專利名稱：分離后可調節(jié)pH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種分離后可調節(jié)PH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置及其在氨基糖苷類抗生素分析中的應用，屬于微全分析系統(tǒng)的藥物分析檢測技術領域。
背景技術：
氨基糖苷類抗生素是一類由兩個以上的氨基糖與氨基環(huán)醇通過氧橋連接而成的苷類抗生素，如奇霉素、鏈霉素、阿米卡星、巴龍霉素、新霉素等，主要用于對抗格蘭氏陰性和陽性菌的感染。臨床上氨基糖苷類抗生素廣泛用于治療各種嚴重細菌性感染，但是該類藥物表現(xiàn)出較強的耳毒性，腎毒性，神經(jīng)和肌肉阻斷及變態(tài)反應等副作用，嚴重可導致聽力·和腎功能的損害，甚至危及生命，所以，使用時需要密切監(jiān)測其在體內(nèi)的濃度。另外，在動物養(yǎng)殖業(yè)中氨基糖苷類抗生素也是一類普遍使用的抗菌藥物。由于這些藥物在動物體內(nèi)的殘留，直接影響動物源性食品的質量與安全。因此，在臨床上和動物養(yǎng)殖與食品生產(chǎn)過程中，開發(fā)快速，簡單，靈敏和低成本的分析方法用于監(jiān)測氨基糖苷類抗生素在體內(nèi)和食品中的含量，對于保證人們的健康具有非常重要的意義。目前，氨基糖苷類抗生素的分析方法主要有微生物檢測法、酶免疫測定法、薄層色譜法、高效液相色譜法和毛細管電泳等。雖然它們在氨基糖苷類抗生素分析中得到了廣泛的應用與發(fā)展，但是均存在不同程度的局限性。其中，微生物檢測方法耗時費力，只能給出總的氨基糖苷類抗生素的粗略結果，準確性和重現(xiàn)性較差；酶免疫測定法受到酶和試劑本身條件的限制，一般無法同時測定多種氨基糖苷類抗生素；高效液相色譜法測定氨基糖苷類抗生素較為普遍，但是，氨基糖苷類抗生素缺少紫外發(fā)色團和熒光基團，無法直接采用紫外法或熒光法對其進行檢測，需要采取柱前或者柱后衍生化反應，引入發(fā)色團或熒光基團，再對其進行檢測，而且衍生化反應一般需要較長的時間(O. 5-1. 5h)，并且實驗步驟繁瑣，分析成本較高；質譜法與色譜聯(lián)用可以對氨基糖苷類抗生素進行較好的定性和定量分析，但儀器昂貴、運行成本高；毛細管電泳具有分離效率高、分析速度快、樣品和試劑消耗量少等優(yōu)點，亦被廣泛用于氨基糖苷類抗生素的分析，其中多數(shù)是采用分離前衍生化，再通過激光誘導熒光檢測。但是，由于毛細管與電化學和質譜檢測器受到接口問題的限制，因此，有關這方面的應用報道目前較少。微流控芯片毛細管電泳作為一種微型化的毛細管電泳技術，不僅囊括了毛細管電泳的基本功能，而且其尺寸更小、試劑消耗量更少、分析速度更快、并且易實現(xiàn)多通道平行分析以及能和其它操作單元整合等，特別適合于生物樣品的微量分析及功能研究，同時也在生命科學，新藥研發(fā)，疾病診斷，環(huán)境保護，食品檢驗，刑偵鑒定，太空探索等領域展示出巨大的應用前景。在許多與微流控芯片電泳聯(lián)用的檢測方法中，電化學檢測方法因其具有靈敏度高、選擇性好、設備簡單、易于集成和微型化等特點，已在微流控芯片電泳研究中發(fā)揮著重要作用，成為較廣泛采用的一種檢測方法。人們利用多種過渡金屬納米材料修飾電極，借助納米材料較大的比表面積和特殊理化性質，促進糖在電極表面的氧化和電子傳遞，提聞電極的靈敏度和穩(wěn)定性，用于測定糖和氣基酸等物質。對于多數(shù)中性糖類物質只有在強堿性(pH值大于12)的溶液中，糖醇基(羥基)才能解離為陰離子，對其進行電泳分離。但是，在強堿條件下使用較大分離電壓時，微通道內(nèi)產(chǎn)生較大的電流和焦耳熱，容易導致氣泡的產(chǎn)生，從而破壞電泳分離。