專利名稱：用于在生物樣品中進行稀有事件分析的高靈敏度多參數(shù)方法
析的高靈敏度多參數(shù)方法
相關(guān)申請的交叉引用
本申請是2008年3月20日提交的U,S.申請Ser. No. 12/067,532的 部分繼續(xù)申請，其中U.S.申請Ser. No. 12/067,532要求于2005年9月 20日提交的美國臨時申請60/718,676、 2005年10月24日提交的 60/729,536以及2006年3月提交的60/786的優(yōu)先權(quán)。通過參照將前述 申請均完全并入本文。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及癌癥和診斷測試領(lǐng)域。本發(fā)明可以用于疾病例如癌癥 或心血管紊亂的篩選、分級、治療應答、復發(fā)等。更具體的，本發(fā)明 提供了 一些方法，其輔助對從生物樣品分離的循環(huán)稀有細胞進行分析 和計數(shù)。
背景
之前已經(jīng)描述了用于從生物樣品中鑒別不僅腫瘤細胞、還有稀有 細胞以及其他生物實體(entity)的方法(US 6,365,362)。這種兩階段方
法需要有效的富集以確保在分析之前獲取目標細胞，同時消除實質(zhì)量 的碎片和其他干擾物質(zhì)，以允許通過成像枝術(shù)進行細胞檢驗。該方法
以獨特的自動化方式將免疫磁性富集的元件與多參數(shù)流式細胞計量 術(shù)、顯微鏡術(shù)和免疫細胞化學分析組合。這種組合方法用于對血液樣 品中的上皮細胞進行富集和計數(shù)，這樣提供了用于測量癌癥的工具。
這種兩階段方法在癌癥預后中以及癌癥轉(zhuǎn)移患者的存活中具有應 用(WO 04076643)。基于血液中存在形態(tài)學上完整的循環(huán)癌細胞，該方 法能夠?qū)⑥D(zhuǎn)移乳癌患者的循環(huán)癌細胞的存在與疾病進展和存活的時間 進行關(guān)聯(lián)。更具體的，每7.5毫升存在五(5)個或更多個循環(huán)腫瘤細 胞提供了在首次隨訪時的預測值，這樣提供了患者存活的早期預后指 示。上述檢驗的特異性隨著所檢測細胞的數(shù)目而提高，并且如果僅檢
測少量的細胞(通常低于5個循環(huán)腫瘤細胞)，則其特異性不足。該問 題的一個解決方案是提供關(guān)于可疑癌細胞的詳細遺傳信息。因此，一 種將血液樣品的富集與對個別可疑癌細胞的多參數(shù)圖像細胞計量術(shù)和
多參數(shù)遺傳分析結(jié)合的方法將提供完整的分布圖(profile)和確認機制 以顯著改善目前用于患者篩選、評定疾病復發(fā)或其他全部存活的程序。 已經(jīng)描述了在稀有循環(huán)細胞的分析中的確認檢驗，其通過將個別分離 的目標細胞的表型和基因型多參數(shù)分析進行組合(參見審批中的U.S.申 請12/067,532)。確認提供了臨床上顯著的靈敏度水平，因此確保醫(yī)生 獲取所有定量信息。使用數(shù)目非常小(l、 2、 3或5個)的循環(huán)腫瘤細 胞(CTC)評定相關(guān)疾病狀態(tài)，并提供對早期疾病^r測的確認。
還不存在其他可以利用的技術(shù)，其能夠?qū)κ褂孟嗤瑯酥疚飳ο嗤?br> 的樣品進行多次高靈敏度檢驗，并對稀有事件進行該技術(shù)。通常進行 多參數(shù)流式細胞計量術(shù)，但其需要數(shù)百個或數(shù)千個目標細胞或事件以 得到精確的信息。然而，如果患者在7.5mL血液中僅具有6個CTC， 則存在太少的事件而不能可靠地檢測，也不能進行多參數(shù)分析。
