專利名稱：有效用作標記試劑的基于若丹明的熒光團的制作方法
廣言之，本發(fā)明涉及標記用于熒光偵測之有機化合物之方法。更為特別地，本發(fā)明涉及基于若丹明(Rhodamine)的熒光團，其可經(jīng)由與有機分子進行衍生而變得有用，并可應(yīng)用于標記生物分子，例如合成寡核苷酸和蛋白質(zhì)。熒光團為單一異構(gòu)體、穩(wěn)定并在標準亞磷酸鹽化學中具有活性，且其綴合物保有熒光。
熒光染料具有作為偵測標記之用途早已發(fā)現(xiàn)而廣泛應(yīng)用于分子生物學、細胞生物學以及分子遺傳學中。特別是，將熒光標記之寡核苷酸用途擴展至DNA測序、熒光原位雜交(FISH)、雜交分析，包括核酸列陣(“DNA芯片”)、探針俘獲分析、熒光極性研究、以及DNA擴增分析聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、等溫擴增分析(鏈置換擴增(SDA))、基于核酸序列的擴增(NASBA)、自動維持序列擴增(3SR)、并擴展至熒光引物及/或探針檢測(“Taqman”分析)。
目前自動化DNA測序方法系使用多重熒光標記，對單一凝膠泳道或毛細管中之堿基序列并行檢測。大部分通用于測序之熒光染料系經(jīng)制成異構(gòu)體，包括若丹明家族者之混合物。(關(guān)于若丹明染料，使用染料化學學會，第2版，1971，顏色指標所述之編號體系)。單一異構(gòu)體染料標記對高解析技術(shù)，例如DNA定位和毛細電泳優(yōu)選，因為熒光團中不同異構(gòu)體形式之間，在光譜性質(zhì)中存有些微的差異。此外，若使用異構(gòu)體混合物時，經(jīng)熒光團標記之5-和6-異構(gòu)體引物(例如5-和6-羧基四甲基若丹明)可導致條帶加寬(亨格等人，分析生物化學，238，165-170，1996)。因此，在制備用于DNA測序之標記寡核苷酸的熒光染料標記試劑之前，必須先將單一異構(gòu)體形式純化出。
在合成引物(例如使用熒光素亞磷酰胺試劑之熒光素)過程期間，部分的熒光染料標記可附著至寡核苷酸之5’端。此等染料亞磷酰胺在亞磷酸鹽化學條件下可適當?shù)胤磻?yīng)，因為在熒光素的部分上兩個活性氧基團受到保護，可防止亞磷酰胺與熒光素間可能的副反應(yīng)。此外，以保護基修飾使3-位置羧酸官能基保持在封閉環(huán)之內(nèi)酯形式中，以避免質(zhì)子從羧酸酯供給至N，N-二異丙基氨基亞磷酰胺。質(zhì)子化可將二異丙基氨基的部分轉(zhuǎn)化成良好的脫離基，其可分解成該試劑。一部分合成的若丹明亞磷酰胺(例如美國專利案號5,231,191，1993年7月27日獲準，發(fā)明者吳等人)具有3-位置羧酸官能基，其系處于封閉(內(nèi)酯)與開放(酸)形式間的平衡。當該試劑使用在寡核苷酸合成中時，“酸性”環(huán)境將有利于羧酸鹽—鎓陽離子形式的形成。從羧酸的部分將質(zhì)子供給至N，N-二異丙基氨基亞磷酰胺可發(fā)生，并導致試劑的不穩(wěn)定，折抵寡核苷酸標記的效率。
在目前實用標準方法中，將經(jīng)標記寡核苷酸從固相支持物斷裂出并以濃的水性氨將保護基移除期間，部分的熒光染料標記(例如熒光素及相關(guān)衍生物)可保留其熒光性質(zhì)。然而若丹明家族中的染料容易受到氨處理的修飾，顯著地降低其熒光性質(zhì)。因此，一般的操作是在自動化合成、裂解和去質(zhì)子化后，將若丹明型式染料附著至業(yè)已經(jīng)連接子官能性(例如伯胺)修飾之寡核苷酸之5’端。在經(jīng)5’-若丹明染料標記之寡核苷酸總合成中，此染料標記需要另外的步驟和手工勞動，招致較大的花費和不便。
于本發(fā)明之一方面中，致熒光化合物及組合物是以若丹明為基礎(chǔ)。于若丹明中，3-位置有羧酸酯。本發(fā)明之致熒光化合物，或熒光團中，3-位置之羧酸可轉(zhuǎn)化成完全取代的酰胺。酰胺氮上的取代基為一可有效阻斷內(nèi)酰胺環(huán)形成的基團。酰胺氮上之另一取代基則為有用于制作、或包括所需之衍生物。此等有用之熒光團衍生物有助于標記有機化合物以進行熒光檢測。優(yōu)選之有機化合物為生物分子，例如肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷酸、寡核苷酸、或核酸聚合物。當合成標記寡核苷酸時，綴合作用優(yōu)選是經(jīng)由亞磷酰胺鍵結(jié)進行，且在合成標記肽類或作標記時，其可經(jīng)由各種的已知蛋白質(zhì)綴合化學來進行。
下式A說明本發(fā)明的基于若丹明的熒光團的部分，其中Ra和Ra’二者為酰胺氮上之非氫取代基。
式A 于式A結(jié)構(gòu)中，R1和R10各自為氫或鹵素；R2、R5、R6和R9各自為氫、烷基、羧基烷基、氨基烷基、烷基醚、烷基硫醚、鹵素或烷氧基；R3、R4、R7和R8各自為氫、烷基、羧基烷基、氨基烷基、環(huán)烷基、芳基、或烷基、環(huán)烷基、或芳基，其經(jīng)取代以致具有另外的官能基，包括，但非限于烷氧基、硫酸酯、磷酸酯、或硝酸酯；R2和R3一起為烷基鏈，各具有從2至5個碳原子，并將2’碳連結(jié)至3’碳上所鍵結(jié)之氮上；R9和R10一起為烷基鏈，各具有從2至5個碳原子，并將7’碳連結(jié)至6’碳上所鍵結(jié)之氮上；R4和R5一起為烷基，各具有從2至5個碳原子，并將4’碳連結(jié)至3’碳上所鏈結(jié)之氮上；R6和R7一起為烷基，各具有從2至5個碳原子，并將5’碳連結(jié)至6’碳上所鍵結(jié)之氮上；R3和R4一起形成主鏈上至多可達5個原子之烷基或烯基鏈，其是由碳及一個或更多個選自含有氮或氧之雜原子集團所組成，且該鏈之二終端價鍵系鍵結(jié)至3’碳上所鍵結(jié)之氮上R7和R8一起形成主鏈上至多可達5個原子之烷基或烯基鏈，其是由碳以及一個或更多個選自含有氮或氧之雜原子集團所組成，且該鏈之二終端價鍵系鍵結(jié)至6’碳上所鍵結(jié)之氮上；R11、R12、R13、和R14各自為氫或鹵素。