由于氨基糖苷類抗生素含有多個氨基具有一定的堿性，在酸性和中性條件下易帶正電荷，因此，非常適合在酸性緩沖液中進行電泳分離，而且通過在分離緩沖液中添加陽離子表面活性劑，如十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)，可以進一步改善分離效果。由于電化學檢測糖和氨基糖苷類抗生素均需要強堿條件，其反應機理是強堿條件下高價態(tài)銅(三價)氧化物參加糖的電化學氧化反應過程，促進電子傳遞，降低反應活化能。為了更好地采用微芯片電泳分離和電化學檢測氨基糖苷類抗生素和糖類物質，我們設計一種新型微流控芯片裝置，可以在分離通道的末端加入強堿溶液，提高電極測定區(qū)域的PH值，既滿足氨基糖苷類抗生素電化學檢測所需要的堿性條件，又不影響其在酸性條件下的電泳分離，這種方法有助于氨基糖苷類抗生素在臨床上的合理使用和監(jiān)測其在食品中的殘留
發(fā)明內(nèi)容
·本發(fā)明的目的是提供一種分離后可調節(jié)pH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置及其在氨基糖苷類抗生素分析中的應用；本發(fā)明提供的分離后可調節(jié)PH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置，可以使工作電極測定區(qū)域達到檢測糖類物質所需的強堿性條件，而不影響電泳分離，實現(xiàn)在非強堿性背景緩沖溶液條件下，微流控芯片電泳分離與電化學測定氨基糖苷類抗生素，并且通過對電極的化學修飾，獲得性能較好的工作電極，以此建立快速、靈敏、可靠、低成本的微流控芯片電泳分離與安培法檢測生物樣品中氨基糖苷類抗生素的方法。本發(fā)明所提供的一種分離后可調節(jié)pH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置，它包括微流控芯片本體；所述微流控芯片本體包括分離通道，所述分離通道的一端分別與樣品池、緩沖溶液池和樣品廢液池相連通，另一端依次與輔助通道、W型通道、電極安置通道和緩沖液廢液池相連通；所述電極安置通道內(nèi)設有工作電極；所述輔助通道的另一端與堿性溶液儲液池相連通；所述輔助通道設于靠近所述W型通道處。上述的分離后可調節(jié)pH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置中，可利用所述堿性溶液儲液池與其它儲液池中液面高度差產(chǎn)生的靜壓力推動所述堿性溶液儲液池中的溶液沿著輔助通道進入與所述分離通道交匯的區(qū)域，實現(xiàn)分離后在分離通道末端加入堿性或其它衍生試劑，達到電化學檢測(或其他檢測方式)所需要的條件。上述的分離后可調節(jié)pH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置中，所述輔助通道和所述分離通道的連通處與所述電極安置通道之間連接的所述W型通道，可使來自分離通道和輔助通道內(nèi)的溶液能夠混合均勻，克服了直型通道內(nèi)單純層流擴散對溶液混合不均勻的問題，從而有效實現(xiàn)了微流控芯片在非強堿性背景緩沖溶液條件下的電泳分離與強堿性條件下的電化學檢測氨基糖苷類抗生素。上述的分離后可調節(jié)pH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置中，所述2個輔助通道具體以所述分離通道為中心呈對稱布置，使用時，利用與兩條輔助通道相連通的堿性溶液儲液池中液面高度差產(chǎn)生的液體靜壓推動強堿溶液進入與分離通道交匯的區(qū)域，實現(xiàn)在分離后(分離通道末端)加入堿性溶液，使工作電極測定區(qū)域達到檢測糖類物質所需的強堿性條件。