專利名稱：惡性擴(kuò)散癌發(fā)作的早期預(yù)測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到用于最終發(fā)育成惡性擴(kuò)散癌的早期預(yù)測(cè)的預(yù)后(prognostic)方法。
背景技術(shù)：
通過(guò)基因分析鑒定癌癥前期組織所有的瘤確信源自業(yè)已經(jīng)受基因改變的細(xì)胞，繼之以克隆擴(kuò)展(clonal expansion)。這些基因改變包括原癌基因的激活和腫瘤抑制基因的失活。鑒定伴隨病理學(xué)發(fā)展的特異基因變化允許描述許多腫瘤的分子發(fā)育模型，包括口腔癌。這些發(fā)展模型提供輔助診斷和檢測(cè)人腫瘤的分子標(biāo)記。
分子分析已經(jīng)革新了查看原發(fā)人腫瘤中特異基因變化的能力。強(qiáng)大的基于PCR的技術(shù)允許使用常規(guī)制備的植入石蠟的組織樣品，以用于DNA提取和隨后的基因分析。可以擴(kuò)增從這些樣品提取的DNA以揭示各種基因改變，包括等位損失。這類等位損失(染色體缺失)是包含于損失區(qū)內(nèi)的關(guān)鍵腫瘤抑制基因失活的標(biāo)記。
成熟腫瘤中，腫瘤抑制基因需要兩步失活過(guò)程，這里必需敲除雙親等位基因以便腫瘤發(fā)育。通常地，一個(gè)等位基因的點(diǎn)突變繼之以第二等位基因的缺失和腫瘤抑制功能完全喪失。這些由微衛(wèi)星分析鑒別的等位損失缺失代表腫瘤抑制基因失活的普通第二失活步驟。實(shí)際上，等位損失(或缺失)可通過(guò)采用能夠區(qū)分正常DNA中母源和父源等位基因的高度多態(tài)標(biāo)記測(cè)定。然后這種樣品(pattern)可以與腫瘤DNA比較，這里重組或缺失表示為母源或父源等位基因的損失(也稱為L(zhǎng)OH雜合性的損失)。最近，這種作圖過(guò)程已經(jīng)隨著高度多態(tài)并位于整個(gè)人基因組中的微衛(wèi)星標(biāo)記(小DNA重復(fù)單位)的到來(lái)而革新。例如，人們可以測(cè)試在兩條染色體臂上的關(guān)鍵腫瘤抑制基因部位。該區(qū)的一個(gè)位于染色體臂9p并含有稱為p16(MTS-1或CDKN2)的關(guān)鍵腫瘤抑制基因。這種關(guān)鍵的細(xì)胞周期抑制劑通過(guò)大多數(shù)原發(fā)癌中的點(diǎn)突變、缺失和甲基化失活。在染色體區(qū)3p21可以進(jìn)行第二分析，其在與吸煙有關(guān)腫瘤的最頻繁缺失區(qū)中。盡管許多基因已經(jīng)從3p區(qū)分離，在原發(fā)腫瘤或細(xì)胞系中沒(méi)有候選基因經(jīng)常地失活。重要地，9p和3p損失都是在惡性擴(kuò)散癌發(fā)展中鑒別的最早的基因變化。
具有頭和頸癌的病人常常伴有氣消化道的第二原發(fā)腫瘤。頭和頸癌的基本的基因研究顯示口腔中單轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以遍及粘膜，引起大面積與克隆有關(guān)和轉(zhuǎn)化(clonally related and transformed)細(xì)胞。這里有進(jìn)一步的證據(jù)，當(dāng)在一個(gè)病人中產(chǎn)生兩種損害時(shí)，它們通常在起源上是克隆的。例如，具有頭和頸癌的病人通常具有大片的可以通過(guò)簡(jiǎn)單的活組織檢查直接化驗(yàn)的異常細(xì)胞。
參見(jiàn)，例如，Califano等，Genetic Progression Model for Headand Neck Cancer.Cancer Research 56(11)2488-2493(1996)；Sidransky，Nucleic Acid-based Methods for detection of Cancer.Science 278(5340)1045-058(1997)；Rosin等，Use of AllelicLoss to Predict Malignant Risk for Low-grade Oral EpithelialDysplasia，Clinical Cancer Research 6357362(2000)。
