專利名稱：多功能核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米材料和生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙熒光標(biāo)記的納米磁性 微球及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前，磁性納米硅球復(fù)合材料在生物技術(shù)研究領(lǐng)域得到了極大地發(fā)展，多種磁性 微球基于其高效的分離效率，簡單的樣本處理過程，無害的操作條件和易于功能化修飾等 優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于蛋白分離，細(xì)胞標(biāo)記，細(xì)胞檢測，細(xì)胞成像等。此外，基于四氧化三鐵 這一磁性材料的良好順磁性和易于合成、功能化的性質(zhì)，使之成為分離、富集、核磁成像、免 疫分析的重要研發(fā)對象，而硅納米球顆?；谄淞己玫纳镞m應(yīng)性，穩(wěn)定性，水溶性和易于 再修飾的能力，也得到了極大地關(guān)注與發(fā)展。于是，合成的磁性納米硅球復(fù)合材料保存了二 者的多種優(yōu)良性質(zhì)，比如超順磁性，大的比表面積，良好的生物適應(yīng)性，水溶性和易于修飾 的性質(zhì)等。熒光的引入更是極大地拓寬了磁性微球復(fù)合納米材料的應(yīng)用范圍，使得在納米 尺度下的實(shí)時(shí)檢測成為可能。此外，隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，在生物標(biāo)記、生物診斷上愈發(fā)迫切的需要多種可編碼 的磁性微球復(fù)合材料，熒光編碼微球成為一種主要的解決手段。熒光編碼微球指的是一種 負(fù)載了兩種或兩種以上熒光物質(zhì)的新型微球，通過調(diào)節(jié)熒光物質(zhì)的配比進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對微球的 光學(xué)編碼。如此，通過偶聯(lián)抗體等進(jìn)一步功能化修飾即可實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜樣品中的蛋白質(zhì)(抗 原)、基因、細(xì)胞進(jìn)行特異識別及診斷。目前主要的制備熒光編碼微球的方法有1、通過溶 脹的方法，將量子點(diǎn)包裹在微球表面。2、通過層層自組裝的方法將量子點(diǎn)吸附于微球表 面。3、利用微乳法，正硅酸乙酯水解包裹熒光物質(zhì)合成復(fù)合材料(高明遠(yuǎn)，涂赤楓，楊云華， CN1948383A.孫康，竇紅靜，陶可，CN101037205A.洪霞，白玉白，李軍等，CN1524925A. 葉 玲，于景嫻，王楠等，CN101671554A.)。而熒光編碼磁性微球的制備是一種集成了磁性和 熒光性質(zhì)的多功能納米微球，較之傳統(tǒng)的熒光編碼聚苯乙烯微球(多為微米級)，具備了更 多的優(yōu)點(diǎn)，包括納米比表面積大，超順磁性，易于功能化修飾等，因而極大地拓寬了復(fù)合材 料的應(yīng)用領(lǐng)域。這里，量子點(diǎn)和有機(jī)熒光染料均可作為編碼磁性微球納米復(fù)合材料的熒光 來源，而且量子點(diǎn)也有著諸多優(yōu)點(diǎn)，如寬的激發(fā)光譜，窄的發(fā)射光譜，不易光漂白等，然而量 子點(diǎn)也有著一些自身的缺點(diǎn)，如對環(huán)境的普遍敏感性，固有的生物毒性等(Zhou L, Gao C, Hu X, et al. ACS App1. Mater. Interfaces. 2010， 2(4): 1211-1219. King-Heiden T C, Wiecinski P N, Mangham A N, et al. Environ. Sci. Technol. 2009，43(5): 1605-1611.)。相比較而言，有機(jī)分子染料有著良好的生物適應(yīng)性和無毒性，因而仍然表現(xiàn) 出良好的應(yīng)用價(jià)值。此外，發(fā)展合成多功能化的磁性熒光納米微球材料的方法依然是生物納米技術(shù) 發(fā)展的關(guān)鍵。