Ra取代基之一功能為阻斷內(nèi)酰胺環(huán)的形成，因而其可選自各種的取代基，例如烷基、羧基烷基、氨基烷基、環(huán)烷基、芳基、或芳烷基。取代基作為對抗內(nèi)酰胺環(huán)之形成的阻斷基團，其大小可有相當?shù)淖兓?br> 鍵結(jié)至所需綴合物質(zhì)的形成是經(jīng)由Ra’取代基或Ra’取代基之衍生物。典型上，可選取為Ra’有烷基、羧基烷基、氨基烷基、環(huán)燒基、芳烷基，但優(yōu)選地所選取之Ra’應(yīng)包括化學上活性官能基，用以進一步進行衍生作用。適當?shù)墓倌芑邪奉悺⒋碱?、鹵素、羧酸酯類、肼類、硫氫基類、硫酸酯類、磷酸酯類、或硝酸酯類。Ra’取代基具有化學上反應(yīng)性官能基之最簡形式可為-CH2CH2OH，其中羥基是用來制備所需之各種的衍生物或綴合物。
因為本發(fā)明之化合物優(yōu)選是具有經(jīng)由3-位置羧基鍵結(jié)之官能基，該鍵結(jié)可將3-位置羧酸酯轉(zhuǎn)化成非酸性官能基(例如酰胺)，其可賦予衍生物，如亞磷酰胺類優(yōu)選之穩(wěn)定性。籍助于經(jīng)由3-位置羧基之化學，本發(fā)明之染料以及標記衍生物為單一異構(gòu)體形式，不似該等在制備寡核苷酸標記試劑之前，需要從5-和6-位置羧基若丹明之混合物純化出之化合物。因為本發(fā)明化合物具有一個可完全取代的酰胺氮，所以該染料可避免被轉(zhuǎn)化成非熒光性內(nèi)酰胺形式。本發(fā)明之亞磷酰胺類以及經(jīng)衍生之固相支持物基質(zhì)試劑使經(jīng)若丹明標記之寡核苷酸得以有效、全自動的合成。


圖1說明電泳后聚丙烯酰胺凝膠之相片，其中泳道含有根據(jù)本發(fā)明之經(jīng)標記寡核苷酸。(泳道A為聚-dT 9聚體，泳道B為聚-dT 10聚體，泳道C為聚-dT 11聚體，及泳道D為聚-dT 11聚體，并且泳道A、C及D系在合成期間于5’結(jié)合端被標記，而泳道B在合成期間于3’-端被標記)；以及，圖2為根據(jù)本發(fā)明經(jīng)熒光若丹明標記之蛋白質(zhì)電泳后，聚丙烯酰胺凝膠之相片。
本發(fā)明之一方面系提供一種可綴合至有機分子，更優(yōu)選為生物分子之基于若丹明的染料。據(jù)信已先述于化學或生物化學期刊中之化合物無一具有可經(jīng)由將若丹明3-位置上之羧基鍵結(jié)至生物分子，例如寡核苷酸及蛋白質(zhì)之官能基。此等以若丹明為基礎(chǔ)之染料較易合成為單一異構(gòu)體衍生物，且其在標記用于DNA測序時之寡核苷酸是重要的。相反地，傳統(tǒng)上所使用的羧基若丹明類，在標記衍生物被合成之前，需要將混合的異構(gòu)體純化成單一異構(gòu)體形式。此外，本發(fā)明之以若丹明為基質(zhì)之化合物具有衍生自3-位置羧酸酯之酰胺鍵聯(lián)，其系將羧酸酯基團轉(zhuǎn)化成非酸性功能。如此可改善自其所衍生得到之亞磷酰胺的穩(wěn)定性。完全取代酰胺之氮可防止該染料轉(zhuǎn)化成非熒光性之內(nèi)酰胺形式。
圖1和2說明本發(fā)明(化合物4-9)六個實施方案之標記用途，其制備可經(jīng)由下文所述實施例4-10所示范。
圖1中，經(jīng)若丹明標記之寡核苷酸是在19％聚丙烯酰胺、10M尿素、89mM Tris-硼酸鹽、2mM乙二胺四乙酸(EDTA)(TBE緩沖液)凝膠中，使用寡核苷酸凝膠之標準純化條件(薩姆布魯克等人，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版，1989)進行電泳。將該凝膠在紫外線箱上照射，并使用配備有若丹明濾片(NucleoTech公司，福斯特城，加利福尼亞)之NucleoVision CCD照相機系統(tǒng)捕捉熒光影像。泳道A含有合成期間使用基于若丹明的命名為化合物5之實施方案標記于5’端之聚dT9聚體。泳道B含有合成期間使用基于若丹明之實施方案化合物7標記于3’端之聚dT 10聚體。泳道C含有合成期間使用化合物4標記于5端之聚dT 11聚體。泳道D含有合成期間使用化合物6標記于5’端之聚dT 11聚體。
圖2中，將小牛血清白蛋白與指定之標記試劑綴合，并在十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(含5％堆積凝膠之15％聚丙烯酰胺、25mMTris、250mM甘氨酸、0.1％ SDS緩沖液)中于標準條件下(薩姆布魯克等人，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版，1989)進行電泳。將該凝膠在紫外線箱上照射，并使用配備有若丹明濾片(NucleoTech公司，福斯特城，加利福尼亞)之NucleoVision CCD照相機系統(tǒng)捕捉熒光影像。泳道A顯示以化合物8綴合之小牛血清白蛋白。泳道B顯示以化合物9綴合之小牛血清白蛋白。
如圖1所示，本發(fā)明經(jīng)染料衍生之固體支持物基質(zhì)容許3’標記之寡核苷酸自動合成；染料亞磷酰胺類則是在寡核苷酸合成期間容許5’端標記。此外，本發(fā)明可使得自動化寡合成期間，將經(jīng)染料標記之dU殘基加至寡核苷酸序列中之任意點。
實施本發(fā)明所使用之若丹明染料的熒光激發(fā)與發(fā)射性質(zhì)系與使用于商業(yè)上可得之自動化熒光DNA測序以及熒光分析檢測儀器中之若丹明相似，并較之習用之熒光素衍生物具有改善之光譜分離。本發(fā)明之衍生物及綴合物在可測得波長之光線的激發(fā)下保有其熒光。通常，本發(fā)明之衍生物以及綴合物可經(jīng)波長為500至700毫微米之光線以及波長為520至750毫微米之熒光所激發(fā)。
如圖2所示，蛋白質(zhì)可經(jīng)此處所述之基于若丹明的染料所標記。藉由使用本領(lǐng)域所熟知之蛋白質(zhì)綴合試劑，制備得本發(fā)明之氨基酸以及肽類綴合物。此外，當與細胞表面細胞膜或病毒外被上之蛋白質(zhì)形成鍵聯(lián)時，這種蛋白質(zhì)綴合試劑可用來標記細胞以及顆粒，例如病毒。