本發(fā)明擴展了在US 6,365,362中所描述的，以及在Celltracks Autoprep 系統(tǒng)和Celltracks Analyzer II系統(tǒng)(Immunicon Corporation, Huntingdon Valley, PA)中所使用的富集和分析規(guī)程，其通過提供允許 使用多個熒光生物標志物研究稀有循環(huán)細胞的手段。

發(fā)明內(nèi)容
本文所描述的發(fā)明包括一種方法，其包括聯(lián)合工作的五個部分以 達到最終的結(jié)果。本發(fā)明主要包括(l)對柱體(cartridge)進行掃描以 鑒定具有所關(guān)注目標細胞的那些，以及它們在所迷柱體中的位置；(2) 從所迷柱體抽吸流體以千燥或主動地將細胞固定在它們在蓋玻片上的
位置；(3)對熒光信號進行光漂白以消除最初用于鑒定目標細胞的熒光；
(4)使用 一種或者多種熒光抗體綴合物或染料對柱體內(nèi)的細胞進行再染 色以在所關(guān)注目標上或之內(nèi)標記標志物、受體、蛋白質(zhì)等；(5)對所述 柱體進行再掃描并返回到之前所鑒定所關(guān)注的目標，并確定細胞對于 期望的標志物或蛋白質(zhì)是陽性還是陰性。
使用熒光標志物對含有CTC或其他所關(guān)注細胞的血液樣品進行染
5色以進行成像分析，并掃描以鑒定目標細胞或亞細胞元件在柱體內(nèi)的存在和位置。接著對含有期望目標細胞或亞細胞元件的樣品進行進一步處理， 一部分通過對樣品進行光漂白，以便這些相同的目標可以被再分析，其使用附加的綴合到相同或不同熒光染料的生物標志物，并使用與進行起始分析相同的成像標準。本發(fā)明具有利用目標的應用，例如循環(huán)上皮細胞、循環(huán)腫瘤細胞、循環(huán)內(nèi)皮細胞、白細胞、淋巴細胞亞群、含有所關(guān)注細胞器或受體的細胞、細應碎片、破裂細胞和它們的碎片，或者其他任何可以被捕獲并成像的所艱成元件。


圖l:畫面A在千燥后確認樣品的完整性和目標的位置。畫面B在千燥前后在相同的位置顯示細胞。圖2:在干燥后對柱體再染色。
圖3:使用LED對焚光信號進行漂白。畫面A漂白使用Cll-PE染色的SKBR細胞，接著進行CU-FITC再染色。畫面B漂白使用Cll-PE染色的PC3-9細胞，接著進行C1卜FITC再染色。
圖4:圖A顯示使用CU-PE染色的SKBR細胞的起始掃描。圖B顯示在漂白后和僅使用C11-FITC再染色的樣品。圖C顯示使用C11-FITC和pART-PE在染色的樣品。
發(fā)明詳迷
已經(jīng)使用CellTracks Autoprep 系統(tǒng)和CellTracks Analyzer II系統(tǒng)(Immunicon Corporation, Huntingdon Valley, PA)對從血液捕獲的循環(huán)腫瘤細胞(CTC)進行檢測和分析。在該程序中，熒光生物標志物和染料的組合被用于鑒定上皮細胞來源的細胞，并將它們與污染的白細胞區(qū)別開。CellTracks⑧分析平臺受限于4個通道或顏色以檢測這些熒光標志物。UV通道檢測細胞核染料4，,6，-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，以鑒定有細胞核的事件或細胞事件；別藻藍蛋白(APC)通道，用于檢測CD45-APC,其用于鑒定白細胞；以及兩個標志物通道藻紅蛋白(PE)和異硫氰酸熒光素(FITC)用于檢測綴合到PE或FITC上的生物標志物。使用標準的CellSearch⑧試劑盒(Veridex LLC, Raritan, NJ)，將PE綴合到細胞角蛋白，這用于鑒定上皮細胞，F(xiàn)ITC是可以利用的其他所關(guān)