目前報(bào)道過的合成方法主要包括以磁性納米粒子為核心，外包硅層，而后氨 基化，再通過有機(jī)染料分子的異硫氰根與復(fù)合材料外層氨基反應(yīng)，偶聯(lián)上有機(jī)染料分子， (Jang J H, Lim H B. Microchem. J. 2010，94(2) 148-158. Zhang Y, Gong SffY, JinL, et al. Chinese Chem. Lett. 2009，20(8): 969-972.)不過這種偶聯(lián)方法會造成有 機(jī)分子占據(jù)復(fù)合材料的表面功能基團(tuán)，進(jìn)而影響進(jìn)一步的反應(yīng)，我們提出的原位制備方法 很好的解決了這一問題。同時(shí)，相對于制備雙核殼結(jié)構(gòu)的量子點(diǎn)熒光編碼復(fù)合材料(蘇星 光，王冠男.CN 101530766A.)，我們實(shí)現(xiàn)了熒光一步編碼，因而節(jié)省了操作步驟，并且，相 對于一種或兩種熒光素或量子點(diǎn)單獨(dú)標(biāo)記(李振奎，趙明行，樸承范等，CN101283276A.鄧勇 輝，楊武利，高海峰等，CN1523076A.)，這種雙熒光標(biāo)記可以制備更多的熒光編碼材料。此 外，相對于目前正在使用的磁性微球，多采用的是利用預(yù)制備的微球?qū)Υ帕Ｗ舆M(jìn)行再吸附 而制備(龐代文，謝海燕，王國平等，CN1869692A)。我們制備的磁性微球使用原位合成，因而 避免了磁粒子滲漏及不穩(wěn)定性。另外，我們只使用一種激發(fā)光即488nm激發(fā)光，即實(shí)現(xiàn)了雙 熒光發(fā)射，綜上，這種熒光編碼磁性微球更具前景優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可熒光編碼的納米磁性微球及其制備方法。本發(fā)明提供的可熒光編碼的納米磁性微球，為核殼結(jié)構(gòu)，其內(nèi)核為四氧化三鐵 (Fe3O4)磁性納米顆粒，該納米顆粒粒徑小于250nm，例如，粒徑一般在50—250 nm之間；外 殼為二氧化硅層，該二氧化硅層中含有兩種熒光素染料分子異硫氰酸熒光素(FITC)和異 硫氰酸羅丹明B (RBITC)；異硫氰酸熒光素(FITC)和異硫氰酸羅丹明B (RBITC)的不同質(zhì) 量比例，構(gòu)成不同熒光編碼的磁性微球；該磁性微球的粒徑小于320nm，例如，粒徑一般在 100—320 nm 之間。合成這一功能化熒光編碼磁性微球，是在微乳液中將兩種具有不同熒光的熒光 素異硫氰酸熒光素(FITC)和異硫氰酸羅丹明B(RBITC)以不同質(zhì)量比例混合，并與3-氨丙 基三甲氧基硅烷(APTMS)偶聯(lián)反應(yīng)，而后與正硅酸乙酯(TEOS)在氨水中共水解，在超順磁 性的狗304納米粒子表面，形成含有兩種熒光素的二氧化硅層外殼，即得到粒徑小于320nm， 熒光強(qiáng)度高，穩(wěn)定性好的熒光編碼磁性微球。這種制備方法避免了前述有機(jī)染料分子偶聯(lián)于硅層表面占據(jù)反應(yīng)位點(diǎn)的問題，同 時(shí)也避免了前述溶脹法中熒光分子滲漏的問題以及在層層組裝法中聚電解質(zhì)削弱熒光分 子信號的問題。這里，通過改變FITC和RBITC的配比比例即可達(dá)到調(diào)節(jié)復(fù)合微球的熒光變 化，從而實(shí)現(xiàn)對復(fù)合微球進(jìn)行熒光編碼的目的。正是基于這種在制備過程中加入了兩種不 同的熒光試劑，使得該復(fù)合微球在具備了超順磁性的前提下，可以通過調(diào)節(jié)熒光素的配比 以實(shí)現(xiàn)熒光編碼，因此可以稱之為熒光編碼磁性微球。對上述制備的熒光編碼磁性微球，通過進(jìn)一步的表面修飾，可以連接抗體、核酸適 配體、多肽、細(xì)胞因子等，進(jìn)而可以廣泛應(yīng)用于免疫檢測、核酸識別、核酸雜交、基因分析、細(xì) 胞識別、細(xì)胞成像等。例如通過硅烷化試劑進(jìn)行修飾，如利用氨基硅烷化試劑進(jìn)行表面氨基 化處理，進(jìn)一步偶聯(lián)抗體，實(shí)現(xiàn)生物識別、標(biāo)記功能。上述熒光編碼磁性微球的制備的具體步驟為
1、制備超順磁性的四氧化三鐵納米粒子；