于是，已知最終發(fā)育成惡性擴(kuò)散癌的的早期預(yù)后可以通過(guò)來(lái)自可疑部位組織的基因分析實(shí)現(xiàn)，提供簡(jiǎn)單的臨床方案是非常希望的，這類方案在其它的可視跡象開(kāi)始之前很久，鑒別這類可疑部位的位置。
現(xiàn)有領(lǐng)域Mashberg方案鑒別和描述上皮組織上可疑部位的體內(nèi)診斷篩選試驗(yàn)是已知的。這種篩選試驗(yàn)，采用甲苯胺藍(lán)O(TBO)染料以選擇性地染色癌和癌癥前期組織，一般描述在Mashberg的美國(guó)專利4321251和Tucci等的美國(guó)專利5372801中。最近研發(fā)了試劑盒，它使得臨床醫(yī)師快速和容易地進(jìn)行試驗(yàn)成為可能，作為其它常規(guī)牙科或醫(yī)學(xué)檢查的一部分，從而在病人是無(wú)癥狀時(shí)或者當(dāng)發(fā)育異常損害太小以致在普通目視檢查中可能遺漏時(shí)，鑒別和/或描述可疑部位。一旦通過(guò)Mashberg方案鑒別出可疑的發(fā)育異常損害，采集合格(regular)的活組織檢查樣品并且進(jìn)行常規(guī)的組織學(xué)檢查，以確定損害是惡性的還是癌癥前期的。進(jìn)行該試驗(yàn)的試劑盒，含有適當(dāng)數(shù)量和濃度的預(yù)先混合的染料和漂洗溶液，由Zila有限公司許可，并且在加拿大、澳大利亞和歐洲商業(yè)上以O(shè)raTestM商標(biāo)銷售。以后確定其它的陽(yáng)離子染料同樣有效(參見(jiàn)，例如Pomerantz的美國(guó)專利5882672)，這類染料的選擇性標(biāo)記作用歸因于它們通過(guò)癌性和癌癥前期細(xì)胞線粒體的攝取和保留。
實(shí)施例1臨床試驗(yàn)方案本實(shí)施例舉例說(shuō)明Mashberg方案的常規(guī)實(shí)踐。
臨床試驗(yàn)溶液的制備TBO(例如，按照本發(fā)明人美國(guó)專利6086852的實(shí)施例1制備)，覆盆子增香劑(IFF覆盆子IC563457)，三水醋酸鈉緩沖劑和H2O2(30％USP)防腐劑(參見(jiàn)美國(guó)專利5372801)，溶于純水(USP)，冰醋酸和SD18乙醇，產(chǎn)生TBO試驗(yàn)溶液，組成如表A所示
表A組分重量％TBO 1.00香料 .20緩沖劑 2.45防腐劑 .41醋酸4.61乙醇7.48水83.85100.00制備在純水、苯甲酸鈉防腐劑和覆盆子香料中1wt％醋酸的預(yù)漂洗和后漂洗試驗(yàn)溶液。
臨床方案給病人披上圍布以保護(hù)衣物。估計(jì)會(huì)有咳出物，故給病人提供一個(gè)10-oz.的杯子，其可傾倒于感染性廢物容器或者其內(nèi)容物可直接倒進(jìn)洗滌盆下水道中央，以免污染洗滌盆。將環(huán)境表面或可能被污染的物品罩起或從試驗(yàn)區(qū)移走。
進(jìn)行口腔癌的目視檢查，不使用任何會(huì)使軟組織產(chǎn)生劃痕或切口的器械。在軟組織和牙齒的預(yù)染色表面作出標(biāo)記。
讓病人用約15ml預(yù)漂洗溶液漱口約20秒然后咳出，吐去過(guò)多的唾液使口腔環(huán)境恒定。然后再用預(yù)漂洗溶液重復(fù)此步驟。
然后，病人用水漂洗和漱口20秒，咳出。
然后，病人用30ml TBO試驗(yàn)溶液漂洗和漱口1分鐘，咳出。
然后，病人用15ml后漂洗溶液漂洗20秒，咳出。然后重復(fù)這一步。
病人接著用水漂洗和漱口20秒，咳出。然后重復(fù)這一步。
接著對(duì)口腔進(jìn)行觀察，必要時(shí)使用適宜的軟組織檢測(cè)技術(shù)，包括退縮(retraction)、平衡光照和放大(well-balanced lightingand magnification)。記錄染上藍(lán)色的可疑損害的位置、大小、形態(tài)、顏色和表面特征。
