專利名稱：植物與微生物聯(lián)合修復(fù)油污污染濕地的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物與微生物聯(lián)合修復(fù)油污污染濕地的方法。
背景技術(shù)：
石油的大規(guī)模開采、冶煉、運(yùn)輸、使用和處理過程中，污染、遺漏、井噴、輸油管道泄 漏等事故頻發(fā)，導(dǎo)致嚴(yán)重的土壤污染[文獻(xiàn)1 劉國(guó)良，蘇幼明等.石油污染土壤生物修復(fù) 研究新進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程，2008，25(1) :1-4]。石油烴進(jìn)入土壤后，會(huì)破壞土壤結(jié) 構(gòu)，分散土粒，使土壤透水性降低，其富含的反應(yīng)基能與無機(jī)氮、磷結(jié)合并限制硝化作用和 脫磷酸作用，從而使土壤有效氮、磷的含量減少。其中的多環(huán)芳烴等，因具有“三致”效應(yīng)和 通過食物鏈在生物體內(nèi)富集[文獻(xiàn)2 曾憲軍，劉登魁.微生物修復(fù)受石油污染土壤的研究 進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)2006，(2) :36-38，39]。對(duì)生態(tài)環(huán)境、食品安全和人身健康構(gòu)成嚴(yán) 重威脅，成為困擾環(huán)境領(lǐng)域重要的社會(huì)與環(huán)境問題。有關(guān)土壤恢復(fù)技術(shù)的發(fā)展。在80年代以前，常采用熱處理法和化學(xué)浸出法進(jìn)行 治理，但熱處理法代價(jià)太昂貴很難實(shí)施，化學(xué)浸出法采用化學(xué)溶劑帶來二次污染問題。80 年代后期，生物修復(fù)方式因其經(jīng)濟(jì)、有效并對(duì)環(huán)境破壞性小等諸多優(yōu)點(diǎn)，近年來發(fā)展尤為迅 猛。生物修復(fù)是依靠植物、微生物的吸收和分解氧化作用經(jīng)細(xì)胞的分解同化，使有機(jī)物轉(zhuǎn)變 為細(xì)胞的組成部分或者變?yōu)镠2O和CO2排出體外，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)污染的修復(fù)。分為原位生 物修復(fù)和異位生物修復(fù)兩種。在已被石油污染的自然區(qū)域內(nèi)，由于微生物存在的廣泛性會(huì)通過自然馴化作用 而產(chǎn)生一定數(shù)量的嗜油微生物[文獻(xiàn)3 =Whyte L. G. Assessment of the biodegradation potential ofpsychrotrophicmicr oorganism[J]. CanadianjournalofMicrobiology, 1996,42(2) :99-106]。能氧化石油烴及其化合物的微生物菌種在自然界分布廣泛。少量烴 類進(jìn)入土壤時(shí)，不但不會(huì)影響土壤的通氣性，同時(shí)還作為土壤有機(jī)質(zhì)促進(jìn)土壤微生物活性， 有利于污染物的降解。但進(jìn)入土壤的油濃度過高時(shí)，土壤孔隙就會(huì)被堵塞，影響通氣性，對(duì) 微生物造成不利影響，而且大量土壤結(jié)構(gòu)的活性表面會(huì)被油類包裹，使微生物失去良好的 活動(dòng)場(chǎng)所，微生物的活性受到抑制，其降解能力下降[文獻(xiàn)2 曾憲軍，劉登魁.微生物修復(fù) 受石油污染土壤的研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)2006，(2) :36-38，39]。植物是一個(gè)有效的土壤污染處理系統(tǒng)，主要通過直接吸收石油污染物、釋放分泌 物和酶、刺激根區(qū)微生物的活性并強(qiáng)化生物轉(zhuǎn)化作用。植物促進(jìn)有機(jī)污染物的降解一方面 是由于根際作用增加了微生物降解菌的數(shù)量，另一方面是因?yàn)橹参锓置谟袡C(jī)物為微生物共 代謝提供了基質(zhì)底物。微生物的活動(dòng)也促進(jìn)了根系分泌物的釋放。另外，植物還可為微生 物提供生存場(chǎng)所和可轉(zhuǎn)移的氧氣，使根區(qū)的好氧轉(zhuǎn)化作用得以正常進(jìn)行。不同植物由于不 同的根特性，具有不同的修復(fù)效果。