2、制備熒光素包括FITC以及RBITC，在二者不同質(zhì)量配比條件下與APTMS偶聯(lián)的預(yù)聚
體；
3、室溫，微乳液條件下，不同配比的熒光素FITC-APTMS以及RBITC-APTMS預(yù)聚體與TEOS在氨水條件下共水解于磁性四氧化三鐵表面，制備得具有核殼結(jié)構(gòu)的熒光編碼的磁性 微球；
4、用氨基硅烷化試劑(如3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)，3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES))對上述方法制備的具有核殼結(jié)構(gòu)的熒光編碼的磁性微球進(jìn)行氨基再修飾，得到可 用于多種生物分析的氨基功能化熒光編碼磁性微球。上述步驟1，可采用水熱法制備得到四氧化三鐵納米粒子，該粒徑小于250nm。其 中，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度，可以調(diào)節(jié)四氧化三鐵納米粒子的粒徑。另外，在外加磁 鐵的輔助下，可方便的進(jìn)行磁性洗滌，而后真空干燥，備用。上述步驟2，通過調(diào)節(jié)FITC和RBITC的不同配比，其中FITC和RBITC的質(zhì)量配比 范圍為ιΓ10:1,即可達(dá)到調(diào)控?zé)晒鈴?qiáng)度的目的，從而控制后續(xù)合成的核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼 微球的種類。此外，所用反應(yīng)容器需先經(jīng)過5%氫氟酸溶液的洗滌，以除去玻璃容器可能帶 來的成核位點(diǎn)。上述步驟3，所用反應(yīng)容器需先經(jīng)過5%氫氟酸溶液的洗滌，以除去玻璃容器可能 帶來的成核位點(diǎn)。此處，可以通過調(diào)節(jié)熒光素預(yù)聚體與TEOS的配比，以及TEOS的用量，還有 TEOS與四氧化三鐵的用量配比等，可以達(dá)到調(diào)節(jié)最終制備的核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球的 硅殼層的厚度、粒徑。熒光素預(yù)聚體與TEOS的質(zhì)量配比為0. 00215: Γ0. 0355:1,TE0S與四 氧化三鐵的質(zhì)量配比為0. 93:廣9. 3:1，其中在四氧化三鐵量一定的情況下，TEOS的量每增 加1 μ L，顆粒粒徑約增加0. 04nm。上述步驟4，所述制備功能化熒光編碼磁性微球，是向核殼結(jié)構(gòu)的熒光編碼磁 性微球溶液中加入帶有氨基的硅烷化試劑，在復(fù)合材料表面進(jìn)行功能化修飾。具體是在 200C 40°C溫度下，在步驟3的制得磁性微球溶液(如l(T50mg制備的四氧化三鐵納米顆粒， 在10(Γ150 μ L不同濃度配比的FITC-APTMS及RBITC-APTMS混合溶液中，以及5(Γ 00 μ L 正硅酸乙酯和3(Γ60 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2(Γ30%的氨水條件下制備得到的熒光編碼磁性微球溶 液)中加入(如l(T50yL)氨基硅烷化試劑，繼續(xù)攪拌19 24h，而后再加入少量丙酮破乳，停 止攪拌，在外加磁鐵的幫助下，使用乙醇、去離子水磁性洗滌多次，即得到氨基功能化的熒 光編碼磁性微球。上述步驟中所使用的水均為雙蒸去離子水。在帶有氨基的硅烷化試劑對熒光編碼磁性微球進(jìn)行氨基化處理后，可增加該種復(fù) 合材料的生物適用性，不過由于修飾上的氨基會和二氧化硅表面的硅羥基發(fā)生作用，如此 會影響到二氧化硅表面的電荷密度，而該種復(fù)合材料的分散性能恰恰正是基于這種電荷的 排斥性能。于是，過量的氨基化試劑會減少復(fù)合微球在水相中的分散性，進(jìn)而引起聚集。這 時(shí)，可以考慮加入三羥硅基-3-丙基甲膦酸酯(THPMP)，加入的三羥硅基-3-丙基甲膦酸酯 與帶有氨基的硅烷化試劑的質(zhì)量比為1:廣2:1即可，這是一種含有甲基磷酸酯的惰性穩(wěn)定 劑，熒光編碼磁性微球表面的氨基會和甲基磷酸酯基結(jié)合，從而達(dá)到阻止復(fù)合微球團(tuán)聚的 效果。