一種具有高效解磷作用的黑曲霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高效的解磷菌黑曲霉(Aspergillusniger)。本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.8240。本發(fā)明涉及的黑曲霉(Aspergillusniger)具有較高的解磷作用，不污染環(huán)境，生態(tài)安全。該高效黑曲霉(Aspergillusniger)單獨使用或與其它植物生長所需要的有機、無機營養(yǎng)成分一起使用，制備成生物復(fù)合肥料具有提高產(chǎn)量和改良品質(zhì)的作用。
【專利說明】一種具有高效解磷作用的黑曲霉菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物和生物肥料領(lǐng)域，特別是涉及黑曲霉，具體而言，本發(fā)明涉及一種高效解磷作用的黑曲霉及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]磷肥能夠促進(jìn)植物花芽分化，提早開花結(jié)果，促進(jìn)幼苗根系生長和改善果實品質(zhì)。施磷能夠促進(jìn)各種代謝正常進(jìn)行，植物生長發(fā)育良好，同時提高植物的抗寒性和抗旱性。由于磷與糖類、蛋白質(zhì)和脂肪的代謝和三者相互轉(zhuǎn)變都有關(guān)系，多以不論栽培糧食作物、豆類作物和油類作物都需要磷肥。缺磷時，蛋白質(zhì)合成受阻，新的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核形成較少，影響細(xì)胞分裂，生長緩慢，也少，分枝或分蘗減少，植株矮小，葉片暗綠，可能是細(xì)胞生長慢，葉綠素含量相對提高。某些植物葉子有時呈紅色或紫色。因為缺磷阻礙了糖分運輸，也自己累了大量的糖分，有利于黃色素苷的形成。缺磷時，開花期和成熟期都延遲，產(chǎn)量降低，抗性減弱。但我國有74%的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷為無效形式，植物很難直接吸收利用，此外，大量使用化肥明顯造成土壤板結(jié)、土壤保水力下降、草地退化、荒漠化嚴(yán)重等不良后果。因此，提高磷的利用率一直是農(nóng)學(xué)、土壤學(xué)、生態(tài)環(huán)境和微生物學(xué)研究者關(guān)注的執(zhí)占。
[0003]人們在20世紀(jì)初開始注意到微生物與土壤磷之間的關(guān)系。Sackett (1908年)發(fā)現(xiàn)一些難溶性的復(fù)合物施入土壤中，可以被作為磷源而應(yīng)用，他們從土壤中篩選出50株細(xì)菌，其中36株在平板上形成了肉眼可見的溶磷圈。1948年Gerretsen發(fā)現(xiàn)植物施入不溶性的磷肥，經(jīng)接種土壤微生物后，促進(jìn)了植株的生長，增加磷的吸收。他分離出了這些微生物，發(fā)現(xiàn)這些微生物可幫助磷礦粉的溶解。從此，許多科學(xué)家致力于解磷菌的研究，相繼報道了許多微生物具有解磷作用。`
[0004]本申請發(fā)明人經(jīng)過多年悉心研究，從植物根際土壤中分離到一株新的黑曲霉菌株，該菌株具有較強的解磷作用，能把無效的磷有效的轉(zhuǎn)變成可用磷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種新的黑曲霉菌株，所述菌株具有較好的解磷作用。
[0006]本發(fā)明所述的黑曲霉(Aspergillus niger)已經(jīng)于2013年9月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.8240.進(jìn)一步地，本發(fā)明提供上述黑曲霉在解磷方面的用途。
[0007]進(jìn)一步地，本發(fā)明的黑曲霉可以制成微生物菌劑，即將所述菌株在H)培養(yǎng)液中(馬鈴薯200克，葡萄糖20克，水1000 mL)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27 °C，培養(yǎng)天數(shù)為5天，轉(zhuǎn)速為200 rpm，培養(yǎng)液過濾后，將菌液細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)為IO8個/mL，即制得本發(fā)明的黑曲霉微生物菌劑。
[0008]本發(fā)明所提供的黑曲霉是從植物根際土壤中分離得到的，其實驗室命名為菌株Fdpal0
[0009]菌株Fdpal在PDA固體培養(yǎng)基在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，肉眼觀察菌落生長特征、測量菌落生長速度，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形狀及孢子大小、形狀、類型等。通過觀察發(fā)現(xiàn)，自中伸出，直徑15~20pm，長約I~3mm，壁厚而光滑。頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗，小梗上長有成串褐黑色的球狀，直徑2.5~4.0 μ m。分生孢子頭球狀，直徑700~800 μ m，褐黑色。蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面無色或中央略帶黃褐色。根據(jù)《真菌鑒定手冊》等方法初步鑒定菌株Fdpal為黑曲霉屬，利用分子生物學(xué)技術(shù)對其ITS序列鑒定后該菌為黑曲霉Aspergillus niger。
[0010]本發(fā)明的效果
在平板法中，即將解磷菌在含有難溶性磷酸鹽或有機磷的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落周圍產(chǎn)生較大的溶磷圈，本發(fā)明的黑曲霉經(jīng)磷鑰藍(lán)分光光度法測得其解磷效果為537.142mg/L,說明本發(fā)明菌株具有較強的解磷作用。
【具體實施方式】
[0011]本發(fā)明公開了一種高效解磷菌黑曲霉，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)來實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，這些都被視為包括在被發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明所述的黑曲霉已經(jīng)通過較規(guī)范的實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不擺脫本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動和適當(dāng)?shù)淖兏c組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0012]下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0013]實施例1微生物從土樣中的分離
從河北衡水湖附近采回的黃頂菊根際土壤，稱取IOg 土壤用90mL無菌水進(jìn)行混勻，然后在從中取ImL樣用9mL無菌水進(jìn)行稀釋`，以此進(jìn)行6次，稀釋成10_6、10_7、10_8 3個梯度，移取最后三個梯度的菌懸液100微升，涂布于蒙金娜無機磷培養(yǎng)基(葡萄糖10 g，(NH4)2SCM