上述的分離后可調節(jié)pH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置中，所述樣品池、緩沖溶液池和樣品廢液池與所述分離通道之間形成雙T型通道。所述輔助通道的高度和寬度均可為45 55 μ m,長度可為O. 2 I. Ocm ;所述W型通道的寬度和高度均可為45 55 μ m，長度可為I. 5 2. 5mm。上述的分離后可調節(jié)pH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置中，沿所述分離通道方向上，所述輔助通道與所述分離通道之間的夾角可為0° 180°，如45°，但不為0°和180。。上述的分離后可調節(jié)pH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置中，所述工作電極為表面鍍有Cu-Cr-Sn納米合金層的Pt絲；所述Pt絲的直徑可為20 30 μ m,所述Cu-Cr-Sn·納米合金層的平均厚度可為I. 5 3. O μ m。上述的分離后可調節(jié)pH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置中，所述工作電極是按照包括下述條件制備將清洗過的Pt絲置于多組分金屬鹽的電鍍液中進行電鍍；所用電鍍液由 CuSO4' Cr2 (SO4) 3、SnCl2' H2SO4 分別按照 50mM、0. 2mM、0. 2mM 和 IOmM 比例組成；所述電鍍的時間可為120 150s ;所述電鍍電位可為-O. 5 -O. 3V。本發(fā)明還提供了上述的分離后可調節(jié)pH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置在氨基糖苷類抗生素分析中的具體應用，如奇霉素、鏈霉素、阿米卡星、巴龍霉素和新霉素等在牛奶樣品中的測定。在本發(fā)明分析測定氨基糖苷類抗生素的方法中，具體可選擇PH為5. O的醋酸鈉溶液作為緩沖溶液；醋酸鈉緩沖溶液的濃度具體可為6. OmM ;醋酸鈉緩沖溶液中CTAB的濃度具體可為O. 6mM ;分離電壓具體可為-1200V ;檢測電位具體可為+0. 65V(vs Ag/AgCl)作為檢測電位。在上述較優(yōu)的檢測條件下，上述五種抗生素的最小檢測限在
2.I 4. 6μΜ范圍內(nèi)，峰電流和遷移時間的相對標準偏差都分別低于7. 9%和2. 0%(η=30)。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(I)本發(fā)明可在分離通道末端實現(xiàn)分離后加入堿性溶液，在不影響酸性條件下的電泳分離的同時，改變電極測定區(qū)域溶液的酸堿度，使其達到糖類物質的電化學反應所要求的堿性條件。(2)本發(fā)明中的工作電極是利用電沉積的方法將金屬納米合金(Cu-Cr-Sn)沉積在導電性良好的金屬(鉬)絲表面，提高了工作電極的穩(wěn)定性和靈敏度，獲得了較好性能的修飾電極，實現(xiàn)了微流控芯片電泳分離-電化學檢測氨基糖苷類抗生素的目標。( 3 )本發(fā)明為臨床上合理使用氨基糖苷類抗生素和有效監(jiān)測動物源性食品中此類藥物殘留，提供了一種快速，靈敏，可靠的藥物分析裝置和方法。