為了減少假陽(yáng)性，請(qǐng)病人在10-14天后返回重復(fù)上述方案。在此期間讓時(shí)間去治愈任何第一次檢查時(shí)存在的潰瘍性或創(chuàng)傷性損害或刺激性病源。第二次檢查之后，在第一次檢查確定的可疑區(qū)域出現(xiàn)的陽(yáng)性染色被認(rèn)為是癌或癌癥前期組織的指示(indication)，應(yīng)進(jìn)行活組織檢查來(lái)確認(rèn)這一結(jié)論。
早期無(wú)核紅細(xì)胞(erythroplastic)損害染上藍(lán)色，經(jīng)常為點(diǎn)彩(stippled)或片狀(patchy)圖樣。但是，舌背上的不規(guī)則乳頭縫被染上藍(lán)色是正常的，不表示陽(yáng)性。保持藍(lán)色但不認(rèn)為是陽(yáng)性的其它區(qū)域包括每顆牙齒的牙斑、牙齦邊緣，從舌背保留的染色移走的染料在軟腭上形成的滲出染色，以及容易確診的潰瘍性損害。在任何情形下，當(dāng)某一損害高度可疑，但用本檢測(cè)不呈陽(yáng)性染色時(shí)，進(jìn)行活組織檢查仍是必要的。
“假陽(yáng)性”直至現(xiàn)在才明白Mashberg方案可提供“假陽(yáng)性”指示，即，在后來(lái)的常規(guī)組織學(xué)檢查中并不確認(rèn)癌或癌癥前期的癥狀的指示，花費(fèi)了相當(dāng)大的努力以減少這些假陽(yáng)性的發(fā)生頻率，例如，通過(guò)重復(fù)Mashberg專利描述的步驟以及通過(guò)Tucci專利描述的特殊的染料制劑。
發(fā)明簡(jiǎn)述然而，現(xiàn)已確定，在由TBO和其它陽(yáng)離子體外活體染料染色的可疑的損害中，可鑒別表示最終發(fā)育成惡性擴(kuò)散癌的的克隆基因變化，盡管這類染色組織的常規(guī)組織學(xué)檢查未確認(rèn)該組織是癌性的或癌癥前期的。從而，在Mashberg方案中先前認(rèn)定為“假陽(yáng)性”的指示，很大程度上是基因改變的最早期指示，這種改變是惡性擴(kuò)散癌發(fā)育的前身。因此，Mashberg類型染色染料方案是確定什么組織應(yīng)該進(jìn)行基因分析的合理可靠的途徑。
于是，考慮到其最廣泛的方面，本發(fā)明人提供一種用于最終發(fā)育成惡性擴(kuò)散癌的早期預(yù)測(cè)的預(yù)后方法，它結(jié)合現(xiàn)有領(lǐng)域基因分析技術(shù)和現(xiàn)有領(lǐng)域選擇性染色染料技術(shù)，由Mashberg方案例示的，的教導(dǎo)。本發(fā)明人的方法包括施用由腫瘤前的細(xì)胞線粒體選擇性保留的染色染料至組織，通過(guò)目視檢查所述組織染色的組織部位，鑒別克隆片(clonal patch)，在所述克隆片的部位切除組織，并確定從所述切除組織提取的DNA是否顯示等位損失或腫瘤抑制基因的突變。
提供下列實(shí)施例以向本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員舉例說(shuō)明本發(fā)明人的發(fā)明及其目前優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)踐。這些實(shí)施例并不理解成限制本發(fā)明的范圍，發(fā)明范圍僅由所附權(quán)利要求限定。
實(shí)施例1Mashberg類型臨床方案臨床試驗(yàn)溶液的制備TBO(例如，美國(guó)專利6086852實(shí)施例1的產(chǎn)品)，覆盆子增香劑(IFF覆盆子IC563457)，三水醋酸鈉緩沖劑和H2O2(30％ USP)防腐劑(參見(jiàn)美國(guó)專利5372801)，溶于純水(USP)，冰醋酸和SD18乙醇，產(chǎn)生TBO試驗(yàn)溶液，組成如表A所示表A組分重量％TBO1.00香料.20緩沖劑 2.45防腐劑 .41醋酸 4.61乙醇 7.48水83.85100.00制備在純水、苯甲酸鈉防腐劑和覆盆子香料中1wt％醋酸的預(yù)漂洗和后漂洗試驗(yàn)溶液。
臨床方案給病人披上圍布以保護(hù)衣物。估計(jì)會(huì)有咳出物，故給病人提供一個(gè)10-oz.的杯子，其可傾倒于感染性廢物容器或者其內(nèi)容物可直接倒進(jìn)洗滌盆下水道中央，以免污染洗滌盆。將環(huán)境表面或可能被污染的物品罩起或從試驗(yàn)區(qū)移走。