有研究表明，植物根系分泌物刺激了細(xì)菌的轉(zhuǎn)化作用， 在根區(qū)形成了有機(jī)碳，根細(xì)胞的死亡也增加了土壤有機(jī)碳，這些有機(jī)碳的增加可阻止石油 污染物向地下水轉(zhuǎn)移，也可增強(qiáng)微生物對(duì)石油污染物的礦化作用。已報(bào)道的各種有機(jī)污染 物的修復(fù)研究表明，草本植物和豆科植物(如紫花苜蓿)較其它植物在污染物根際修復(fù)中可能具有更大的應(yīng)用潛力。污染土壤植物根際微生態(tài)環(huán)境對(duì)微生物活性具有誘導(dǎo)作用，有 利于石油烴的降解和污染土層的生物修復(fù)。大草原植物與其內(nèi)生微生物聯(lián)合對(duì)石油烴的 降解活性研究，其中黑麥草增加了內(nèi)生寄生微生物系統(tǒng)對(duì)根際土壤中烷烴的降解率減少了 根際系統(tǒng)對(duì)根際土壤中PAH的降解。表明，生長(zhǎng)在石油污染土壤中的不同植物種屬特性不 同，不同種分布的微生物種群，能影響植物對(duì)烴類的降解[文獻(xiàn)4 :Lori A. Phillips, James J. Germida et al. Hydrocarbon degradation potentialand activity of endophytic bacteriaassociated with prairie plants[J]. Soil Biology&Biochemistry,2008,40 3054-3064]。趙愛芬等在石油污染的水稻田中分離出的微生物Bacillussp，僅在有水稻根 分泌物的情況下才能在石油的殘留物中生長(zhǎng)，表明水稻根分泌物促進(jìn)了特定微生物消除石 油殘留物[文獻(xiàn)5 趙愛芬，趙雪，常學(xué)禮.植物對(duì)污染土壤修復(fù)作用的研究進(jìn)展[J]. 土壤 通報(bào)，2000，31(1) :43-46]。利用生物修復(fù)污染土壤是一種安全，環(huán)境友好型的土壤治理方法。該修復(fù)技術(shù)不 僅能修復(fù)被石油污染的土壤，而且對(duì)更多種有毒有害污染的土壤修復(fù)有效。已被事實(shí)證明， 生物修復(fù)污染土壤是一項(xiàng)實(shí)用性和有效性很強(qiáng)的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物與微生物聯(lián)合修復(fù)油污污染濕地的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種植物與微生物聯(lián)合修復(fù)油污污染濕地的方法，其特征在于該方法的具體步驟 為a.采集待修復(fù)的受油污污染濕地的土壤，用含有所受的油污的無機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行 土著嗜油菌的篩選，并擴(kuò)大化培養(yǎng)篩選土著嗜油菌，將其以尿素濃度為40g/L，過磷酸鈣濃 度為15g/L的營(yíng)養(yǎng)底物，制作成0D_ ^ 1. 5的活性菌制劑；b.在油污污染的濕地土壤中種植薦草幼苗或薦草種子，種植密度為2500 5000 株/m2;待幼苗生長(zhǎng)旺盛時(shí)期，將步驟a所得的活性菌制劑按質(zhì)量比為100 1的比例加入 到種植有薦草幼苗的根系土壤中，待開花期、成熟期結(jié)束后，在嗜油菌群與植物根系的共同 作用下，修復(fù)油污污染的濕地。上述的受油污污染為受汽油、柴油、重油、原油或廢棄油污排放帶來的油類有機(jī) 物污染。上述的受油污污染的土壤中油污的濃度為1000 20000mg/kg。上述的土著嗜油菌的篩選為在100ml含有100mg/L油污濃度的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中 培養(yǎng)IOg受油污污染的土壤，每天取樣涂油污平板、分離菌種；再將該菌種加入到含有更高 油污濃度的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分離菌種，如此反復(fù)至最終含油污的濃度為8460mg/L，篩 選出最終菌種；將最終篩選得到的菌種接種于富集培養(yǎng)基中，置于37°C、100 150r/min的 搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體；重新懸浮于滅菌營(yíng)養(yǎng)液中，制成0D_ ^ 1. 5的活性 菌制劑。上述的含有所受的油污的無機(jī)鹽培養(yǎng)基為K2HP04lg，KH2PO4Ig, NaCl 0. 5g, NH4 (SO4) 20. 5g，MgSO4O. 2g，KNO3O. 2g，CaCl2O. 02g, NaCl 0. 5g，F(xiàn)eCl3 痕量，微生素母液 0. lml, 8. 46 84. 6g 油污，蒸溜水 1000ml, pH 7. 5。