6注的標志物。上皮細胞試劑盒(Immunicon Corporation, HuntingdonValley, PA)使用相同的顏色組合，其中目前僅僅細胞角蛋白與FITC綴合，而空出了 PE通道。PE通道較強的信號可以允許檢測綴合到PE的較暗的生物標志物。
因為在CellTracks Analyzer II系統(tǒng)中僅僅存在4個通道或顏色，并且這四個中有3個用于檢測上皮細胞和白細胞，僅一個通道可以保留下來用于附加的生物標志物分析。然而，特別是在制藥工業(yè)中，需要對所捕獲的目標檢測多個生物標志物，并且優(yōu)選檢測發(fā)生在相同的目標上。本發(fā)明能夠從附著到所捕獲目標上的生物標志物和染料除去焚光信號，并使用所關(guān)注的附加標志物對相同的目標進行再染色。在柱體的起始掃描之后的千燥步驟將所關(guān)注的目標固定在它們在柱體中的起始位置中，以便在將柱體再染色時，這些相同的目標容易被發(fā)現(xiàn)，并分析所關(guān)注的附加生物標志物的存在。
在程序的第一步中，在Celltracks Autoprep(g)系統(tǒng)和Celltracks Analyzer II系統(tǒng)上對CellTmcks⑧柱體進行處理，在此處對所捕獲的目標進行掃描，并確定所鑒定期望目標的存在得到它們在柱體中的定位。通過抽吸從柱體中移出液體，并將該柱體風干過夜。進行抽吸和風干，同時該柱體保持在起始MagNest⑧中。該步驟將目標，通常是細胞例如CTC"固定，，在柱體的適當位置處，以便它們基本上成為固定的，并且附著到成像表面，在此位置處它們被初次檢測。固定細胞的優(yōu)選方法是風干柱體，然而也可以使用其他固定方法，事實上，可以需要暴露到某些類型的抗原，或者達到某些抗體與它們抗原之間的最佳反應性。該干燥步驟或主動固定使得柱體可以從MagNest⑧.除去，并使得該柱體被處理，其中幾乎沒有或沒有細胞移動或損失。因此，使得成像設(shè)備例如但不限于Celltracks Analyzer II系統(tǒng)能夠在后續(xù)分析過程能夠再獲取目標。該程序的第二步驟將所述柱體暴露到強光(由例如但不限于LED產(chǎn)生的)，以便對在其起始處理過程中附著到目標的染料和標記物的熒光進行漂白。在熒光染料以高速激發(fā)時，光漂白是有效的。以高效率激發(fā)染料的波長帶通常是窄的(10-50nm)。 LED有效地高效產(chǎn)生窄波長帶，并可以得到近UV至IR的發(fā)射。通過散熱器(heat sink)進一步提高LED的效率。可以將任選的均化器(由反射或折射表面構(gòu)成)用于提高樣品上光分布的均一性。使用目前的原型LED漂白器，
7光漂白亮染料可以需要最高達到20分鐘。然而，對于4交暗的信號，10~15 分鐘足夠了。在最后的步驟中，柱體中的樣品被綴合到焚光染料上的 所關(guān)注的附加生物標志物再染色。除去染色溶液，并使用核酸染料溶 液例如含有DAPI的CellFix,并在成像設(shè)備上對柱體進行再分析。
圖1A確認了在干燥后樣品的完整性。在樣品被干燥后，鐵磁流體 分布和目標的位置與在CellTracks Analyzer II系統(tǒng)上起始進行掃描時 保持相同。圖1B顯示在干燥前后，這些細胞保持完整，并且在相同位 置。 —
圖2證明在干燥后在柱體中再染色的能力。此處，將目標細胞加 入使用CellSave防腐劑(Immunicon Corporation)制備的血液中，并存儲 過夜。接著，使用利用C11-PE標記細胞的CTC試劑盒在CellTracks⑧ Autoprep⑧系統(tǒng)和CellTracks Analyzer II系統(tǒng)中處理樣品。在起始掃 描中，F(xiàn)ITC通道保持空白，因為沒有綴合到FITC的標志物。在柱體 干燥后，對熒光信號進行漂白，在柱體中使用C11-FITC對樣品進行再 染色，接著在CellTracks Analyzer II系統(tǒng)上進行再掃描。目前，樣品 在PE和FITC通道中都是陽性的。盡管一開始使用C11-PE對這些樣 品進行染色，但仍保持充分的結(jié)合位點進行后續(xù)Cll-FITC結(jié)合。
