，Tampere)。通過真空蒸發(fā)給所用的載玻片包被上肽(4nm，用以提高金的粘著性)和金(37nm)薄膜。在臨使用之前，將載玻片在1∶1∶5 H2O2∶NH4OH∶H2O的熱溶液中清洗，用水洗滌。將載玻片經(jīng)由指數(shù)匹配油附著在SPR棱鏡上，將流動(dòng)池裝配在棱鏡上，讓10mM HEPES，150mM NaCl，pH7.2流經(jīng)該池。使用得自Milli-Q系統(tǒng)(Millipore Co.，Bedford，USA)的高純度水(18.2MΩcm)制備緩沖溶液。記錄SPR強(qiáng)度曲線，在相當(dāng)于SPR曲線的最陡點(diǎn)的固定角進(jìn)行原地測(cè)定。生物分子排斥聚合物單層是基于N-[三(羥基甲基)甲基]丙烯酰胺單體，并經(jīng)由二硫化物錨以0.12mg/ml的濃度接枝到金表面上。將Fab′片段固定在該表面上，然后將生物分子排斥分子接枝到同一表面上。
附圖5是典型的SPR傳感器圖，其表明了在表面上將不同大分子連接時(shí)SPR強(qiáng)度的改變。上面的曲線代表受體3(Fab′-片段)與生物分子排斥聚合物分子5的復(fù)合單層的形成和特性，下面的曲線代表僅由生物分子排斥聚合物分子5組成的單層。連接上Fab′-片段與生物分子排斥聚合物分子的時(shí)間分別用字母a和c表示。加入牛血清白蛋白(BSA)的時(shí)間用字母d表示。
該傳感器圖表明，在將Fab′-片段或生物分子排斥聚合物接枝到金上時(shí)，SPR強(qiáng)度首先迅速增加，帶來平臺(tái)值，然后在洗滌期(用緩沖液洗滌以b表示)將可逆結(jié)合的Fab′-片段或聚合物緩慢地解吸。此外，生物分子排斥聚合物可接枝到已經(jīng)連接上Fab′-片段的表面上(上面曲線中的點(diǎn)c)。推測(cè)，聚合物在結(jié)合的Fab′-片段之間連接，由此將金表面屏蔽，從而防止了生物分子的非特異性結(jié)合。BSA不吸附到純聚合物層上，并且對(duì)于吸附BSA的抗體/聚合物層(點(diǎn)d)，SPR強(qiáng)度僅有少量增加。某些BSA分子可能與抗體緊密吸附。將hIgG注射到Fab′/聚合物層上后(在上面曲線上的點(diǎn)e)，SPR強(qiáng)度有很大增加，但是如果抗體不包括在純聚合物層上(下面曲線中的點(diǎn)e)，可觀察到強(qiáng)度沒有任何改變。此外，可用HCl-甘氨酸溶液將抗體層再生，這表明已發(fā)生了免疫反應(yīng)(上面曲線中的點(diǎn)f)。
在1pg/ml-10μg/ml的濃度范圍內(nèi)測(cè)定了在Fab′-片段與生物分子排斥聚合物的復(fù)合單層上的hIgG的SPR結(jié)合等溫線(附圖6)。在附圖7中，由抗體Fab′-片段、生物分子排斥分子、BSA和hIgG引起的SPR強(qiáng)度變化表明了Fab′-片段的濃度與隨后金薄膜上的抗體Fab′-片段、生物分子排斥分子、BSA和hIgG的結(jié)合有關(guān)。隨著結(jié)合的抗體片段的量，接枝的生物分子排斥分子的量減少。BSA的非特異性結(jié)合幾乎與抗體濃度無關(guān)。在所試驗(yàn)的Fab′-片段濃度，hIgG的結(jié)合達(dá)到平臺(tái)值。
權(quán)利要求
1.分析方法，其中使用連接在基質(zhì)(1)的固體表面上的生物分子(3)通過分析物與生物分子的結(jié)合來檢測(cè)樣本中存在的分析物(4)，其特征在于，生物分子(3)與生物分子排斥分子(5)一起直接連接在基質(zhì)的表面上，生物分子排斥分子覆蓋生物分子(3)之間的表面以防止分析物(4)與其它生物分子的非特異性結(jié)合。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，生物分子排斥分子(5)經(jīng)由官能團(tuán)例如硫化物、二硫化物或巰基共價(jià)連接在基質(zhì)(1)的表面上。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，所述基質(zhì)是能夠誘導(dǎo)信號(hào)改變的傳感器基質(zhì)，該信號(hào)改變是與在基質(zhì)表面上的生物分子(3)結(jié)合的分析物(4)增加的指示，信號(hào)被施加到基質(zhì)(1)上，檢測(cè)改變的信號(hào)，并通過檢測(cè)的信號(hào)來測(cè)定與在基質(zhì)(1)表面上的生物分子(3)結(jié)合的分析物(4)的量。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其特征在于，除了直接連接在基質(zhì)(1)表面上的生物分子(3)和生物分子排斥分子(5)以外，還使用含有被固定的生物分子的分隔的顆粒(2)，所述顆粒經(jīng)由與在基質(zhì)(1)上的所述生物分子(3)結(jié)合的分析物(4)連接在所述基質(zhì)上。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述生物分子(3)是蛋白、肽、酶、抗體、抗體片段、抗原或抗原的一部分，并且所述生物分子經(jīng)由巰基、二硫化物或硫化物基團(tuán)連接在基質(zhì)(1)和/或顆粒(2)的表面上。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述生物分子排斥分子(5)是聚合物，尤其是親水性聚合物。