本發(fā)明主題，基于若丹明的衍生物以及綴合物，系以下式A所示之一般結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)
式A 于式A結(jié)構(gòu)中，R1和R10各自為氫或鹵素；R2、R5、R6和R9各自為氫、烷基、羧基烷基、氨基烷基、烷基醚、烷基硫醚、鹵素或烷氧基；R3、R4、R7和R8各自為氫、烷基、羧基烷基、氨基烷基、環(huán)烷基、芳基、或烷基、環(huán)烷基、或芳基，其經(jīng)取代以致具有另外的官能基，包括，但非限于烷氧基、硫酸酯、磷酸酯、或硝酸酯；R2和R3一起為烷基鏈，各具有從2至5個碳原子，并將2’碳連結(jié)至3’碳上所鍵結(jié)之氮上；R9和R10一起為烷基鏈，各具有從2至5個碳原子，并將7’碳連結(jié)至6’碳上所鍵結(jié)之氮上；R4和R5一起為烷基，各具有從2至5個碳原子，并將4’碳連結(jié)至3’碳上所鍵結(jié)之氮上；R6和R7一起為烷基，各具有從2至5個碳原子，并將5’碳連結(jié)至6’碳上所鍵結(jié)之氮上；R3和R4一起形成主鏈上至多可達5個原子之烷基或烯基鏈，其是由碳及一個或更多個選自含有氮或氧之雜原子集團所組成，且該鏈之二終端價鍵系鍵結(jié)至3’碳上所鍵結(jié)之氮上R7和R8一起形成主鏈上至多可達5個原子之烷基或烯基鏈，其是由碳以及一個或更多個選自含有氮或氧之雜原子集團所組成，且該鏈之二終端價鍵鍵結(jié)至6’碳上所鍵結(jié)之氮上；R11、R12、R13、和R14各自為氫或鹵素。
至于式A結(jié)構(gòu)之酰胺氮取代基，Ra為烷基、羧基烷基、氨基烷基、環(huán)烷基、芳基、或芳烷基，以及Ra’包括化學上反應(yīng)性官能基，包括，但非限于醇、胺、鹵素、羧酸酯、肼、硫氫基、硫酸酯、磷酸酯、或硝酸酯。Ra取代基之大小變化很大，但優(yōu)選地Ra具有一個碳原子。包含Ra’之化學上反應(yīng)性官能基將于下文中充分描述并作示范，用于進一步衍生作用，其可經(jīng)由本領(lǐng)域所熟知之衍生及綴合化學中選取出。適當之官能基中有胺類、醇類、鹵素、羧酸酯類、肼類、硫氫基類、硫酸酯類、磷酸酯類、以及硝酸酯類。典型上，所選取之化學上反應(yīng)性官能基Ra’系可與有機分子，優(yōu)選為生物分子或本身鍵結(jié)至固相支持體材料，如可控孔度玻璃或聚苯乙烯樹酯分子之反應(yīng)部位進行反應(yīng)。
當所欲綴合之生物分子為核苷酸、寡核苷酸、或核酸時，Ra’中所包括之化學上反應(yīng)性官能基優(yōu)選為亞磷酰胺。當與羥基官能基反應(yīng)時，亞磷酰胺形成亞磷酸酯，其隨后可經(jīng)氧化成磷酸酯。關(guān)于亞磷酰胺，其意指具有式B結(jié)構(gòu)之部分式B 于式B中，L1為氰乙基、烷基、烯基、芳基、芳烷基、或環(huán)烷基；L2和L3各自代表烷基、芳烷基、環(huán)烷基、以及環(huán)烷基芳基；L1和L2一起形成主鏈上至多可達5個原子且總共可達10個碳原子之烯基鏈，其中該鏈之二終端價鍵鍵結(jié)至L2和L3上所鍵結(jié)之氮上；或L2和L3與其所鍵結(jié)之氮原子一起形成飽和氮雜環(huán)，其含有一個或多個選自氮、氧、或硫所組成集團之雜原子。
因此，寡核苷酸可經(jīng)由將具有亞磷酰胺基團之熒光團與寡核苷酸之5’羥基反應(yīng)而受標記。將若丹明之3-位置羧酸酯轉(zhuǎn)化成非酸性基團(例如酰胺)以制備式A熒光圍可賦予亞磷酰胺衍生物較大的穩(wěn)定性。
現(xiàn)有技術(shù)中之若丹明亞磷酰胺是經(jīng)由將若丹明之5-或6-N-羥琥珀酰亞胺酯與胺醇(例如乙醇胺、己醇胺等等)，于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或類似非質(zhì)子性極性溶劑中，室溫下，反應(yīng)形成若丹明染料之5-或6-醇酰胺，然后再經(jīng)由標準方法自反應(yīng)混合物中分離出而制備得。然后將若丹明染料之醇酰胺與過量之雙-(N，N-二異丙基氨基)氰乙基膦，于室溫下，在含有催化量之四唑及二異丙胺之乙腈中反應(yīng)，形成若丹明亞磷酰胺，其系自反應(yīng)混合物中分離得。相對比之下，本發(fā)明之若丹明亞磷酰胺類系經(jīng)由將式A實施方案中3-位置之碳所鍵聯(lián)之官能性進行反應(yīng)。例如，若使用若丹明之N-甲基胺醇衍生物時，可將羥基與經(jīng)四唑活化之雙(N，N-二異丙基氨基)-β-氰乙基亞磷酸酯(BIS)，于無水二氯甲烷或乙腈中，在干的惰性環(huán)境，室溫下進行反應(yīng)為最簡單。將所得之若丹明亞磷酰胺自供寡核苷酸合成用之反應(yīng)混合物中純化取得。
本發(fā)明若丹明亞磷酰胺類亦有用于制備新的經(jīng)若丹明衍生之固相支持體。若丹明衍生之固相支特體可容許經(jīng)3’若丹明標記之寡核苷酸自動合成。
就一簡單實例而言，本發(fā)明之經(jīng)若丹明衍生之固相支持體是經(jīng)由使若丹明之N-甲基羧酸衍生物與含有堿不穩(wěn)定之酯鍵、具有指示劑(DMT或MMT)基團之分支點及終端氨基之衍生的固相支持體，于二甲基甲酰胺或其他非質(zhì)子性有機溶液中反應(yīng)而制備得。將此若丹明衍生之固相支持體過濾、清洗并干燥。經(jīng)由三苯甲基陽離子分析以測定染料衍生含量。適宜之支持體包括具有基于若丹明的染料所鍵結(jié)至其官能基之可控孔度玻璃以及聚苯乙烯樹酯。