圖3A和3B證明了使用發(fā)光二極管(LED)漂白掉熒光信號的能 力。將細胞摻入到血液中，其中所迷血液^/f吏用CellSave防腐劑進行 過防腐，并儲存過夜。接著，利用C11-PE標記細胞的CTC試劑盒在 CellTracks Autoprep 系統(tǒng)上對樣品進行處理。接著，在Celltracks Analyzer II系統(tǒng)上對柱體進行掃描。在抽吸液體和柱體干燥之后，將 CellFix加回到柱體；從MagNest(g)移出柱體，并接著暴露到LED發(fā)出 的光，最高達到20分鐘。將柱體放置回到MagNest 內(nèi)，并抽吸CellFix, 使用C1卜FITC對細胞再染色，接著使用DAPI。這種再染色是必要的， 以便摻入的細胞能夠^皮在Celltracks Analyzer II系統(tǒng)上再獲取，并分 析。在Celltracks Analyzer II系統(tǒng)上對樣品進行掃描之后，對它們進 行評定光強度，其使用確定平均熒光強度(MFI)的軟件。
圖3A顯示使用被C11-PE亮染色的SKBR細胞的漂白。在漂白20 分鐘后，PE MFI從大約4000降到接近0。圖3B顯示CU-PE較暗染 色的PC3-9細胞(典型的CTC)的漂白。在漂白10 15分鐘后，PEMFI 從500-2000的范圍內(nèi)降至0。最終目標是使用標志物進行再染色，其中該標志物不是之前在起
始處理樣品過程中在CellTracks Autopr印(g)系統(tǒng)上所使用的標志物。 圖4中的圖像證明使用DAPI、 CD45 APC和CU-PE的染料組合提取 在CellTracks Autoprep⑧系統(tǒng)上的CTC的能力，漂白掉這些信號，接 著再用DAPI、 C11-FITC和p-AKT PE對細胞再染色。AKT是在通過 PI3K通路的細胞傳導中重要的激酶。該酶通過磷酸化而被激活，并且 已知在某些腫瘤中是組成型激活的。
圖4A顯示在CellTracks Autoprep⑧系統(tǒng)上從細胞捕獲的以及被 C11-PE染色的SKBR細胞的起始掃描。注意陰性FITC通道。圖4B顯 示在漂白以及使用C11-FITC再染色之后的樣品。注意陰性PE通道信 號。圖4C顯示在漂白以及使用C11-FITC和pAKT-PE再染色之后的樣品。
本發(fā)明能夠使用多個熒光生物標志物研究CTC，而這通常在采用 單處理頭見程的CellTracks Autoprep⑧系統(tǒng)和CellTracks Analyzer II系 統(tǒng)中是不可能的。這一點是通過漂白掉在起始批次中使用的染料的熒 光信號，并在柱體中使用附加的熒光生物標志物進行再染色，其中現(xiàn) 在可以使用相同的焚光通道對附加的熒光生物標志物進行再掃描。
本發(fā)明考慮使用后續(xù)再染色對相同的樣品進行多次再漂白。本發(fā) 明進 一 步考慮漂白處理，以及其對相同的細胞使用多特異性結(jié)合配偶 體檢驗的應用。因此，可以對細胞進行多參數(shù)分析，而不需要增加熒 光通道；不需要更多的濾波器，不需要更多的光源，也不會提高收集 和分析數(shù)據(jù)的裝置和軟件的復雜性。隨后，本發(fā)明將現(xiàn)有4色熒光分 析儀的能力擴展到進行"N，，參數(shù)分析，而不需要復雜和昂貴的設(shè)備改 進。本發(fā)明還允許用戶鑒定所關(guān)注的柱體、干燥或固定它們，接著將 它們保存用于以后高價值的分析。