進(jìn)行口腔癌的目視檢查，不使用任何會(huì)使軟組織產(chǎn)生劃痕或切口的器械。在軟組織和牙齒的預(yù)染色表面作出標(biāo)記。
讓病人用約15ml預(yù)漂洗溶液漱口約20秒然后咳出，吐去過(guò)多的唾液使口腔環(huán)境恒定。然后再用預(yù)漂洗溶液重復(fù)此步驟。
然后，病人用水漂洗和漱口20秒，咳出。
然后，病人用30ml TBO試驗(yàn)溶液漂洗和漱口1分鐘，咳出。
然后，病人用15ml后漂洗溶液漂洗20秒，咳出。然后重復(fù)這一步。
病人接著用水漂洗和漱口20秒，咳出。然后重復(fù)這一步。
接著對(duì)口腔進(jìn)行觀察，必要時(shí)使用適宜的軟組織檢測(cè)技術(shù)，包括退縮(retraction)、平衡光照和放大(well-balanced lightingand magnification)。記錄染上藍(lán)色的可疑損害的位置、大小、形態(tài)、顏色和表面特征。
請(qǐng)病人在10-14天后返回重復(fù)上述方案。在此期間讓時(shí)間去治愈任何第一次檢查時(shí)存在的潰瘍性或創(chuàng)傷性損害或刺激性病源。第二次檢查之后，在第一次檢查確定的可疑區(qū)域出現(xiàn)的陽(yáng)性染色被認(rèn)為是癌或癌癥前期的指示。
早期無(wú)核紅細(xì)胞損害染上藍(lán)色，經(jīng)常為點(diǎn)彩或片狀圖樣。但是，舌背上的不規(guī)則乳頭縫被染上藍(lán)色是正常的，不表示陽(yáng)性。保持藍(lán)色但不認(rèn)為是陽(yáng)性的其它區(qū)域包括每顆牙齒的牙斑、牙齦邊緣，由于從舌背保留的染色移走的染料而在軟腭上形成的滲出染色，以及容易確診的潰瘍性損害。然而，在任何情形下，當(dāng)某一損害高度可疑，但用本檢測(cè)不呈陽(yáng)性染色時(shí)，采集活組織并進(jìn)行分子分析仍是必要的。
實(shí)施例2基因改變分析從各種臨床部位獲得58個(gè)樣品。這些樣品中有兩個(gè)的分析是不可能的，由于用于進(jìn)一步分子分析的玻片上只有不充分的材料。在剩余的56例中，采用激光捕獲顯微解剖鏡從正常組織仔細(xì)地解剖腫瘤細(xì)胞(癌情形下)，或者從正常組織解剖上皮(其它情形下)。這允許細(xì)胞分離和DNA提取，以便隨后在三種關(guān)鍵部位的微衛(wèi)星分析。在15例中，DNA不充分，進(jìn)一步的分析是不可能的。為試驗(yàn)選擇的兩個(gè)部位(D9S171和D9S736)在含p16基因的染色體區(qū)9p21。第三標(biāo)記(D3s1067)位于染色體3p21。在余下41例中不具備病理診斷知識(shí)下盲法進(jìn)行所有的分子研究。
此項(xiàng)研究中，分別鑒別染藍(lán)色的損害和活組織檢查鄰近但是不在染藍(lán)色區(qū)內(nèi)的損害。因此，在許多情形下人們能夠直接試驗(yàn)染色區(qū)以及相鄰的非染色區(qū)。所有41例中的這些關(guān)鍵標(biāo)記的微衛(wèi)星分析顯示，在事實(shí)上一切具有癌(cancer)和原位癌(carcinoma in situ)的病例中存在LOH(染色體缺失)。此外，許多發(fā)育異常的損害和非發(fā)育異常損害，以及未知(非病理診斷)類別中的那些，也隱匿克隆基因的變化。
在出自12例癌病例的12例中，正如所料鑒別出克隆基因的變化。在所有四例原位癌或嚴(yán)重的發(fā)育異常中，也鑒別出克隆改變。在57％的發(fā)育異常(7中有4)例和85％非發(fā)育異常(14中有12)例中，在這些標(biāo)記的一項(xiàng)或多項(xiàng)發(fā)現(xiàn)克隆基因的變化。在具有未知組織學(xué)的情形下，鑒別出25％(4中有1)例克隆基因變化。整個(gè)地，通過(guò)微衛(wèi)星分析在80％(41中有33)的損害中鑒別出克隆變化。這種分子分析決定性地表示約80％的Mashberg類型方案鑒別的損害是克隆的。