上述的富集培養(yǎng)基為蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉5g/L，油污42. 3g/L，蒸 餾水 1000ml/L, pH 7. 5，上述的菌制劑營(yíng)養(yǎng)底物為尿素40g/L，過磷酸鈣15g/L，蒸餾水1000ml/L，pH 7. 5。在石油烴污染土壤上種植薦草，薦草的生長(zhǎng)及其根際微生物的活動(dòng)以及分泌物和 酶的作用，加入土壤的嗜油菌對(duì)石油烴有良好的降解效果，薦草的能夠促進(jìn)嗜油菌對(duì)土壤 中石油烴污染物的降解，因此通過種植薦草可降解土壤中過量的石油烴，從而達(dá)到清除土 壤中石油烴污染的目的，可以成功避免二次污染。本發(fā)明所采用的薦草(Scirpus triqueter L.)多年生水生挺水草本植物，生于河 邊、溪塘邊、沼澤地及低洼潮濕處，具有較好的觀賞價(jià)值。植物分類學(xué)特征如下具長(zhǎng)的匍匐 根狀莖。稈散生，粗壯，高20 100cm，三棱形，基部具2 3個(gè)葉鞘，鞘膜質(zhì)，最上一個(gè)鞘頂 具葉片。葉片扁平，長(zhǎng)1. 3 5. 5cm,寬1. 5 2mm。苞片1枚為稈的延長(zhǎng)，三棱形，長(zhǎng)1. 5 7cm,側(cè)枝聚傘形花序假側(cè)生，有1 8個(gè)輻射枝，輻射枝三棱形，棱上粗糙，長(zhǎng)達(dá)5cm，每輻射 枝頂有1 g個(gè)簇生的小穗；小穗卵形或長(zhǎng)圓形，長(zhǎng)6 12mm，3 7mm，密生多數(shù)花，鱗片 長(zhǎng)圓形、橢圓形或?qū)捖研?，長(zhǎng)3 4mm，膜質(zhì)，黃棕色；下位剛毛3 5條，與小堅(jiān)果略等長(zhǎng)， 有倒刺；雄蕊3 ；花柱短，柱頭2。小堅(jiān)果倒卵形，平凸?fàn)?，長(zhǎng)2 3mm，成熟時(shí)褐色，具光澤。 花果期6 9月。繁殖與栽培有性繁殖即種子繁殖。3 4月份在室內(nèi)播種，用盆裝入培養(yǎng)土并整 平壓實(shí)，后將催好芽的種子撒播在上面，然后灑上一層細(xì)紗或土覆蓋種子，再將播好種的盆 浸入水中。保持室溫20 25°C，20天左右即可發(fā)芽生根。無性繁殖在清明節(jié)前后，把越 冬苗從田或盆中挖出，把土抖掉，用枝剪或快刀將地下莖切成若干塊叢，每叢8 12個(gè)莖 芽，進(jìn)行栽種。露地栽培，選擇水景區(qū)適合的位置，在地面上挖穴栽植，株行距30cm左右，如 肥沃地(池)，當(dāng)年即可旺盛生長(zhǎng)連成片。盆栽，選用無泄漏地水盆，每盆栽8株左右，保持 25°C左右溫度及淺水(1 3cm) 15天左右即可發(fā)芽。在生長(zhǎng)發(fā)育季節(jié)時(shí)，應(yīng)及時(shí)清除田中、 盆中雜草，初期水淺，中期深水，后期淺水，以促使地下莖越冬芽地形成，提高來年的繁殖系 數(shù)。生長(zhǎng)期內(nèi)需施1 2次追肥，冬季要清除枯葉。本發(fā)明通過種植石油烴修復(fù)植物薦草與嗜油菌聯(lián)合作用來修復(fù)石油烴污染土壤。 該方法與傳統(tǒng)土壤治理方法相比，具有投資少、工程量小、技術(shù)要求不高等優(yōu)點(diǎn)，無二次污 染。修復(fù)進(jìn)程不僅不會(huì)破壞土壤生態(tài)環(huán)境，還有助于改善因石油烴污染而引起的土壤退化 和生產(chǎn)力下降，恢復(fù)并提高其生物多樣性。另外，薦草挺拔直立，色澤光雅潔凈，主要用于水 面綠化或岸邊、池旁點(diǎn)綴，較為美觀，也可盆栽庭院擺放或沉入小水景中作觀賞用。全草入 藥，主治食積氣滯，呃逆飽脹。莖可織席，編草鞋，又可用于造紙。具有良好的生態(tài)效益。


圖1薦草與土著嗜油菌群降解后剩余柴油含量圖2薦草與土著嗜油菌群降解柴油的效率圖3薦草與土著嗜油菌群降解柴油各組分情況