本發(fā)明的有益效果是，制備的熒光編碼磁性微球具有良好的熒光性能和磁性能， 以及生物穩(wěn)定性和水溶性，并可進(jìn)一步功能化修飾，適用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如藥物研發(fā)、懸 液芯片、生物標(biāo)記等，并且通過施加外加磁場，可實(shí)現(xiàn)對被分析識別分子、細(xì)胞的分離和純 化。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。圖1是制備多功能核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球所涉及到的化學(xué)反應(yīng)方程式。其 中
(a)所示為FITC和RBITC分別于APTMS反應(yīng)制備預(yù)聚體；
(b)所示為FITC與TEOS在氨水條件下發(fā)生共水解反應(yīng)；
(c)所示為RBITC與TEOS在氨水條件下發(fā)生共水解反應(yīng)；
(d)所示分別為FITC與TEOS共水解產(chǎn)物與APTES進(jìn)行氨基功能化修飾，RBITC與TEOS 共水解產(chǎn)物與APTES進(jìn)行氨基功能化修飾。圖2是水熱法合成的四氧化三鐵的掃描電子顯微鏡圖。圖3是核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球的透射電子顯微鏡圖。圖4是四氧化三鐵納米粒子和核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球的各自傅立葉紅外光 譜圖。圖5是核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球的χ-射線衍射圖。圖6是核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球的熒光光譜圖。圖1通過化學(xué)反應(yīng)方程式詳細(xì)的說明了如何制備熒光素-APTMS預(yù)聚體，TEOS與 FITC-APTMS以及RBITC-APTMS在氨水條件下如何共水解，以及如何實(shí)現(xiàn)在熒光編碼磁性微 球表面進(jìn)行氨基化修飾這一化學(xué)過程。圖2說明了本發(fā)明用以作為磁性核的四氧化三鐵 納米粒子是單分散的，均勻粒徑的(250nm)。圖3呈現(xiàn)了此核殼結(jié)構(gòu)的熒光編碼磁性微球， 粒徑 300nm，外圍硅層很好的包裹了磁性內(nèi)核。圖4通過四氧化三鐵納米粒子的傅立葉紅 外光譜和熒光編碼磁性微球的紅外光譜進(jìn)行比較，不難看出，在582CHT1吸收峰為四氧化三 鐵中的狗-0振動峰，二者均具有這一吸收峰，而熒光編碼微球的iogocnr1紅外吸收峰則為 Si-O的伸縮振動峰，由此進(jìn)一步證明了熒光編碼微球中的確含有二氧化硅層。圖5是熒 光編碼磁性微球的χ-射線衍射光譜圖，從圖中的(220)，(311)，(400)，(422)，(400)衍射 峰，比對文獻(xiàn)可以確定此為順磁性的四氧化三鐵晶型的特征峰，而(100)衍射峰則說明有硅 層存在，且這一二氧化硅硅層為不定型狀態(tài)。圖6是熒光編碼磁性微球的熒光光譜圖，在 488nm激發(fā)光激發(fā)下，在515nm，580nm分別有FITC、RBITC的發(fā)射光譜。
具體實(shí)施例方式在下文中將對本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的描述。本發(fā)明的熒光編碼磁性復(fù)合納米材料含有位于材料內(nèi)部的順磁性四氧化三鐵納 米粒子，以及包裹于其上的二氧化硅外殼，該外殼中含有兩種不同配比的有機(jī)熒光染料 (FITC和RBITC)，并可被硅烷化試劑進(jìn)行表面修飾。因此，本發(fā)明的熒光編碼磁性納米復(fù)合 材料即具備光學(xué)性能也具備磁學(xué)性能。本發(fā)明的熒光編碼磁性微球可以通過以下步驟制備 1、制備超順磁性四氧化三鐵納米顆粒。四氧化三鐵納米粒子的合成采用水熱法。首先，稱取六水合三氯化鐵 (FeCl3 ·6Η20) 1. 35g，溶于40mL乙二醇中，磁力攪拌30min，直到三氯化鐵完全溶解，得到黃色透明的溶液。然后依次加入3. 