專利名稱：一種總膽汁酸的測定方法及測定試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于體外定量測定血清中血清總膽汁酸含量的檢測技術(shù)，特別是一種總膽汁酸的測定方法及測定試劑。
1974年挪威科明公司采用純制的3α-羥類固醇脫氫酶(3α-HSD)成功地生產(chǎn)出第一代酶法膽汁酸試劑，使膽汁酸的測定真正進入臨床領(lǐng)域。此后，挪威科明和日本第一化學(xué)將第一代試劑改進試劑組份，采用啟動試劑，發(fā)展了第二代膽汁酸試劑。之后，日本第一化學(xué)從假單胞菌屬中提純出的3-氧-5β-類甾醇-Δ4脫氫酶(Δ4DH)與3α-羥類固醇脫氫酶(3α-HSD)偶聯(lián)開發(fā)出第三代膽汁酸測試試劑盒。
上述這幾類試劑指示原理都采用了黃遞酶和四唑蘭鹽類生成甲月替染料，由此，第三代試劑成倍地提高了色素生成，從而提高了消光系數(shù)，解決了第一代試劑在低值樣品測試時重復(fù)性差的缺點，但是，由于色素生成增多，導(dǎo)致儀器污染增加，同時，該類試劑反應(yīng)易受血液中還原性物質(zhì)及酶類干擾，如中國專利CN-1281983公開的一種血清總膽汁酸測定試劑，由于它由含有硝基四唑蘭、氧化型輔酶、黃遞酶、丙酮酸鈉、磷酸緩沖液的溶液構(gòu)成的試劑I；和由含有3α-羥類固醇脫氫酶、人血清白蛋白、EDTA、磷酸緩沖液的溶液構(gòu)成的試劑II組成，其測試原理是利用3α-羥類固醇脫氫酶，黃遞酶將膽汁酸分子脫下的氫傳遞到受體分子硝基四唑蘭，后者還原后生成蘭色化合物，供比色分析檢測。在此，采用黃遞酶和硝基四唑蘭組合，易污染比色杯及堵塞生化儀器管道，其測定靈敏度也偏低，受血液中還原性物質(zhì)及酶類干擾嚴重。
本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)的不足而提供一種使用方便、穩(wěn)定性好、靈敏度高、清除干擾明顯及對生化儀器管道無污染的一種總膽汁酸的測定方法及測定試劑。
為了達到上述目的，本發(fā)明所設(shè)計的一種總膽汁酸的測定方法，它包括采用3α-羥類固醇脫氫酶(3α-HSD)，其特征是利用3α-羥類固醇脫氫酶及硫代氧化型輔酶(Thio-NAD)特異性氧化膽汁酸，氧化后生成3-酮類固醇、還原型輔酶(NADH)和酮類固醇硫代氧化型輔酶(Thio-NADH)，在此，生成的3-酮類固醇在3α-羥類固醇脫氫酶及還原型輔酶(NADH)存在下，又生成膽汁酸及氧化型輔酶(NAD)，每循環(huán)一次比原來的反應(yīng)提高一倍靈敏度，如此反應(yīng)循環(huán)往復(fù)，從而放大微量的膽汁酸量，產(chǎn)生大量的水溶性黃色非染料酮類固醇硫代氧化型輔酶(Thio-NADH)，最后測定生成的Thio-NADH的吸光度變化，即測得膽汁酸值。
按上述總膽汁酸的測定方法，本發(fā)明提供的總膽汁酸的測定試劑，它包括0.5KU/L-100KU/L的3α-羥類固醇脫氫酶、5-500mmol/L的緩沖液、0.005％-5％的表面活性劑和0.005％-50％(不同類型穩(wěn)定劑用量差異較大)的穩(wěn)定劑，其特征是它含有0.01mmol/L-10mmol/L的硫代氧化型輔酶(Thio-NAD)。還可含有0.01-10mmol/L的還原型輔酶。為了最有效地降低測定過程中蛋白質(zhì)的干擾，所述的表面活性劑可特別選用聚氧乙烯類表面活性劑，如Brij聚氧乙烯月桂基醚系列、失水山梨醇聚氧乙烯系列、聚氧乙烯烷基醚系列、乳化劑OP系列等。當(dāng)然，也可以選用兩性離子表面活性劑，如十二烷基甜菜堿(Empigem BB)。
另外，由于NADPH價格昂貴，為了降低成本，并更好地提高其測定靈敏度和測定的精度，在上述成份中還可含有0.1KU-50 KU/L的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和葡萄糖-6-磷酸來循環(huán)生成NADPH；其所述的還原型輔酶也可以是NADH、Thio-NADH或NADPH。
另外，在此所述的緩沖液可以是Good′s緩沖液(商品名，按譯音讀)、磷酸鹽緩沖液、焦磷酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、二乙醇胺、三乙醇胺類緩沖液、碳酸鹽緩沖液、Tris類緩沖液或硼酸類緩沖液，其PH值可在3.0至11.0，緩沖液的緩沖容量0.05-1M。
所述的穩(wěn)定劑可以是Mg離子、NaCl、KCl、CaCl2、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、抗生素(氯霉素、紅霉素、青霉素、慶大霉素)、鰲合劑EDTA類、聚乙二醇、二糖類(山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖等)、多元醇(乙二醇、丙三醇、丙二醇等)、雙甘肽及抗氧化劑。
另外，在試劑中還可以加入去干擾劑(丙酮酸鈉、草酸及草酸鹽類和草氨酸)采用本發(fā)明所述的一種總膽汁酸的測定方法來測定總膽汁酸，使用方便、穩(wěn)定性好、清除干擾明顯、靈敏度與現(xiàn)有技術(shù)相比可提高20倍左右，對生化儀器管道無污染，使之在對膽汁酸的準確、快速的臨床測定中具有十分積極的現(xiàn)實意義，特別是準確的膽汁酸測定對急性肝病、慢性肝病、肝硬化、膽汁郁積、胃潰瘍、結(jié)腸疾病等的臨床診斷具有重要價值。