7.權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)的方法，其特征在于，基質(zhì)(1)是能夠提供表面胞質(zhì)基因組共振(SPR)現(xiàn)象的基質(zhì)，并且分析是通過SPR測(cè)定來進(jìn)行的。
8.權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)的方法，其特征在于，分析是通過厚度剪切模式共振器例如石英晶體微量天平(QCM)進(jìn)行的。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于，基質(zhì)(1)是金屬、半導(dǎo)體或?qū)щ娦跃酆衔铩?br> 10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其特征在于，生物分子(3)是免疫結(jié)合分子例如抗體或其免疫活性片段，并且所述分析是免疫分析。
11.用于分析的生物傳感器，其中包括基質(zhì)和連接在基質(zhì)(1)上的生物分子(3)，其特征在于，生物分子(3)與生物分子排斥分子(5)一起直接連接在基質(zhì)上，生物分子排斥分子覆蓋生物分子(3)之間的表面以防止分析物(4)與其它生物分子的非特異性結(jié)合。
12.權(quán)利要求11的生物傳感器，其特征在于，生物分子排斥分子(5)經(jīng)由官能團(tuán)例如硫化物、二硫化物或巰基共價(jià)連接在基質(zhì)上。
13.權(quán)利要求11或12的生物傳感器，其特征在于，所述生物分子排斥分子(5)是聚合物，尤其是親水性聚合物。
14.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的生物傳感器，其特征在于，所述生物分子排斥分子(5)在表面上自我裝配。
15.權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)的生物傳感器，其特征在于，所述基質(zhì)是這樣的類型，其能夠誘導(dǎo)信號(hào)改變，該信號(hào)改變是與在基質(zhì)表面上的生物分子(3)結(jié)合的分析物(4)增加的指示，所述傳感器還包括用于將信號(hào)發(fā)向基質(zhì)(1)的部件，和用于檢測(cè)由于和基質(zhì)(1)相互作用而導(dǎo)致的信號(hào)改變的部件。
16.權(quán)利要求15的生物傳感器，其特征在于，所述基質(zhì)(1)是表面胞質(zhì)基因組共振(SPR)相容性材料，用于發(fā)射信號(hào)的部件是光發(fā)射部件，用于檢測(cè)信號(hào)的部件是一個(gè)或多個(gè)用于檢測(cè)從基質(zhì)與電介質(zhì)材料之間的界面上反射的信號(hào)的光檢測(cè)器。
17.權(quán)利要求15的生物傳感器，其特征在于，所述生物傳感器是厚度剪切模式共振器傳感器例如石英晶體微量天平(QCM)傳感器。
全文摘要
在分析方法中，使用連接在基質(zhì)(1)的固體表面上的生物分子(3)通過分析物與生物分子的結(jié)合來檢測(cè)樣本中存在的分析物(4)。生物分子(3)與生物分子排斥分子(5)一起直接連接在基質(zhì)的表面上，生物分子排斥分子覆蓋生物分子(3)之間的表面以防止分析物(4)與其它生物分子的非特異性結(jié)合。本發(fā)明還涉及生物傳感器，其中生物分子(3)與生物分子排斥分子(5)一起直接連接在基質(zhì)的表面上，生物分子排斥分子覆蓋生物分子(3)之間的表面以防止分析物(4)與其它生物分子的非特異性結(jié)合。生物分子排斥分子(5)可以是自我裝配的親水性聚合物。使用本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例是使用表面胞質(zhì)基因組共振(SPR)的免疫分析。
文檔編號(hào)G01N21/27GK1589406SQ02823282
公開日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2002年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月24日
發(fā)明者I·維克霍姆, J·薩多夫斯基 申請(qǐng)人:拜奧方斯有限公司