圖I是本發(fā)明提供的分離后可調節(jié)pH的聚合二甲基硅烷(PDMS)微流控芯片電泳-電化學檢測裝置；圖中各標記如下1樣品池、2緩沖溶液池、3樣品廢液池、4，5堿性溶液儲液池、6緩沖液廢液池、7雙T型通道、8分離通道、9輔助通道、IOff型通道、11工作電極、12電極安置通道、13檢測區(qū)。圖2是電極的掃描電子顯微鏡圖片，其中圖2 (A)、圖2 (B)、圖2 (C)和圖2 (D)分別為Cu/Pt、Cu-Cr/Pt、Cu-Sn/Pt和Cu-Cr-Sn/Pt修飾電極的掃描電子顯微鏡圖片(SEM)。圖3是電極在含有50 μ M阿米卡星的50mM NaOH溶液中掃描速率為IOOmV s—1的循環(huán)伏安曲線，其中曲線a、曲線b、曲線c和曲線d分別為Pt、Cu/Pt、Cu-Cr/Pt和Cu-Cr-Sn/Pt電極的循環(huán)伏安曲線；內(nèi)插圖為Cu-Cr-Sn/Pt修飾電極在空白和含有50 μ M阿米卡星的50mM NaOH溶液中循環(huán)伏安圖。圖4是不同pH的緩沖溶液對五種氨基糖苷類抗生素分離測定的影響。圖5是不同濃度的醋酸鈉緩沖溶液對五種氨基糖苷類抗生素分離測定的影響。圖6是不同CTAB濃度的緩沖溶液對五種氨基糖苷類抗生素分離測定的影響。圖7是不同分離電壓對五種氨基糖苷類抗生素分離測定的影響。圖8是不同檢測電位對五種氨基糖苷類抗生素測定的影響?！?br> 具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、分離后可調節(jié)pH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置如圖I所示，本發(fā)明提供的分離后可調pH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置包括一微流控芯片本體，該微流控芯片本體包括一分離通道8，該分離通道8的一端分別與樣品池I、緩沖溶液池2和樣品廢液池3相連通，并形成雙T型通道7 ;該分離通道8的另一端依次與W型通道10、電極安置通道12和緩沖液廢液池6相連通；該W型通道10的寬度和高度均為50 μ m，長度為2mm;電極安置通道12內(nèi)設有工作電極11，該工作電極11為表面鍍有Cu-Cr-Sn納米合金層的Pt絲,該Pt絲的直徑為25 μ m, Cu-Cr-Sn納米合金層的平均厚度為2. 5 μ m ;在分離通道8與W型通道10的連通處還與2個輔助通道9相連接，2個輔助通道9的高度和寬度均為50 μ m,長度為O. 5cm，且以分離通道8為中心呈對稱布置，在緩沖溶液池2至電極安置通道12的方向上，2個輔助通道9與分離通道8之間的夾角均為45° ；2個輔助通道9的另一端分別與堿性溶液儲液池4和5相連通。本發(fā)明提供的裝置可通過下述方法來制作(I)利用計算機輔助設計軟件(CAD)設計和繪制微流控芯片通道的結構(圖I所示)，用高精度打印設備制作光掩膜。(2)制備硅片模版取一塊直徑IOOmm左右的硅片，用濃硫酸(98%):雙氧水(30%) =3 1的Piranha溶液清洗，烘干。在潔凈的娃片上涂布光阻材料(photoresist) SU-82035,形成約50 μ m厚的膜層。然后將帶有設計好芯片圖樣(通道為透光部分)的光掩膜(黑白膠片)緊貼在涂有光阻材料的硅片上，經(jīng)高強度紫外光曝光處理；將曝光后的模版用丙二醇甲醚醋酸酯(propylene glycol methyl ether acetate)浸泡15min,除去未曝光部分的光阻材料，留下凸起的微通道，再用異丙醇沖冼，用氮氣流吹干，置于150°C條件下熱烘30min，自然冷卻后作為制作芯片的陽模備用。(3)高性能工作電極的制備(表面鍍有Cu-Cr-Sn納米合金層的Pt絲)配制含有所需金屬離子的電鍍液電鍍液的組成為50mM CuSO4,0. 2mM Cr2 (SO4) 3，O. 2mM SnCl2及IOmM的H2SO4 ;金屬絲預處理截取適當長度的直徑為25 μ m的Pt絲，分別用O. ImM HNO3、乙醇和水超聲清洗各lOmin，然后置于烘箱中105°C條件下烘烤30min。電化學修飾電極將上述處理的Pt絲插入到上述電鍍液中，在三電極體系(以Ag/AgCl為參比電極、Pt為輔助電極和25 μ m Pt絲為工作電極)中，以-O. 3V為恒定電位，電鍍時間為120 150s，將Cu-Cr-Sn納米合金電鍍于Pt絲表面。待電鍍完畢，取出Pt絲放入烘箱內(nèi)105°C條件下烘烤Ih左右,制得Cu-Cr-Sn納米合金修飾的Pt絲工作電極(Cu-Cr-Sn/Pt,直徑約