本發(fā)明提供了使用相同高靈敏度的熒光團用于對相同的細胞進行 兩種或更多種分析，這對于使用本領(lǐng)域中的其他技術(shù)而言是不可能的。 例如，PE具有高吸收和熒光量子產(chǎn)額，這使得其非常適于檢測高靈敏 度標志物例如IGF-1R和p-AKT。這些標志物在目標細胞中的濃度低， 以至于如果抗體綴合物偶聯(lián)到FITC上而不是PE上，則它們無法:故檢 測到。在陽性細胞上剛好沒有足夠的IGF-1R以提供可使用FITC檢測 的信號，因為其靈敏度和量子產(chǎn)額較低。這對于P-AKT同樣是正確的，
9但在本發(fā)明中可以使用CK-PE對CTC進行鑒定，CK-PE信號被漂白 到0,使用抗-IGF-1R-PE進行再染色，和確定相同細胞的IGF-1R狀態(tài)。 IGF-1R信號可以被進一步漂白到0，并使用抗-p-AKT-PE對柱體進行 再次再染色。該方法能夠在相同的細胞上使用可以利用的最靈敏的焚 光染料對全部三種分析物進行檢驗。
本發(fā)明還能夠得到在樣品上收集到的其他高價值研究或臨床信 息，而不需要召回患者也不需要收集額外的樣品。發(fā)現(xiàn)了CTC或其他 所關(guān)注的目標，則可以使用本發(fā)明制備樣品，并檢驗這些CTC的性質(zhì) 并進行研究，而不需要對患者進行額外的侵入性程序。同樣，如果發(fā) 現(xiàn)樣品不含有所關(guān)注的目標，而不需要考慮其他高價值測試、程序和 試劑。這一點與其他方法不同，在其他方法中不管是否知道確實含有 所關(guān)注的目標之前都必須要加入測試試劑。
本發(fā)明進一步考慮對相同的細胞進行后續(xù)FISH分析，以尋找與所 觀察到的表達相關(guān)或者解釋所觀察到的表達的基因擴增、轉(zhuǎn)位或者突 變(break )。用于后續(xù)FISH分析的優(yōu)選手段包括使用無重復的探針(US. 12/067,532)。
一旦發(fā)現(xiàn)了 CTC或其他所關(guān)注的目標，則本發(fā)明能夠?qū)ζ溥M行詳 細分析。這在藥物開發(fā)過程中可以用于鑒定是否個體的CTC可能易于 受到目標藥物治療的影響。接著，其可以用于進一步探索或確認藥物 機理研究，這通過確定是否細胞內(nèi)或其他標志物如同體外研究所預測 的針對治療被上調(diào)、下調(diào)或磷酸化，因此提供了伴隨治療(companion diagnostics )。本發(fā)明可以用于提供最小侵入性方法以獲得樣品用于確 定患者對目標個性化藥物的適宜性。本領(lǐng)域中的其他已知應用例如但 不限于檢測在炎癥損傷中重要的白細胞亞群的激活狀態(tài)，或者白介素 爆發(fā)i例如敗血性休克。本發(fā)明的方法還可用作僅供研究(RUO)服務，
并可能最終作為可以返回到醫(yī)院和相關(guān)實^^室中的產(chǎn)品。
盡管已經(jīng)描述了并且在上面具體例證了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式， 但不意味著本發(fā)明限于這些實施方式?？梢詫ζ溥M行各種修改而不離 開本發(fā)明的主旨，在后面的權(quán)利要求書中描繪了這些改進的全部范圍。
權(quán)利要求