6g無水乙酸鈉，1. Og聚乙二醇，磁力攪拌30min，而后將所 得溶液轉(zhuǎn)入到50mLTef Ion-Lined不銹鋼反應(yīng)釜中，在200°C條件下反應(yīng)8 16h，反應(yīng)完成后 取出反應(yīng)釜自然冷卻至室溫。所得納米材料，利用強(qiáng)磁鐵的吸附作用，使用乙醇和去離子水 反復(fù)清洗多次，以除去乙酸鈉和乙二醇等水溶性雜質(zhì)，而后在60°C條件下真空干燥備用，所 得四氧化三鐵納米粒子粒徑為 250nm。2、制備 FITC-APTMS，RBITC-APTMS 預(yù)聚體。反應(yīng)所用的反應(yīng)瓶預(yù)先使用5%的氫氟酸清洗5min，而后除去洗液，并使用去離子 水沖洗，置于真空干燥箱干燥。取ImL乙醇置于干燥清潔的反應(yīng)瓶中，而后取不同質(zhì)量的FITC、RBITC溶于乙醇溶 液中，磁力攪拌條件下加入 ο μ LAPTMS，干燥、密閉、避光、攪拌反應(yīng)Mh。得到FITC-APTMS 以及RBITC-APTMS預(yù)聚體。3、制備核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球。反應(yīng)前，所用反應(yīng)瓶同樣預(yù)先使用5%氫氟酸清洗5min，而后除去洗液，并使用去 離子水沖洗，置于真空干燥箱干燥。在50mL圓底燒瓶中，加入7. 5mL環(huán)己烷，1. 77mLTriton X-100，1. 8mL的正己醇， 機(jī)械強(qiáng)力攪拌30min使之混勻，而后滴加250 μ L水溶液，繼續(xù)攪拌使之混勻，而后加入 l(T50mg前述制備的四氧化三鐵納米顆粒，輔之超聲，使得四氧化三鐵很好的分散在溶液 中，繼續(xù)攪拌12 15min，然后加入100 150 μ L不同濃度配比的FITC-APTMS及RBITC-APTMS 混合溶液，繼續(xù)攪拌5 8min，加入5(Γ 00 μ L正硅酸乙酯和30 60 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 30%的 氨水，在避光條件下持續(xù)攪拌2(T24h，之后加入IOyL丙酮破乳，停止攪拌。在外加強(qiáng)磁鐵 的吸附作用下，分別用乙醇和去離子水反復(fù)清洗反應(yīng)產(chǎn)物，即得到核殼結(jié)構(gòu)的熒光編碼磁 性微球，粒徑在 300nm，根據(jù)加入TEOS和!^e3O4量比的不同，可調(diào)節(jié)所得材料的粒徑。4、制備氨基功能化的熒光編碼磁性微球。前述步驟同上述3，在正硅酸乙酯同熒光素-APTMS預(yù)聚體共水解于四氧化三鐵 表面24h之后，加入氨基硅烷化試劑，如APTES，10^50 μ LAPTES加入到上述混合溶液，繼續(xù) 攪拌19 24h，而后再加入少量丙酮(IOyL)破乳，停止攪拌。在外加磁鐵的吸附作用輔助 下，分別用乙醇和去離子水反復(fù)清洗所得產(chǎn)物，即得到氨基功能化的具有核殼結(jié)構(gòu)的熒光 編碼磁性微球。為得到良好分散的氨基化熒光編碼磁性微球，可在加入APTES時(shí)，同時(shí)加入 3(Γ100 μ LTHPMP。實(shí)施例1
制備熒光配比(質(zhì)量比)FITC: RBITC=I 1的核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球。a、制備超順磁性四氧化三鐵納米顆粒。稱取六水合三氯化鐵(FeCl3 · 6H20) 1. 35g，溶于40mL乙二醇中，磁力攪拌30min， 三氯化鐵完全溶解。然后依次加入3. 6g無水乙酸鈉，1. Og聚乙二醇，磁力攪拌30min后將 所得溶液移至50mLTef Ion-Lined不銹鋼反應(yīng)釜中，在200°C條件下反應(yīng)8 16h，反應(yīng)完成后 取出反應(yīng)釜自然冷卻至室溫，使用乙醇和去離子水反復(fù)清洗多次，而后在60°C條件下真空 干燥備用。b、制備 FITC-APTMS，RBITC-APTMS 預(yù)聚體。取ImL乙醇置于干燥清潔，5%氫氟酸預(yù)處理過的反應(yīng)瓶中，而后取lmgFITC、ImgRBITC溶于乙醇溶液中，磁力攪拌條件下加入10μ LAPTMS，干燥、密閉、避光、攪拌反應(yīng) 24h，得到FITC-APTMS以及RBITC-APTMS混合的預(yù)聚體。