下面通過實施例結(jié)合附圖
對本發(fā)明作進一步的描述。
防腐劑NaN30.9g/L；鰲合劑EDTA.2Na0.5mmol/L表面活性劑Brij35 0.5g/L去干擾劑草氨酸鈉 2mmol/L試劑BPH9.0磷酸鹽緩沖液 200Mm3α-HSD 15KU/LNADH 6g/LMgCl2 2mmol/L防腐劑NaN30.6g/LBSA 2g/L鰲合劑EDTA.2Na0.5mmol/L其測定方法是采用具有雙試劑功能的自動生化分析儀，操作如下
計算膽汁酸濃度(μmol/L)＝C標準*(ΔA標本-ΔA空白)/ΔA標本*ΔA空白鰲合劑EDTA.2Na 0.5mmol/L表面活性劑土溫80 0.5g/L去干擾劑草氨酸鈉 2mmol/L試劑BPH9.0 Tris緩沖液 200Mm3α-HSD 10KU/LNADH 6g/LMgCl22mmol/L防腐劑NaN3 0.6g/LBSA 2g/L鰲合劑EDTA.2Na 0.5mmol/L穩(wěn)定劑雙甘肽 50Mm甘露醇 2％聚乙二醇 1％測試方法與實施例1相同。
NADPH 120μmol/LMgCl2 5mmol/L防腐劑NaN30.6g/LBSA 2g/L鰲合劑EDTA.2Na0.5mmol/L
權(quán)利要求
1.一種總膽汁酸的測定方法，它包括采用3α-羥類固醇脫氫酶，其特征是利用3α-羥類固醇脫氫酶及硫代氧化型輔酶(Thio-NAD)特異性氧化膽汁酸，氧化后生成3-酮類固醇、還原型輔酶(NADH)和酮類固醇硫代氧化型輔酶(Thio-NADH)，在此，生成的3-酮類固醇在3α-羥類固醇脫氫酶及還原型輔酶(NADH)存在下，又生成膽汁酸及氧化型輔酶(NAD)，如此反應(yīng)循環(huán)往復(fù)，從而放大微量的膽汁酸量，產(chǎn)生大量的水溶性黃色非染料酮類固醇硫代氧化型輔酶(Thio-NADH)，最后測定生成的Thio-NADH的吸光度變化，即測得膽汁酸值。
2.一種總膽汁酸的測定試劑，它包括0.5 KU/L-100 KU/L的3α-羥類固醇脫氫酶、5-500mmol/L的緩沖液、0.005％-5％的表面活性劑和0.005％-50％的穩(wěn)定劑，其特征是它含有0.01mmol/L-10mmol/L的硫代氧化型輔酶(Thio-NAD)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種總膽汁酸的測定試劑，其特征是它含有0.01-10mmol/L的還原型輔酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種總膽汁酸的測定試劑，其特征是所述的表面活性劑特別選用聚氧乙烯類表面活性劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種總膽汁酸的測定試劑，其特征是它還含有X至Y份的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種總膽汁酸的測定試劑，其特征是它還含有0.1KU-50 KU/L的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和葡萄糖-6-磷酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種總膽汁酸的測定試劑，其特征是所述的還原型輔酶可以是NADH、NADP或NADPH。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種總膽汁酸的測定試劑，其特征是所述的還原型輔酶可以是NADH、NADP或NADPH。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種總膽汁酸的測定試劑，其特征是所述的還原型輔酶可以是NADH、NADP或NADPH。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種總膽汁酸的測定試劑，其特征是所述的還原型輔酶可以是NADH、NADP或NADPH。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種總膽汁酸的測定試劑及測定方法,它是利用3α－羥類固醇脫氫酶及硫代氧化型輔酶(Thio－NAD)特異性氧化膽汁酸,氧化后生成3－酮類固醇、還原型輔酶(NADH)和酮類固醇硫代氧化型輔酶(Thio－NADH),在此,生成的3－酮類固醇在3α－羥類固醇脫氫酶及還原型輔酶(NADH)存在下,又生成膽汁酸及氧化型輔酶(NAD),如此反應(yīng)循環(huán)往復(fù),從而放大微量的膽汁酸量,產(chǎn)生大量的水溶性黃色非染料酮類固醇硫代氧化型輔酶(Thio－NADH),最后測定生成的Thio－NADH的吸光度變化,即測得膽汁酸值。采用本發(fā)明來測定總膽汁酸,使用方便、穩(wěn)定性好、清除干擾明顯、靈敏度與現(xiàn)有技術(shù)相比可提高20倍左右,對生化儀器管道無污染,使之在對膽汁酸的準確、快速的臨床測定中具有十分積極的現(xiàn)實意義。
文檔編號G01N33/52GK1378077SQ0211940
公開日2002年11月6日 申請日期2002年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月10日
發(fā)明者肖洪武 申請人:肖洪武