1.一種提高稀有事件分析中靈敏度的方法，所述方法包括a.通過熒光標記制備樣品；b.對所述樣品進行掃描以鑒定目標事件；c.從所述樣品抽吸流體以在相同的位置留下所述目標事件；d.對所述目標事件進行光漂白；e.使用第二熒光標記的標志物對所述目標事件進行再染色；f.對所述目標事件進行再掃描；以及g.對每個附加的熒光標記的標志物重復步驟c～f。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述第二標記的標志物是熒光抗體綴 合物、染料或其組合。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述掃描和所述再掃描是使用 CellTracks Autoprep 系統(tǒng)和CellTracks Analyzer II系統(tǒng)完成的。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述目標事件來自循環(huán)上皮細胞、循 環(huán)胂瘤細胞、循環(huán)內(nèi)皮細胞、白細胞、'淋巴細胞亞群、含有所關(guān)注細 胞器或受體的細胞、細胞碎片、破裂細胞和它們的碎片或其組合。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述目標事件是循環(huán)腫瘤細胞。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中附加的步驟是所述目標事件的多參數(shù) 基因型分布圖分析。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述基因型分布圖分析是FISH。
8. —種對混合細胞群中可疑目標細胞的檢測和計數(shù)進行確認的 方法，所述方法包4舌a. 從測試對象獲得生物樣本，所述樣本包含懷疑含有目標 細胞的混合細胞群；b. 通過免疫磁力富集分離所述可疑目標細胞的亞群；c. 通過多參數(shù)表型分布圖鑒定可疑目標細胞；d. 制備可疑目標細胞用于多參數(shù)基因型分布圖；以及e. 通過所述基因型分布圖對可疑目標細胞進行確認，其中 所迷個別可疑目標細胞含有所述目標細胞的表型和基因 型分布圖。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述表型分布圖包括a. 對可疑細胞和目標細胞進行熒光標記；b. 對所述可疑細胞和目標細胞進行掃描；c. 從所述樣品抽吸流體；d. 對所述樣品進行光漂白；以及e. 對所述可疑細胞和目標細胞進行再掃描。
10. 權(quán)利要求8的方法，其中所述目標細胞選自內(nèi)皮細胞、上皮細 胞、胎兒細胞、細菌細胞、心肌細胞、病毒感染細胞及其組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在生物樣品中進行稀有事件分析的高靈敏度多參數(shù)方法。使用熒光標志物對含有CTC或其他所關(guān)注細胞的血液樣品進行染色用于圖像分析，并進行掃描以鑒定目標細胞或亞細胞元件在柱體(cartridge)中的存在和位置。接著，將含有期望目標細胞或亞細胞元件的樣品進行進一步處理，部分通過光漂白，以便這些相同的目標可以被再分析，其使用附加的綴合到相同或不同熒光染料的生物標志物，并使用與進行起始分析相同的成像標準。本發(fā)明具有利用目標的應用，例如循環(huán)上皮細胞、循環(huán)腫瘤細胞、循環(huán)內(nèi)皮細胞、白細胞、淋巴細胞、含有所關(guān)注細胞器或受體的細胞、細胞碎片、破裂細胞和它們的碎片，或者其他任何可以被捕獲并成像的所形成元件。本發(fā)明提供了用于進一步研究所關(guān)注的個別目標的手段，特別是在與遺傳分析例如FISH結(jié)合時。
文檔編號B03C1/00GK101672779SQ20091016467
公開日2010年3月17日 申請日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月29日
發(fā)明者F·庫曼斯, M·C·康奈利, M·凱莉, S·格羅斯 申請人:維里德克斯有限責任公司