經(jīng)由亞磷酸三酯、磷酸三酯、以及H-膦酸酯化學以進行固相合成之步驟的詳述系可取得的(例如美國專利案號4,401,796；4,415,732，以及4,668,777；寡核苷酸合成實用方案，IRL出版，華盛頓，DC，84)。優(yōu)選地，本發(fā)明之操作涉及經(jīng)由亞磷酸三酯處理方法以合成經(jīng)若丹明標記之寡核苷酸。寡核苷酸合成系由核苷所衍生之固相支持體所啟動，并于隨后籍由將核苷亞磷酰胺類與生長鏈之5’羥基反應(yīng)，而將核苷酸加至核苷酸生長鏈中。特別是藉由將本發(fā)明之若丹明亞磷酰胺與經(jīng)鍵結(jié)寡核苷酸之5’羥基反應(yīng)，而將寡核苷酸類標記于5’端；或經(jīng)由將核苷亞磷酰胺類與本發(fā)明若丹明所衍生之固相支持體之羥基反應(yīng)，而將寡核苷酸類標記于3’端。
通常以若丹明標記之寡核苷酸從固相支持體上的斷裂以及將鍵結(jié)至外環(huán)胺類之保護基的移除通過將鍵結(jié)至固相支持體之以若丹明標記之寡核苷酸與斷裂/去保護試劑(0.1N至1.0N氫氧化鈉)，于4°至55℃下進行15分鐘至18小時之處理而實現(xiàn)；優(yōu)選地，將鍵結(jié)至固相支持體之以若丹明標記之寡核苷酸以0.1N氫氧化鈉于55℃下進行2小時或室溫中進行12至18小時。待經(jīng)斷裂及去保護后，將經(jīng)標記或未經(jīng)標記之寡核苷酸以標準程序(寡核苷酸合成實用方案，IRL出版，華盛頓，DC，1984)來純化。
若Ra’包括亞磷酰胺基時，則該取代基剩余的部分可為含有至多20個原子之烷基、烷基酰胺、烷基醚、聚醚或聚酰胺之化學上惰性鏈，其中這些原子為碳以及一個或多個選取自氮或氧所組成集團之雜原子，并含有容許于染料與亞磷酰胺間可化學偶合之鍵聯(lián)官能性；優(yōu)選地，該惰性鏈為一含有5-10個原子之鏈，其中的原子為碳以及一個或多個選取自氮或氧所組成集團之雜原子。亞磷酰胺本身可含有羥與羥基功能反應(yīng)而鍵結(jié)有指示劑保護基(DMT或MMT)之分支結(jié)構(gòu)，其中DMT為二甲氧基三苯甲基，而MMT為單甲氧基三苯甲基。
回到式A，因為選擇性是視欲綴合之生物分子而定，因此除了亞磷酰胺外，許多的官能基可經(jīng)選取而囊括于Ra’取代基中。一般而言，本發(fā)明之綴合物包括式A熒光團，其可經(jīng)由酰胺、酯、醚、或硫醚鍵聯(lián)而與生物分子綴合。
因此，當所需綴合之生物分子為或包括氨基酸、肽、或蛋白質(zhì)時，式A熒光團之優(yōu)選衍生物將包括可與伯胺類或硫氫基反應(yīng)之官能基。由于易經(jīng)蛋白質(zhì)綴合領(lǐng)域技術(shù)人員所了解，故可使用各種的蛋白質(zhì)綴合衍生物來描準氨基酸反應(yīng)。許多的蛋白質(zhì)綴合試劑以及技術(shù)如賀曼森，生物綴合技術(shù)，學院出版，圣地牙哥，加利福尼亞，1996中所述。此外，因為細胞和病毒于其表面細胞膜或病毒外被上含有蛋白質(zhì)，所以這些細胞或病毒顆粒可經(jīng)由實施本發(fā)明而標記。所熟知之蛋白質(zhì)綴合試劑之實例，包含于Ra’取代基中之適合的官能基為琥珀亞酰亞胺酯，其可迅速地與伯胺類進行反應(yīng)。
概言之，根據(jù)本發(fā)明之熒光綴合物可經(jīng)由具有式1所示之結(jié)構(gòu)制備得。
式1 其中Z包括被綴合之物質(zhì)，其為肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷酸、寡核苷酸、或核酸。換言之，式1中，熒光團可為先前式A所述，但Ra’衍生物須經(jīng)反應(yīng)以包括被綴合之物質(zhì)。
下述實施例作為說明而非限制本發(fā)明。除非另有定義，所有此處所使用之技術(shù)及科學術(shù)語系與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知者具有相同的意義。試劑濃度、溫度、以及其他可變參數(shù)之數(shù)值僅作為本發(fā)明之示范并非用來將其作限制。應(yīng)了解到合成方法中可能的變異及試劑將會落入本發(fā)明之范圍內(nèi)。
表1說明了實施例1-9所制備之化合物之結(jié)構(gòu)。
表1化合物1 化合物2 化合物3
表1(續(xù))化合物4 化合物5 化合物6
表1(續(xù)) 化合物8
實施例1四甲基若丹明-N-甲基乙醇胺酰胺(化合物1)之制備采用亨格等人(1996)所述之方法，使用N，N-二甲基氨基酚和鄰苯二甲酸酐作為起始物質(zhì)，合成四甲基若丹明。
于氮環(huán)境下，將2.00克(4.73毫摩爾)之四甲基若丹明懸浮于100毫升之無水二氯甲烷中，隨后加入2.30克(5.20毫摩爾)苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸酯(BOP)以及0.76毫升(9.46毫摩爾)N-甲基乙醇胺。將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌并經(jīng)由使用硅藻土60F254平板，于含有2％(V/V)三乙胺之2∶1∶1之氯仿∶甲醇∶丙酮中進行薄層色譜分析術(shù)(TLC)監(jiān)測。將經(jīng)反應(yīng)之混合物連續(xù)以等體積之5％(w/v)碳酸氫鈉萃取，隨后再以飽和氯化鈉溶液萃取。收集有機相，于無水硫酸鈉上干燥并蒸發(fā)至干。將產(chǎn)物于含有2％(V/V)三乙胺之2∶1∶1之氯仿∶甲醇∶丙酮之硅石凝膠上，經(jīng)由色譜分析術(shù)進行純化。以MALDI-TOF質(zhì)譜測定法、UV/可見光光譜光度測定法以及分析用TLC分析化合物1。于甲醇中吸收(激發(fā))最大值548毫微米；熒光發(fā)射最大值573毫微米。