0.5 g, NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eS047H20 0.03 g，MnS044H20 0.03 g，MgS047H20 0.3 g,磷礦粉10 g，酵母膏0.4 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 ml, pH 7.0~7.5)平板上，以最后一次的稀釋液作為對照，于28°C下培養(yǎng)，并每24h觀察一次。選擇對照中無菌落，而此前的稀釋液中長出菌落的菌株，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等特征跳取單菌落于液體蒙金娜無機磷培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并純化編號。
[0014]實施例2解磷菌株的篩選
在無菌環(huán)境下，將所有菌株接種到蒙金娜培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)7天。觀察平板中菌落生長情況，根據(jù)產(chǎn)生解磷圈大小篩選出高效解磷菌。
[0015]實施例3菌株的ITS序列測定和分析及生理生化試驗鑒定
ITS鑒定:將篩選菌株的孢子液接入ro液體培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)48 h，過濾獲得菌絲，提取真菌基因組DNA。以提取的真菌DNA作為模板，以ITS5和ITS8引物對進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，反應(yīng)體系為:基因組DNA IyL, 10XPCR buffer 2.5 μ L，NSl 弓丨物 I μ L, NS8 弓丨物 I μ L, dNTPs 2 μ L, Taq 酶 0.25 μ L, ddH20 17.25 μ L。反應(yīng)條件為:94°C 5 min，94°C 30 s，57°C 50 s，72°C 50 s ;循環(huán) 30 次；72°C 10 min。PCR 擴增產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司測序后，將獲得的DNA序列，輸入NCBI，用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中的所有序列進(jìn)行比較分析。
[0016]同源比較結(jié)果如下:
將該PCR擴增產(chǎn)物在GenBank中進(jìn)行blast比對結(jié)果表明，本發(fā)明的菌株Fdpal與其高度同源的50個菌種均是黑曲霉屬，其同源性均在99%以上。經(jīng)過序列分析顯示，本發(fā)明所分離的菌株屬于黑曲霉。
[0017]實施例4本發(fā)明所述黑曲霉微生物菌劑的制備
將保藏編號為CGMCC N0.8240的黑曲霉在H)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)液溫度為27 V,天數(shù)為5天,轉(zhuǎn)速為200rpm, pH值為8。發(fā)酵培養(yǎng)后，加入5%的鹿糖,然后過濾并調(diào)節(jié)菌液細(xì)胞數(shù)為IO8個/mL，即制得本發(fā)明的黑曲霉微生物菌劑。
[0018]實施例5鑰銻鈧比色法測定微生物解磷能力
在含磷的溶液中，加入鑰酸銨，在一定酸度條件下，溶液中的磷酸與鑰酸絡(luò)合形成黃色的磷鑰雜合酸一磷鑰黃，然后用抗壞血酸加酒石酸銻鉀作還原劑，可以使磷鑰雜多酸轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的藍(lán)色溶液(鑰藍(lán))，其顏色深淺與磷含量成正比關(guān)系，由此可進(jìn)行比色定量.用分光光度計在波長700 nm處測定鑰藍(lán)的吸光值，以定量分析磷含量。
[0019]磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
依次吸取0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL 5 mg/L磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液入試管，各加入2 mL鋁鋪抗顯色劑，以蒸懼水定容至20 mL,搖勻靜置15-20 min后,700 nm下測定吸光度“以吸光度為縱坐標(biāo)，以磷濃度為橫坐標(biāo)，繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線”，此時各管中磷濃度分別為:0.00,0.20、
0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L。
[0020]培養(yǎng)液中可溶性磷含量的測定
取I mL在難溶性無機磷液體培養(yǎng)基(葡萄糖10 g，(NH4)2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl0.3 g，MgSO4.7Η20 0.3 g，F(xiàn)eSO4.7H20 0.03 g，MnSO4.H2O 0.03 g, Ca3 (PO4)2 5.0 g，定容至1000 mL, pH 7.0~7.5)中培養(yǎng)4d后的菌體發(fā)酵液以10000 g離心10 min，上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后加吸取200 PL入比色板，再加入鋁銻抗顯色劑2 mL,蒸餾水定容至20 mL,靜置15-20 min后，700 nm下測定可溶性磷含量為537.142 mg/L。
[0021]本發(fā)明的一種高效解磷菌黑曲霉及其應(yīng)用已經(jīng)通過具體的實例進(jìn)行了描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可借鑒本
【發(fā)明內(nèi)容】
，適當(dāng)改變原料、工藝條件等環(huán)節(jié)來實現(xiàn)相應(yīng)的其它目的，其相關(guān)改變都沒有脫離本發(fā)明的內(nèi)容，所有類似的替換和改動對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，都被視為包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種黑曲霉(Aspergillus niger)，其特征在于，保藏編號為CGMCC N0.8240，其于2013年9月24日保藏在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黑曲霉在土壤解磷方面的應(yīng)用。
3.—種微生物菌劑，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌在H)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)液溫度為27 °C，天數(shù)為5天，轉(zhuǎn)速為200 rpm，然后過濾并調(diào)節(jié)菌液細(xì)胞數(shù)為IO8個/mL，即制得微生物菌劑。
【文檔編號】B09C1/10GK103805518SQ201310474986
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】時翠平, 趙斌, 霍靜倩, 董金皋, 張金林, 齊萌 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)