30μ m)，如圖2 (D)所示。(4) PDMS微流控芯片的制作取一定量的PDMS單體和固化劑按10:1的質量比混合均勻、除氣，傾注于上述制備的含有通道的硅片模版上，65°C加熱2h以上固化，冷卻后從模版上剝下含有通道的PDMS膠片，用打孔器在緩沖液池、樣品池、樣品池廢液池、緩沖液廢液池、以及兩個堿液池六個位置分別打孔，形成直徑為5mm的孔，然后將上述鍍有Cu-Cr-Sn納米合金的Pt絲(Cu-Cr-Sn/Pt，直徑約30 μ m)置于電極安置通道內(nèi)，與另一片平整的PDMS膠片一同置于等離子清洗器·中處理30s，然后，迅速取出將兩片PDMS對壓，形成密封的PDMS微流控芯片分析裝置。實施例2、本發(fā)明提供的PDMS微流控芯片電泳-電化學檢測裝置在氨基糖苷類抗生素分析中的應用如圖I所示，使用本發(fā)明時，在與兩條輔助通道9相連通的堿性溶液儲液池4和5處，加入高濃度堿性溶液(O. IM NaOH)，并使其液面的高度大于其它儲液區(qū)(樣品池I、緩沖液池2、樣品廢液池3和緩沖液廢液池6)液面的高度約I倍，利用溶液的靜壓差驅使堿性溶液儲液池4和5處強堿性溶液與來自分離通道的酸性緩沖液匯入分離通道8末端處，經(jīng)過W型通道10混合，使得檢測區(qū)13內(nèi)的溶液pH值大于12，從而可以有效實現(xiàn)在非強堿性分離緩沖溶液條件下，微流控芯片電泳分離與安培法測定氨基糖苷類抗生素的目標。下面以五種氨基糖苷類抗生素(奇霉素，鏈霉素，阿米卡星，巴龍霉素，新霉素)為例，說明本發(fā)明提供的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置在氨基糖苷類抗生素分析中的應用。實驗結果如下(I)不同電鍍條件下鉬絲表面特征比較圖2中的SEM結果表明，在不同電鍍條件下，工作電極電鍍層的形貌發(fā)生了顯著變化。圖2 (A)所示，當在只含有Cu2+金屬離子的電鍍液時，在Pt絲的表面附著了一層相對均勻但是較為疏松的Cu納米結構顆粒，這種修飾電極測定時的穩(wěn)定(A)較差；圖2 (B)所示，當在Cu2+的電鍍液中加入Cr2+時，與圖2 (A)相比，可以明顯的觀察到電鍍層變得致密牢固，這種修飾電極表現(xiàn)較好的穩(wěn)定性，但是靈敏度有所下降；圖2 (C)所示，當將Sn2+加入到Cu2+的電鍍液中，與圖2 (A)和圖2 (B)的結果比較，這種修飾電極的表面具有明顯的柱狀突起結構，具備相對較大的比表面積，表現(xiàn)出較高的靈敏度，但是穩(wěn)定性一般，而且鍍層易于脫落?；谝陨辖Y果，為了得到穩(wěn)定性好和靈敏度又高的工作電極，本發(fā)明采用含有Cu2+、Cr3+和Sn2+的混合金屬離子電鍍液，如圖2 (D)所示，電極鍍層的致密性和比表面積都獲得了較好的改善。因此，本發(fā)明采用電鍍Cu-Cr-Sn納米合金的修飾電極為工作電極測定氨基糖苷類抗生素，提高對分析物測定的穩(wěn)定性和靈敏度。(2) Cu-Cr-Sn/Pt修飾電極的電化學及電催化行為修飾電極的電化學性質及對阿米卡星的電化學行為如圖3所示。裸Pt絲電極(曲線a)在-O. 2V至+0. 8V電位之間掃描時，幾乎沒有任何氧化還原峰，說明在裸Pt絲電極上阿米卡星在此電位區(qū)間不具有電化學活性；Cu/Pt電極在+0. 