實施例2若丹明B-N-甲基甲醇胺酰胺(化合物2)之制備于氮環(huán)境下，將1.00克(2.09毫摩爾)之若丹明B(奧雨德里奇化學公司，密爾沃基，威斯康辛)懸浮于25毫升之無水二氯甲烷中，隨后加入1.02克(2.23毫摩爾)BOP以及0.34毫升(4.18毫摩爾)N-甲基乙醇胺。將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌，并經(jīng)由使用硅藻土60F254平板，于2∶1∶1之氯仿∶甲醇∶丙酮中進行TLC監(jiān)測。將經(jīng)反應(yīng)之混合物連續(xù)以等體積之5％(w/v)碳酸氫鈉萃取，然后以飽和氯化鈉溶液萃取。將有機相收集，于無水硫酸鈉上干燥，并蒸發(fā)至干。將產(chǎn)物于含有2∶1∶1之氯仿∶甲醇∶丙酮之硅石凝膠上，經(jīng)由色譜分析術(shù)進行純化。以MALDI-TOF質(zhì)譜測定法、UV/可見光光譜光度測定法以及分析用TLC分析化合物2。于甲醇中吸收(激發(fā))最大值560毫微米；熒光發(fā)射最大值579毫微米。
實施例3若丹明101-N-甲基甲醇胺酰胺(化合物3)之制備于氮環(huán)境下，將0.50克(1.01毫摩爾)之若丹明101(艾克洛斯有機物，匹茲堡，賓夕凡尼亞)懸浮于50毫升之無水二氯甲烷中，隨后加入0.49克(1.12毫摩爾)BOP以及0.162毫升(2.02毫摩爾)N-甲基乙醇胺。將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌，并經(jīng)由使用硅藻土60F254平板，于2∶1∶1之氯仿∶甲醇∶丙酮中進行TLC監(jiān)測。將經(jīng)反應(yīng)之混合物連續(xù)以等體積之5％(w/v)碳酸氫鈉萃取，然后以飽和氯化鈉溶液萃取。收集有機相，于無水硫酸鈉上干燥，并蒸發(fā)至干。直接使用產(chǎn)物無須進一步純化。以MALDI-TOF質(zhì)譜測定法、UV/可見光光譜光度測定法以及分析用TLC分析化合物3。于甲醇中吸收(激發(fā))最大值582毫微米；熒光發(fā)射最大值602毫微米。
實施例4四甲基若丹明亞磷酰胺(化合物4)之制備活化雙(N，N-二異丙基氨基)-β-氰乙基亞磷酸酯(BIS)試劑之制備。經(jīng)四唑所活化之BIS系經(jīng)由將8.5毫克(0.12毫摩爾)四唑置于干燥瓶中并以橡膠隔板蓋上而制備得。經(jīng)由隔板蓋注射，將無水乙腈(2.5毫升)加入。將0.085毫升(0.24毫摩爾)BIS注射至所得溶液中并在室溫下靜置30分鐘。
制備化合物4。于干燥的氮環(huán)境下，將1.0毫升無水乙腈加入含有0.10毫克(0.02毫摩爾)干燥化合物1之蓋有隔板之瓶中。將經(jīng)活化之BIS(0.17毫升，0.017毫摩爾)少量等分注射通過隔板蓋。將該溶液于室溫下反應(yīng)15分鐘，并將樣品移出以TLC(硅藻土60 F254平板，2∶1∶1之氯仿∶甲醇∶丙酮)分析。每間隔15分鐘，持續(xù)加入經(jīng)活化之BIS并對反應(yīng)樣品進行分析，直至反應(yīng)經(jīng)判斷已完成為止。直接將所得溶液使用于經(jīng)標記寡核苷酸之合成中。
實施例5若丹明B亞磷酰胺(化合物5)之制備于干燥的氮環(huán)境下，將120克(2.24毫摩爾)干燥化合物2與86.2毫克(1.23毫摩爾)四唑合并，并溶解于25毫升無水二氯甲烷中。加入BIS(0.74毫升，2.46毫摩爾)，并將此反應(yīng)混合物于室溫下攪拌一小時。將樣品以TLC(硅藻土60 F254，含有2％三乙胺之10％甲醇性氯仿)分析以確認反應(yīng)完全。中止反應(yīng)并連續(xù)以等體積之5％(w/v碳酸氫鈉，然后以飽和氯化鈉萃取。將有機相于硫酸鈉上干燥，并蒸發(fā)至干。將粗產(chǎn)物于硅石凝膠上，使用含有2％乙醇胺之50∶50二氯甲烷∶丙酮溶析，進行色譜分析術(shù)以純化。將經(jīng)純化之化合物5以干燥形式儲藏，直至于經(jīng)標記寡核苷酸之合成中才使用。
實施例6若丹明101亞磷酰胺(化合物6)之制備于干燥的氮環(huán)境下，將0.5克(0.91毫摩爾)干燥化合物3與35.2毫克(0.51毫摩爾)四唑合并，并溶解于20毫升無水二氯甲烷中。加入BIS(0.30毫升，1.01毫摩爾)，并將此反應(yīng)混合物于室溫下攪拌一小時。將樣品以TLC(硅藻土60 F254，含有2％三乙胺之10％甲醇性氯仿)分析以確認反應(yīng)完全。中止反應(yīng)并以等體積之石油醚萃取兩次，并蒸發(fā)至干。將所得產(chǎn)物溶解于含有2％三乙胺之氯仿中，并連續(xù)以等體積之5％碳酸氫鈉，然后以飽和氯化鈉萃取。將有機相于硫酸鈉上干燥，并蒸發(fā)至干。將粗產(chǎn)物于硅石凝膠上，使用含有2％乙醇胺之50∶50二氯甲烷∶丙酮溶析，進行色譜分析術(shù)以純化。將經(jīng)純化之化合物6以干燥形式儲藏，直至于經(jīng)標記寡核苷酸之合成中才使用。
實施例7若丹明101亞磷酰胺(化合物7)之制備制備四甲基若丹明-N-甲基丁酰酯。于氮環(huán)境下，將663毫克BOP加入于20毫升二甲基甲酰胺中之424毫克(1毫摩爾)四甲基若丹明、12毫克二甲基氨基吡啶、251毫克N-甲基丁酰甲酯-HCl混合物中。使用二異丙基乙胺將溶液調(diào)整至pH8.5。將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌一小時，并使用TLC(硅藻土60 F254于15％之甲醇性氯仿中)監(jiān)測至完成。將經(jīng)反應(yīng)之混合物蒸發(fā)成漿，并再懸浮于100毫升之二氯甲烷中。將此溶液連續(xù)以等體積之5％碳酸氫鈉，然后以飽和氯化納萃取。收集有機相，于無水硫酸鈉上干燥，并蒸發(fā)至干。將產(chǎn)物于含有7％甲醇性氯仿之硅石凝膠上進行色譜分析術(shù)以純化獲得250毫克純化合物。以MALDI-TOF質(zhì)譜測定法、UV/可見光光譜光度測定法以及分析用TLC分析四甲基若丹明-N-甲基丁酰酯。于甲醇中吸收(激發(fā))最大值548毫微米；熒光發(fā)射最大值572毫微米。