C、制備核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球。在50mL圓底燒瓶中，加入7. 5mL環(huán)己烷，1. 77mLTriton X-100，1. 8mL的正己醇， 機(jī)械強(qiáng)力攪拌30min使之混勻，而后滴加250 μ L水溶液，繼續(xù)攪拌使之混勻后加入IOmg 步驟a制備的四氧化三鐵納米顆粒，輔之超聲，使四氧化三鐵均勻分散在溶液中，繼續(xù)攪拌 15min,加入150 μ L步驟b制備的FITC-APTMS及RBITC-APTMS混合溶液，繼續(xù)攪拌5min，而 后加入100 μ L正硅酸乙酯和60 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%的氨水，在避光條件下持續(xù)攪拌Mh，之 后加入10 μ L丙酮破乳，停止攪拌。在外加強(qiáng)磁鐵的吸附作用下，分別用乙醇和去離子水反 復(fù)清洗反應(yīng)產(chǎn)物，即得到核殼結(jié)構(gòu)的熒光編碼磁性微球。實(shí)施例2
制備熒光配比(質(zhì)量比)FITC:RBITC=4:1的氨基功能化的核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球。a、制備超順磁性四氧化三鐵納米顆粒，同實(shí)施樣例1步驟a。b、制備 FITC-APTMS，RBITC-APTMS 預(yù)聚體。取ImL乙醇置于干燥清潔，5%氫氟酸預(yù)處理過的反應(yīng)瓶中，而后取％^ 1幾、 ImgRBITC溶于乙醇溶液中，磁力攪拌條件下加入IOyLAPTMS,干燥、密閉、避光、攪拌反應(yīng) 24h，得到FITC-APTMS以及RBITC-APTMS混合的預(yù)聚體。C、制備核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球。在50mL圓底燒瓶中，加入7. 5mL環(huán)己烷，1. 77mLTriton X-100，1. 8mL的正己醇， 機(jī)械強(qiáng)力攪拌30min使之混勻，而后滴加250 μ L水溶液，繼續(xù)攪拌使之混勻后加入IOmg 步驟a制備的四氧化三鐵納米顆粒，輔之超聲，使得四氧化三鐵很好的分散在溶液中，繼續(xù) 攪拌15min，然后加入150 μ L步驟b制備的FITC-APTMS及RBITC-APTMS混合溶液，繼續(xù)攪 拌5min，加入100 μ L正硅酸乙酯和60 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%的氨水，在避光條件下持續(xù)攪拌 24h。d、制備氨基功能化的熒光編碼磁性微球。氨基硅烷化試劑，如APTES，10 μ LAPTES加入到步驟c反應(yīng)24h后的混合溶液中， 繼續(xù)攪拌19 24h，而后在加入少量丙酮(IOyL)破乳，停止攪拌。在外加磁鐵的吸附作用輔 助下，分別用乙醇和去離子水反復(fù)清洗所得產(chǎn)物，即得到氨基功能化的具有核殼結(jié)構(gòu)的熒 光編碼磁性微球。欲得到良好分散的氨基化熒光編碼磁性微球，只需在加入APTES時(shí)，同時(shí) 加入 30 μ LTHPMP。
權(quán)利要求
1.一種多功能核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球，其特征在于其內(nèi)核為四氧化三鐵磁性納 米顆粒，該納米顆粒粒徑小于250nm ；外殼為二氧化硅層，該二氧化硅層中含有兩種熒光素 染料分子異硫氰酸熒光素(FITC)和異硫氰酸羅丹明B (RBITC)；異硫氰酸熒光素(FITC) 和異硫氰酸羅丹明B (RBITC)的不同質(zhì)量比例，構(gòu)成不同熒光編碼的磁性微球；磁性微球的 粒徑小于320nm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球，其特征在于通過進(jìn)一 步的表面修飾，其表面還連接有抗體、核酸適配體、多肽或細(xì)胞因子。