65V左右可以觀察到有一個較明顯的氧化峰(曲線b)，為阿米卡星的氧化峰；Cu-Cr/Pt電極上，雖然電極的穩(wěn)定性獲得了較大的提高，但是阿米卡星的氧化峰降低(曲線c) ；Cu-Cr-Sn/Pt電極上，可以觀察到阿米卡星的氧化峰明顯增加(曲線d)，說明Sn2+增大了 Cu納米修飾電極的比表面積，提高了修飾電極的靈敏度。此外，內(nèi)插圖為Cu-Cr-Sn/Pt修飾電極在不含有和含有阿米卡星的50mM NaOH背景電解液中循環(huán)伏安曲線，從該圖中可以看出，當溶液中不含有阿米卡星時，在+0. 4V開始的正電位方向掃描有明顯氧化電流，對應Cu (II)氧化為Cu(III)的電流，在向負電位方向掃描時，在+0. 65V電位處出現(xiàn)一個明顯下陷還原峰，對應Cu(III)還原為Cu(II)的電流；當將阿米卡星加入到溶液當中時，正電位掃描時，在+0. 65V處出現(xiàn)了特征峰，說明了此峰是阿米卡星的氧化峰，而在負電位掃描時，在+0. 65V電位處下陷還原峰明顯變小，說明Cu(III)參與了阿米卡星的氧化，同時自身被還原為Cu(II)，這一現(xiàn)象也進一步驗證了Cu (III) /Cu (II)對氨基糖苷類抗生素的電催化氧化作用。
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(3)不同緩沖溶液pH對五種氨基糖苷類抗生素分離測定的影響在毛細管電泳中，由于緩沖液的pH值影響通道表面的荷電量和酸堿性藥物的解離程度。電滲流(EOF)作為電泳過程驅動溶液的動力，它的大小與通道表面的帶電量呈正t匕。由于氨基糖苷類抗生素結構中具有多個氨基，因此緩沖溶液的PH值是影響電泳分離檢測的重要參數(shù)之一。圖4考察了在pH 4. O 6. O范圍內(nèi)，分離緩沖溶液pH對五種氨基糖苷類抗生素分離檢測的影響。其測試條件為，運行緩沖溶液醋酸鈉6mM+CTAB O. 6mM ;分離電壓_1200V ；進樣電壓-400V/+100V ;進樣時間30s ;檢測電位+0. 65V (vs. Ag/AgCl)。其中，氨基糖苷類抗生素的進樣濃度為奇霉素(Spe) 134. 6 μ M，鏈霉素(Str) 91. 5 μ Μ，阿米卡星(Ami)85. 3 μ Μ，巴龍霉素(Par) 93. 4 μ Μ,新霉素(Neo) 73. 3 μ Μ。如圖4所示，隨著pH的不斷降低，五種抗生素的遷移時間逐漸延長，分離度逐漸增大。在pH 5. O的醋酸鈉緩沖液中，五種抗生素達到了較好基線分離。在本發(fā)明的應用中，經(jīng)過綜合考慮分析時間，分離效率和信噪比等因素，選擇pH為5. O的醋酸鈉溶液作為分離緩沖液。(4)不同緩沖溶液濃度對五種氨基糖苷類抗生素分離測定的影響緩沖溶液的組成和濃度對分離的選擇性、被測物的峰形以及分離效率都有著重要的影響。一般情況下，增大緩沖溶液的濃度將會減小雙電層、降低zeta電勢并且隨之會使EOF減小，導致遷移時間的延長，被分離物之間的分離度增大。在相同的pH條件下，通過改變醋酸鈉緩沖液濃度(2 IOmM)來考察其對五種抗生素分離測定的影響，其它測試條件同上述步驟(3)。如圖5所示，五種抗生素在不同緩沖液濃度的條件下都能達到基線分離，但是隨著醋酸鈉濃度的增加，五種抗生素的分離度逐漸增大，尤其是阿米卡星和巴龍霉素之間的分離度。當濃度增加到6. OmM時，被測物能達到較好基線分離。當緩沖溶液濃度超過6. OmM時，雖然分離度稍有增加，但是基線噪聲增大并且峰電流也開始減小。這種現(xiàn)象主要是由于隨著緩沖液的離子強度增強，使得EOF減小，焦耳熱增加。因此，導致分離效率、靈敏度以及穩(wěn)定性的降低?；谝陨锨闆r，在本發(fā)明的應用中，可選擇醋酸鈉濃度為6. OmM的緩沖溶液。