制備四甲基若丹明-N-甲基丁酸。將四甲基若丹明-N-甲基丁酰酯(250毫克)溶解于20毫升之甲醇中，并將1N氫氧化鈉溶液加入。將反應(yīng)混合物于室溫下攪拌，并以TLC(硅藻土60 F254于15％之甲醇性氯仿中)監(jiān)測。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至油狀，并溶解于200毫升之水中。將水相以等體積之二氯甲烷清洗兩次。以6N氫氯酸將水層調(diào)整至pH3至4，并以等體積之二氯甲烷萃取。收集有機層，于無水硫酸鈉上干燥，并蒸發(fā)至干。產(chǎn)量為254毫克。使用四甲基若丹明-N-甲基丁酸無須進一步純化。
制備四甲基若丹明-N-甲基丁?；?CPG(化合物7)。將20％六氫吡啶基二氯甲烷加入2克F-moc-3’-氨基修飾劑-CPG(半島實驗室公司，圣卡洛斯，加利福尼亞)中。在室溫下，將CPG振蕩30分鐘、過濾、并連續(xù)以丙酮、甲醇和醚清洗。待經(jīng)于真空下干燥3小時后，將CPG加至250毫克四甲基若丹明-N-甲基丁酸、0.5毫升三乙胺、0.39毫升N，N-二異丙基碳二亞胺以及20毫升二氯甲烷混合物中。過濾CPG并如上所述清洗。CPG固相支持體之染料衍生含量(載荷)，經(jīng)三苯甲基陽離子分析測定為30至40微摩爾/克。
實施例8四甲基若丹明-((N-羥基琥珀酰亞胺基)(4-N-甲基氨基)丁酸酯)酰胺(化合物8)之制備制備四甲基若丹明-(甲基(4-N-甲基氨基)丁酸酯酰胺。于干燥的氮環(huán)境下，將1.0克(2.58毫摩爾)四甲基若丹明與1.26克(2.63毫摩爾)BOP、0.52(3.12毫摩爾)4-(N-甲基氨基)丁酸甲酯鹽酸、0.87毫升(6.24毫摩爾)三乙胺以及100毫升無水二氯甲烷合并。將此反應(yīng)于室溫下攪拌過夜。樣品經(jīng)2∶1∶1氯仿∶甲醇∶丙酮之TLC分析以確認反應(yīng)完全。將反應(yīng)混合物連續(xù)以等體積之5％(w/v)碳酸氫鈉，然后以飽和氯化鈉萃取。將有機相收集，于無水硫酸鈉上干燥，并蒸發(fā)至干。使用此產(chǎn)物無須進一步純化。
制備四甲基若丹明-((4-N-甲基氨基)丁酸)酰胺。將一份1.6克(3.19毫摩爾)之化合物四甲基若丹明-(4-N-甲基氨基)丁酸甲酯)酰胺溶解于30毫升甲醇中。將一份7.5毫升1N氫氧化鈉加入，并將此反應(yīng)于室溫下攪拌過夜。將樣品經(jīng)2∶1∶1氯仿∶甲醇∶丙酮之TLC分析以確認反應(yīng)完全。將反應(yīng)混合物蒸發(fā)至干，并以50毫升水稀釋。將所得混合物以等體積之二氯甲烷萃取兩次。收集水相，以6N氫氯酸酸化，并以等體積之二氯甲烷萃取三次。收集有機相，于無水硫酸鈉上干燥，并蒸發(fā)至干。使用此產(chǎn)物無須進一步純化。
制備四甲基若丹明-((N-羥基琥珀酰亞胺基)(4-N-甲基氨基)丁酸酯)酰胺(化合物8)。于干燥的氮環(huán)境下，將0.23克(0.46毫摩爾)化合物四甲基若丹明-((4-N-甲基氨基)丁酸)酰胺與0.16克(0.69毫摩爾)碳酸二琥珀酰亞胺酯、0.07毫升(0.923毫摩爾)無水吡啶以及20毫升無水二氯甲烷組合。將此反應(yīng)于室溫下攪拌過夜。將樣品經(jīng)2∶1∶1氯仿∶甲醇∶丙酮之TLC分析以確認反應(yīng)完全。將此反應(yīng)蒸發(fā)至干，溶解于最少量之二氯甲烷中，并于50毫升二氧化硅柱中，以2∶1∶1氯仿∶甲醇∶丙酮溶析，進行色譜分析術(shù)而純化。于甲醇中吸收(激發(fā))最大值559毫微米；熒光發(fā)射最大值578毫微米。
實施例9若丹明B-(N-甲基乙醇酰胺)-琥珀?；?(N-羥基琥珀酰亞胺)(化合物9)之制備制備若丹明B-(N-甲基乙醇胺)-琥珀酸酯。將一份0.100克(0.21毫摩爾)之化合物2(若丹明B-N-甲基乙醇胺酰胺)與0.023克(0.23毫摩爾)琥珀酸酐、5.0毫克(0.04毫摩爾)二甲基氨基吡啶以及5毫升無水乙腈合并。以等體積之5％碳酸氫鈉中止反應(yīng)，然后經(jīng)由蒸發(fā)將乙腈移除。收集所得水相，并以等體積之飽和氯化鈉萃取三次，于無水硫酸鈉上干燥，并蒸發(fā)至干。使用此產(chǎn)物無須進一步純化。
制備若丹明B-(N-甲基乙醇胺)-琥珀酰基-(N-羥基琥珀酰亞胺)(化合物9)。將一份0.118克(0.221毫摩爾)化合物，若丹明B-(N-甲基乙醇胺)琥珀酸酯與23.0毫克(0.23毫摩爾)N-羥基琥珀酰亞胺、48.0毫克(0.23毫摩爾)二環(huán)己基碳化酰亞胺以及5毫升無水二氯甲烷組合。將此反應(yīng)在室溫下攪拌，并經(jīng)2∶1∶1氯仿∶甲醇∶丙酮之TLC監(jiān)測。將此反應(yīng)以等體積之飽和氯化鈉萃取。收集有機相，以等體積之飽和氯化鈉清洗，于無水硫酸鈉上干燥，并蒸發(fā)至干。使用此產(chǎn)物無須進一步純化。于甲醇中吸收(激發(fā))最大值567毫微米；熒光發(fā)射最大值586毫微米。
實施例10以若丹明標記之寡核苷酸的固相合成以及經(jīng)0.1N氫氧化鈉的斷裂與去保護根據(jù)制造者指導手冊，使用Eppendof Ecosyn 300+DNA合成儀進行寡核苷酸的合成。寡核苷酸是以1微摩爾規(guī)模合成。以無水乙腈將染料亞磷酰胺類重調(diào)至濃度100毫克/毫升。將經(jīng)標記之寡核苷酸(5聚體至10聚體長度)從固相支持體中釋放出并經(jīng)由以0.5毫升0.1N氫氧化鈉，于55℃下處理2小時而去保護。純化經(jīng)標記之寡核苷酸并以TLC(硅藻土60 F254于55∶10∶35異丙醇∶水∶氨中)分析或根據(jù)標準程序(薩姆布魯克等人，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版，1989)經(jīng)由聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。