3.一種多功能核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球的制備方法，其特征在于具體步驟如下1)采用水熱法制備超順磁性的四氧化三鐵納米粒子；該納米顆粒粒徑小于250nm；2)制備熒光素FITC以及RBITC二者不同質(zhì)量配比條件下與APTMS偶聯(lián)的預(yù)聚體；3)室溫，微乳液條件下，不同配比的熒光素FITC-APTMS以及RBITC-APTMS預(yù)聚體與 TEOS在氨水條件下共水解于磁性四氧化三鐵表面，制備得具有核殼結(jié)構(gòu)的熒光編碼的磁性 微球；該磁性微球粒徑小于320nm ；4)使用氨基硅烷化試劑對上述方法制備的具有核殼結(jié)構(gòu)的熒光編碼的磁性微球進(jìn)行 氨基再修飾，得到可用于多種生物分析的氨基功能化熒光編碼磁性微球；其中，F(xiàn)ITC為異硫氰酸熒光素，RBITC為異硫氰酸羅丹明熒光素，APTMS為3-氨丙基三 甲氧基硅烷。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多功能核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球的制備方法，其特征在 于所述氨基硅烷化試劑為3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)或3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多功能核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球的制備方法，其特征在于 調(diào)節(jié)FITC和RBITC的不同質(zhì)量配比范圍為1 Γ10:1,即可達(dá)到調(diào)控?zé)晒鈴?qiáng)度的目的，從而 控制后續(xù)合成的核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼微球的種類。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的多功能核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球的制備方法，其特征 在于熒光素預(yù)聚體與TEOS的質(zhì)量配比為0. 00215: Γ0. 0355:1, TEOS與四氧化三鐵的質(zhì)量 配比為0. 93:1 9. 3:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的多功能核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球的制備方法，其特征 在于步驟4)是在20°C 40°C溫度下，在步驟3)制得的磁性微球的溶液中加入氨基硅烷化 試劑，繼續(xù)攪拌19 24h，而后再加入少量丙酮破乳，停止攪拌，在外加磁鐵的幫助下，使用乙 醇、去離子水磁性洗滌多次，即得到氨基功能化的熒光編碼磁性微球。
全文摘要
本發(fā)明屬于納米材料和生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種多功能核殼結(jié)構(gòu)熒光編碼磁性微球及其制備方法。在水熱法合成四氧化三鐵納米粒子的基礎(chǔ)上，將同樣預(yù)制備的熒光素偶聯(lián)3-氨丙基三甲氧基硅烷產(chǎn)物與正硅酸乙酯在氨水中共水解，得到兼具熒光、磁性，以及具有良好生物穩(wěn)定性和生物適應(yīng)性的多功能熒光磁性納米復(fù)合材料。并可通過調(diào)節(jié)熒光素FITC與RBITC的配比達(dá)到制備多種熒光編碼磁性微球的目的，同時(shí)根據(jù)加入的正硅酸乙酯和四氧化三鐵量比的不同，亦可調(diào)節(jié)所得材料的粒徑。此外，對獲得的這種多功能化復(fù)合納米材料進(jìn)行了表面氨基硅烷化修飾，進(jìn)一步拓寬了該種新型熒光編碼磁性微球的生物應(yīng)用范圍，使之在生物醫(yī)學(xué)技術(shù)，藥物研發(fā)，懸液芯片等領(lǐng)域表現(xiàn)出極大地應(yīng)用前景。
文檔編號B01J13/02GK102120168SQ20101057651
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者孔繼烈, 張正勇, 李會香 申請人:復(fù)旦大學(xué)