(5)緩沖溶液中不同CTAB濃度對五種氨基糖苷類抗生素分離測定的影響氨基糖苷類抗生素屬于堿性糖，pKa大約在6 9之間，其能夠在中性和酸性溶液中帶正電荷。在陰極方向電泳分離模式中，帶正電物質應該早于EOF出峰。但如果溶液中加入陽離子表面活性劑，如CTAB，EOF則改變方向，此時在陽極方向電泳分離模式中，EOF向檢測區(qū)流動，此時，帶正電荷的物質的電泳方向與EOF方向相反，當EOF的的速度大于帶正電物質的電泳速度時，荷正電物質在EOF的驅動下最終到達檢測區(qū)。在緩沖溶液中加入陽離子表面活性劑實際上是增加了被分離物在通道內(nèi)的停留時間，相當于延長了分離通道的有效長度，從而改善分離效果。圖6考察了不同濃度的CTAB (O. 2 I. OmM)對五種氨基糖苷類抗生素分離測定的影響，其它測試條件同上述步驟(3)。
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從圖6中可以觀察到，五種抗生素在不同濃度CTAB的條件下都能達到較好基線分離，但是隨著CTAB濃度的不斷增加，五種抗生素的遷移時間逐漸縮短，這主要是由于CTAB濃度的增大，使通道表面的帶正電量增多，EOF增大，被測物在通道內(nèi)的遷移速度增大。但是當CTAB濃度大于O. 6mM時，CTAB在通道表面的吸附達到平衡，被分離藥物的遷移時間相對穩(wěn)定，但是基線噪音開始增大，峰電流降低。綜合考慮遷移時間、檢測靈敏度以及基線噪音等因素，在本發(fā)明的應用中，可選擇濃度為O. 6mM的CTAB。(6)不同分離電壓對五種氨基糖苷類抗生素分離測定的影響在毛細管電泳分離中，分離電壓也是改善檢測靈敏度一個重要參數(shù)。圖7為五種抗生素在不同分離電壓(-1400 -800V)條件下的電泳分離圖，其它測試條件同上述步驟(3)。如圖7所示，隨著電壓的降低，五種抗生素的遷移時間逐漸縮短；同時被測物的峰形也逐漸變的尖銳且更加對稱。但是當分離電壓低于-1200V時，分離度也逐漸降低并且噪音明顯增加。考慮到分析時間，分離效率，信噪比以及基線的穩(wěn)定性等因素，在本發(fā)明的應用中，可選擇-1200V為分離電壓。(7)不同檢測電位對五種氨基糖苷類抗生素測定的影響由于安培檢測法具有靈敏度高易于集成與微型化等優(yōu)點，本發(fā)明采用安培檢測法對被測物進行測定。圖8考察了在不同的檢測電位(+0. 4 +0. 9V)條件下，五種抗生素的峰電流變化曲線，其它測試條件同上述步驟(3)。如圖8所示，隨著檢測電位的開始逐漸增大，五種抗生素的峰電流逐漸增大。當檢測電位達到+0. 7V (對于奇霉素，達到+0. 6V)時，抗生素的峰電流達到最大。但是當繼續(xù)增大檢測電位時，噪音也開始增大。由于過高的檢測電位將導致更高的背景電流，從而使得被測物的峰電流降低，如圖8所示。因此本發(fā)明在測試過程中選擇+0. 65V(vs Ag/AgCl)作為檢測電位,這樣不僅可以達到最大的信噪比，而且修飾的工作電極也會在該檢測電位下具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。基于以上測定結果，在優(yōu)化的檢測條件下，五種抗生素的檢測限可以達到2. I 4. 6 μ M范圍內(nèi)，峰電流和遷移時間的相對標準偏差都分別低于7. 9%和2. 0% (η=30)。此外本發(fā)明還對實際樣品(牛奶)中的氨基糖苷類抗生素進行了分析，加標后平均回收率可以達到70%以上。以上結果說明，通過本發(fā)明的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置，在分離后加入堿性溶液，使得工作電極測定區(qū)域達到了檢測糖類物質所需的強堿性條件，而不影響其電泳分離，有效地實現(xiàn)了在非強堿性分離緩沖溶液條件下，微流控芯片電泳分離與安培法測定氨基糖苷類抗生素的目標；并且本發(fā)明開發(fā)的工作電極修飾方法，也顯著提高了檢測糖類物質的穩(wěn)定性和靈敏度。該發(fā)明為臨床上合理使用氨基糖苷類抗生素和有效監(jiān)測動物源性食品中殘留氨基糖苷類抗生素，提供了一種快速，靈敏，可靠的藥物分析方法?！?br> 權利要求