結(jié)論先前的研究暗示僅僅具有克隆基因變化的損害有可能發(fā)展成癌。所有這些研究暗示僅僅具有9p和/或3p損失的損害會(huì)發(fā)展成癌，沒(méi)有這些變化的損害事實(shí)上從不發(fā)展。在腫瘤前的損害中，發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)明顯地升至事實(shí)上的100％，如果存在其它更多提前的基因變化(例如，17p損失或p53突變)。
發(fā)展成具有3p和/或9p損失的癌的風(fēng)險(xiǎn)在28-75％變化。然而，在最低發(fā)展頻率(28％)的研究中，預(yù)期試驗(yàn)的116名病人在參加這項(xiàng)研究之前未患癌癥。其它兩項(xiàng)研究包括先前切除原發(fā)腫瘤并反映較高比例或發(fā)展(45-78％)的123名病人。在更近的研究中，作者做出了清楚的推薦，切除所有具有兩個(gè)或多個(gè)等位基因損失的可疑區(qū)。
因此，本實(shí)施例確定了這樣的事實(shí)，在此病人群體中由甲苯胺藍(lán)染料鑒別的腫瘤前變化是克隆的，因此在發(fā)展成癌的途徑中。盡管并不確認(rèn)每一個(gè)鑒別的損害會(huì)發(fā)展成惡性擴(kuò)散癌，很清楚，在這些病人中初期的克隆擴(kuò)展已經(jīng)開(kāi)始了?；谏鲜鲅芯?，保守的估計(jì)提示這些損害的50-75％有可能發(fā)展成惡性擴(kuò)散癌。因此，這些克隆片將這些病人置于極高危險(xiǎn)種類，并且有理由徹底切除受影響區(qū)。
源自此實(shí)施例的另一關(guān)鍵點(diǎn)涉及染色和非染色區(qū)問(wèn)題。絕大多數(shù)情形下，染色和非染色區(qū)共同具有相同的基因變化?；陬^和頸癌克隆發(fā)展模型的說(shuō)明，很清楚，大多數(shù)復(fù)發(fā)頭和頸癌的病人具有大片的異常上皮。遠(yuǎn)離染色區(qū)的活組織檢查亦顯示同樣的克隆基因變化，這并不是令人驚奇的。重要地，存在至少三個(gè)病例，這里僅僅來(lái)自染色區(qū)的活組織檢查揭示克隆基因變化，而非染色區(qū)并不顯示這些變化。它可能歸因于這些病人中較小克隆片的存在，并且進(jìn)一步建議采用染色染料鑒別異常損害。
清楚地，Mashberg類型方案通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)學(xué)分析鑒別具有原位癌的病人。顯著地，極大多數(shù)其它缺失損害在顯微鏡下顯示正常和發(fā)育異常(會(huì)從Mashberg方案另外歸入“假陽(yáng)性”)，但是這些損害仍然隱匿了關(guān)鍵的癌發(fā)育必需的克隆基因變化。
因此，Mashberg類型方案代表檢測(cè)極可能發(fā)展成癌的癌以及損害的有效方法。在這點(diǎn)上，活組織檢查染色鑒別的損害是適當(dāng)?shù)?，它可?a)導(dǎo)致治愈，因?yàn)槠渲械膿p害可通過(guò)進(jìn)一步的切除完全切除，或者(b)通過(guò)記錄克隆基因的發(fā)展將病人置于適當(dāng)?shù)母呶ｎ悇e。
本發(fā)明人的發(fā)明已經(jīng)公開(kāi)到使本領(lǐng)域熟練人員理解和實(shí)施它的程度，并且確定了目前優(yōu)選實(shí)施方案。
權(quán)利要求
1.一種用于最終發(fā)育成惡性擴(kuò)散癌的早期預(yù)測(cè)的預(yù)后方法，所述的方法包括(a)向組織施用被瘤和腫瘤前細(xì)胞線粒體選擇性保留的染色染料；(b)通過(guò)目視檢查所述組織尋找染色組織部位，鑒別所述組織的克隆片；(c)切除所述克隆片部位的組織；(d)確定從所述切除組織提取的DNA是否顯示等位損失或者腫瘤抑制基因的突變。
全文摘要
一種用于最終發(fā)育成惡性擴(kuò)散癌的早期預(yù)測(cè)的預(yù)后方法，包括通過(guò)施用選擇性染色可疑的癌性和癌癥前期組織部位的染料鑒別這類部位，然后通過(guò)分子基因分析確定這類部位的DNA是否顯示等位損失或者腫瘤抑制基因的突變。
文檔編號(hào)G01N1/30GK1399563SQ00816123
公開(kāi)日2003年2月26日 申請(qǐng)日期2000年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月26日
發(fā)明者道格拉斯·D·伯克特 申請(qǐng)人:日拉公司