使用化合物5、7、4和6標記寡核苷酸，并于圖1顯示本發(fā)明實施方案，以若丹明標記之寡核苷酸于19％聚丙烯酰胺、10M尿素、TRiS-硼酸鹽(89mM TRiS-硼酸鹽，2mMEDTA)凝膠中電泳之數(shù)據(jù)。將該凝膠在紫外線箱上照射，并使用配備有若丹明濾片(NucleoTech公司，福斯特城，加利福尼亞)之NucleoVision CCD照相機系統(tǒng)捕捉熒光影像。樣品載荷于泳道A)合成期間，使用化合物5若丹明B亞磷酰胺標記聚-dT 9聚體于5’端；B)使用化合物7以四甲基若丹明衍生的可控孔度玻璃標記聚-dT 10聚體于3’端；C)合成期間，使用化合物4四甲基若丹明亞磷酰胺標記聚-dT 11聚體于5’端；D)合成期間，使用化合物6若丹明101亞磷酰胺標記聚dT 11聚體于5’端。
下表2給出以本發(fā)明若丹明亞磷酰胺三個實施方案所標記之寡核苷酸之熒光激發(fā)與發(fā)射波長，以及將本發(fā)明實施方案中之一鍵結(jié)至固相支持體(可控孔度玻璃或CPG)之熒光激發(fā)與發(fā)射波長。
表2
所有的光譜測量值是使用三光UV-1601 UV-可見光光譜光度分析儀以及三光RF-5301 PC光譜熒光光度儀對溶解于磷酸緩沖鹽溶液，pH 7.2(JRH生物科學)中經(jīng)純化且經(jīng)標記之寡核苷酸取得。
注意到相對于自由態(tài)染料試劑之激發(fā)與發(fā)射極值，經(jīng)標記之寡核菩酸之激發(fā)與發(fā)射極值位移至較長的波長。激發(fā)與發(fā)射極值之紅位移亦可在使用常規(guī)方法以現(xiàn)有技術(shù)5-或6-TAMRA標記之寡核苷酸中看見。
使用衍生物，如DMT-5-染料-脫氧尿苷亞磷酰胺(DMT-5-染料-dU-CEP)，于自動化寡合成期間，將經(jīng)染料標記之脫氧尿苷(dU)殘基加至寡核苷酸5’端或序列中5’及3’端間任意點。通常研究者會以染料-dU取代序列中之胸苷(dT)，如此一來，雜交作用堿基配對便不受影響。
另外，可使用的衍生物有染料-脫氧核苷酸三磷酸(染料-DNTP)、染料-核糖核苷酸三磷酸酯(染料-NTP)、以及染料-雙脫氧核苷酸三磷酸酯(染料-ddNTP)化合物。此等試劑有用于使鍵聯(lián)染料之DNTP或NTP進行酶促摻入而標記DNA或RNA。
以染料標記之雙脫氧核苷酸三磷酸酯(ddNTP)可經(jīng)酶促摻入使DNA測序使用之DNA作為桑格雙脫氧測序方法(桑格專人，分子生物學期刊，143，第161-178頁，1980)中之鏈終止劑。此化合物有現(xiàn)有技術(shù)。而染料-ddATP、染料-ddCTP、染料-ddGTP、染料-ddTTP類似物亦可經(jīng)預期而獲得。
實施例11以若丹明琥珀酰亞胺酯綴合試劑(化合物8和9)標記之蛋白質(zhì)由圖2作說明。將化合物8和9溶解于無水二甲亞砜(DMSO)至濃度約10毫克/毫升。假定若丹明染料試劑于甲醇中之摩爾消光系數(shù)為90,000，從吸收最大值，計算出試劑的濃度。將小牛血清白蛋白(BSA)(分子量66,200道爾頓)溶解于磷酸緩沖鹽(PBS)溶液(J RH生物科學，萊內(nèi)克薩，堪薩斯)至濃度4.16毫克/毫升。于含有0.2毫升BSA、20微升1M碳酸氫鈉pH8.3以及8至15倍摩爾過量標記試劑(化合物8或化合物9)之反應(yīng)試管中，將該蛋白質(zhì)與若丹明琥珀酰亞胺酯試劑進行反應(yīng)。于試管振蕩器中室溫下將該綴合反應(yīng)進行約1小時。將6微升體積之6M羥胺，pH8.5加入以終止綴合反應(yīng)。經(jīng)由凝膠過濾色譜分析術(shù)，于BioGE1 P6旋轉(zhuǎn)試管(伯樂實驗室，赫爾克里士，加利福尼亞)中將未摻入之若丹明試劑從經(jīng)標記之BSA中分離出。經(jīng)由標準方法(薩姆布魯克等人，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版，1989)，以UV/可見光光譜光度測定法、熒光光譜光度測定法、以及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析經(jīng)標記之BSA。就溶于PBS溶液中之經(jīng)四甲基若丹明綴合之BSA吸光度(激發(fā))最大值564毫微米；熒光發(fā)射最大值581毫微米；就溶于PBS溶液中之經(jīng)若丹明B綴合之BSA吸光度(激發(fā))最大值569毫微米；熒光發(fā)射最大值585毫微米。
應(yīng)了解到雖然上述之本發(fā)明系與優(yōu)選之特定實施方案關(guān)連，但敘述與實施例系意圖作說明，而非限制本發(fā)明之范圍，該范圍系由隨附權(quán)利要求之范圍所定義。
權(quán)利要求
1.一種標記供熒光檢測用之有機化合物的方法，其包含提供具有式A結(jié)構(gòu)圖示之熒光團式A 其中R1和R10各自為氫或鹵素；R2、R5、R6和R9各自為氫、烷基、羧基烷基、氨基烷基、烷基醚、烷基硫醚、鹵素或烷氧基；R3、R4、R7和R8各自為氫、以及取代或未取代之烷基、羧基烷基、氨基烷基、環(huán)烷基、芳基；R2和R3一起為各具有從2至5個碳原子之烷基鏈，其將2’碳連結(jié)至3’碳上所鍵結(jié)之氮上；R9和R8一起為各具有從2至5個碳原子之烷基鏈，其將7’碳連結(jié)至6’碳上所鍵結(jié)之氮上；R4和R5一起為各具有從2至5個碳原子之烷基，其將4’碳連結(jié)至3’碳上所鍵結(jié)之氮上；R6和R7一起為各具有從2至5個碳原子之烷基，其將5’碳連結(jié)至6’碳上所鏈結(jié)之氮上；R3和R4一起形成主鏈上至多5個原子之烷基或烯基鏈，其是由碳及一個或更多個選自氮或氧之雜原子所組成，該鏈之二終端價鍵鍵結(jié)至3’碳上所鍵結(jié)之氮上；R7和R8一起形成主鏈上至多5個原子之烷基或烯基鏈，其由碳以及一個或更多個選自氮或氧之雜原子所組成，該鏈二端之價鍵鍵結(jié)至6’碳上所鍵結(jié)之氮上；R11、R12、R13和R14各自為氫或鹵素，其中Ra和Ra’為非氫之取代基，其中Ra賦予對內(nèi)酰胺環(huán)形成的抗