1.一種分離后可調PH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置，它包括微流控芯片本體；所述微流控芯片本體包括分離通道，所述分離通道的一端分別與樣品池、緩沖溶液池和樣品廢液池相連通； 其特征在于所述分離通道的另一端依次與2條輔助通道、W型通道、電極安置通道和緩沖液廢液池相連通；所述電極安置通道內(nèi)設有工作電極；所述輔助通道的另一端與堿性溶液儲液池相連通；所述W型通道設于靠近所述電極安置通道處。
2.根據(jù)權利要求I所述的裝置，其特征在于所述2條輔助通道以所述分離通道為中心呈對稱布置。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的裝置，其特征在于所述樣品池、緩沖溶液池和樣品廢液池與所述分離通道之間形成雙T型通道。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的裝置，其特征在于所述輔助通道的高度和寬度均為45 55 ii m，長度為0. 2 I. Ocm ;所述W型通道的寬度和高度均為45 55 y m,長度為L 5 2. 5mmo
5.根據(jù)權利要求1-4中任一所述的裝置，其特征在于沿所述分離通道方向上，所述輔助通道與所述分離通道之間的夾角為0° 180°，但不為0°和180°。
6.根據(jù)權利要求1-5中任一所述的裝置，其特征在于所述工作電極為表面鍍有Cu-Cr-Sn納米合金層的Pt絲；所述Pt絲的直徑為20 30 y m,所述Cu-Cr-Sn納米合金層的平均厚度為I. 5 3. Oii m。
7.根據(jù)權利要求6所述的裝置，其特征在于所述工作電極是按照包括下述步驟和方法制備的將所述Pt絲置于電鍍液中進行電鍍；所述電鍍液由CuS04、Cr2 (SO4) 3、SnCl2、H2S04的水溶液組成，其摩爾組成分別為50mM、0. 2mM、0. 2mM和IOmM ;所述電鍍的時間為120 150s，所述電鍍的電位為-0. 5 -0. 3V。
8.權利要求1-7中任一項所述的裝置在氨基糖苷類抗生素分析中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離后可調pH的微流控芯片電泳-電化學檢測裝置及其在氨基糖苷類抗生素分析中的應用。該分析裝置，主要由雙T型進樣通道、分離通道、兩條輔助通道、W型通道和電極安置通道構成。通過在微流控芯片中分離通道末端增加兩條輔助通道和W型通道，將堿性溶液經(jīng)輔助通道在電泳分離之后加入，再經(jīng)過W型通道將來自分離通道和輔助通道的溶液混合均勻，提高工作電極測定區(qū)域溶液的pH值，使其達到檢測糖類物質所需的強堿性條件，同時又不影響在酸性分離緩沖液條件下的電泳分離。本發(fā)明還借助金屬納米材料的較大比表面積和其特殊的催化性能，采用電沉積的方法將過渡金屬納米材料修飾在電極表面，獲得高性能工作電極，用安培法測定氨基糖苷類抗生素。
文檔編號B01L3/00GK102788831SQ20121028693
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月13日 優(yōu)先權日2012年8月13日
發(fā)明者丁永勝, 孟祥英, 白亮, 索興梅 申請人:中國科學院研究生院, 中央民族大學