性，而Ra’包括對衍生作用具反應(yīng)性之基團；且，將熒光團綴合欲經(jīng)標記之有機化合物是經(jīng)由熒光團之Ra’基團進行綴合，所得之綴合物在可測得波長之光激發(fā)下具熒光性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中綴合作用包括將有機化合物與熒光團于共價鍵形成之條件下進行反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中有機化合物為生物分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中生物分子為氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、或核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中生物分子鍵結(jié)至固相支持體上。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中生物分子為寡核苷酸，且熒光團經(jīng)由亞磷酰胺而鍵結(jié)至綴合物中之5’端上。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中生物分子為寡核苷酸，且熒光團鍵結(jié)至綴合物中之3’端上。
8.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中生物分子為氨基酸、肽或蛋白質(zhì)，且熒光團系鍵結(jié)至綴合物中之氨基或硫氫基上。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中生物分子為細胞表面細胞膜或病毒外被的一部份。
10.一種熒光綴合物，其包含綴合物質(zhì)以及熒光團，綴合物質(zhì)為氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、寡核苷酸、或核酸，其上鍵結(jié)有一或多個熒光團，熒光綴合物具有式1之結(jié)構(gòu)圖示式1 其中R1和R10各自為氫或鹵素；R2、R5、R6和R9各自為氫、烷基、羧基烷基、氨基烷基、烷基醚、烷基硫醚、鹵素或烷氧基；R3、R4、R7和R8各自為氫、以及取代或未取代之烷基、羧基烷基、氨基烷基、環(huán)烷基、芳基；R2和R3一起為各具有從2至5個碳原子之烷基鏈，其將2’碳連結(jié)至3’碳上所鍵結(jié)之氮上；R9和R8一起為各具有從2至5個碳原子之烷基鏈，其將7’碳連結(jié)至6’碳上所鍵結(jié)之氮上；R4和R5一起為各具有從2至5個碳原子之烷基，其將4’碳連結(jié)至3’碳上所鍵結(jié)之氮上；R6和R7一起為各具有從2至5個碳原子之烷基，其將5’碳連結(jié)至6’碳上所鍵結(jié)之氮上；R3和R4一起形成主鏈上至多5個原子之烷基或烯基鏈，其由碳及一個或更多個選自氮或氧之雜原子所組成，該鏈之二終端價鍵系鍵結(jié)至3’碳上所鍵結(jié)之氮上；R7和R8一起形成主鏈上至多5個原子之烷基或烯基鏈，其由碳及一個或更多個選自氮或氧之雜原子所組成，該鏈之二終端價鍵系鍵結(jié)至6’碳上所鍵結(jié)之氮上；R11、R12、R13和R14各自為氫或鹵素，其中Ra為具有從1至10個碳原子之烷基、羧基烷基、氨基烷基、環(huán)烷基、芳基、或芳烷基，且Z包括綴合物質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的綴合物，其中經(jīng)綴合物質(zhì)經(jīng)由酰胺、酯、二硫化物、或硫醚鍵聯(lián)而鍵結(jié)至熒光團。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的綴合物，其中熒光團與經(jīng)綴合物質(zhì)間之鍵聯(lián)包括磷酸酯。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的熒光綴合物，其經(jīng)綴合物質(zhì)鍵結(jié)至固相支持體上。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的熒光綴合物，其中固相支持體為可控孔度玻璃。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的熒光綴合物，其中固相支持體為聚合物支持體。
16.根據(jù)權(quán)利要求10的熒光綴合物，其中經(jīng)綴合物質(zhì)是細胞膜的一部分。
17.根據(jù)權(quán)利要求10的熒光綴合物，其中經(jīng)綴合物質(zhì)系病毒外被的一部分。
18.根據(jù)權(quán)利要求10的熒光綴合物，其中熒光團衍生自四甲基若丹明。
19.根據(jù)權(quán)利要求10的熒光綴合物，其中熒光團衍生自若丹明101。
20.根據(jù)權(quán)利要求10的熒光綴合物，其中熒光團衍生自若丹明B。
全文摘要
基于若丹明(rhodamine)的熒光染料經(jīng)衍生形成標記的綴合物,其在適當波長之光的激發(fā)下具熒光性。特別優(yōu)選之實施方案為特定單一異構(gòu)體形式之若丹明亞磷酰胺類。這些若丹明亞磷酰胺類可增強經(jīng)由固相方法合成若丹明標記的寡核苷酸之效率。本發(fā)明綴合物之實施方案因具有完全取代的衍生自3－位羧酸酯之酰胺鍵而防止被轉(zhuǎn)化成非熒光性內(nèi)酰胺形式。
文檔編號G01N33/52GK1355428SQ0013250
公開日2002年6月26日 申請日期2000年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月23日
發(fā)明者羅納德·H·基亞雷洛, 廖永昌, 凱西·E·尤克巴塔 申請人:神隆新加坡私人有限公司