具體實(shí)施例方式供試柴油供試柴油為零號(hào)柴油上海市寶山區(qū)中石化明和加油站購(gòu)買。實(shí)施例子薦草與土著嗜油菌群的除油戶外試驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)于2009年8月進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)在上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)實(shí)驗(yàn)樓五樓露天陽(yáng) 臺(tái)，該研究所處上海市寶山區(qū)，屬濕帶半濕大陸性季風(fēng)氣候，年降水量在500 600左右。 試驗(yàn)用原始石油污染土壤取自黃浦江-長(zhǎng)江口濕地土壤，并從中篩取出本實(shí)驗(yàn)所采用的三 種嗜油菌株。清潔土壤取自上海大學(xué)東區(qū)花壇，過2mm篩后，按沙土比2 3均勻混合，并 配置成不同柴油濃度梯度的土壤。配置成5個(gè)濃度梯度，分別為1000mg/kg，5000mg/kg， 10000mg/kg, 15000mg/kg，20000mg/kg。實(shí)驗(yàn)共設(shè)三個(gè)處理，分別為油污土(空白組)、油 污土接種菌(微生物組)、油污土接種菌種入藤草(實(shí)驗(yàn)組)。接種菌懸液為將嗜油菌 在30°C下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心后收集菌體，將其懸浮于尿素濃度為40g/L，過磷酸鈣濃度為 15g/L的營(yíng)養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)吸光度(OD66tl)為1.5，菌懸液為三種菌株的1 1 1混合液。每 千克土壤中營(yíng)養(yǎng)菌懸液的加入量為IOml。根據(jù)土壤水分豐缺狀況，不定期澆水，使土壤飽和 含水。澆入菌液時(shí)利用小鐵鏟松動(dòng)表土，松土?xí)r不要傷到薦草的根，從而保證菌液的均勻分 布與土壤中氧氣充足，利于薦草和微生物的生長(zhǎng)繁殖。實(shí)驗(yàn)共歷時(shí)60天，在實(shí)驗(yàn)過程中間歇采取土樣測(cè)定其中柴油含量與組分發(fā)生的 變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下1)不同處理濃度下嗜油菌群對(duì)柴油的降解效率在不同污染物濃度處理下，薦草對(duì)污染物顯示出了較強(qiáng)的耐受性，無表觀毒害特 征，植株均生長(zhǎng)良好。從圖1各組樣品的剩余殘油量可以看出，嗜油菌群使土壤中柴油有較 大的降解效果，在薦草與嗜油菌的共同作用下，使土壤中殘油量進(jìn)一步的減少。如圖2所示 各組樣品的降解率，在各種污染物濃度下，薦草與嗜油菌的共同作用使得降解率有了更大 的提高。污染土壤植物根際微生態(tài)環(huán)境對(duì)微生物活性具有誘導(dǎo)作用，有利于石油烴的降解 和污染土層的生物修復(fù)。嗜油菌對(duì)柴油的降解率達(dá)到12. 6 55.0%，薦草嗜油菌共同作用 下，柴油降解率達(dá)到13. 6 61. %。在低濃度柴油的土壤中，由于柴油揮發(fā)性與檢測(cè)分析 域值的影響，降解率出現(xiàn)峰值。而現(xiàn)實(shí)是，隨著土壤中柴油濃度的增大，在薦草與嗜油菌的 共同作用下柴油的降解率提高。2)薦草聯(lián)合嗜油菌作用下對(duì)柴油組分的降解效果剩余殘油經(jīng)氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)(如圖3)，嗜油菌群降解作用下，柴油組分的相對(duì) 含量并未發(fā)生明顯的變化，正構(gòu)烷烴各組分的峰值仍在C19左右，而在植物薦草與嗜油菌的 聯(lián)合作用下，正構(gòu)烷烴組分各組分的相對(duì)含量發(fā)生了明顯的變化，從C17 C24的正構(gòu)烷烴組 分均有了很大程度的降解。
權(quán)利要求
一種植物與微生物聯(lián)合修復(fù)油污污染濕地的方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.采集待修復(fù)的受油污污染濕地的土壤，用含有所受的油污的無機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行土著嗜油菌的篩選，并擴(kuò)大化培養(yǎng)篩選土著嗜油菌，將其以尿素濃度為40g/L，過磷酸鈣濃度為15g/L的營(yíng)養(yǎng)底物，制作成OD600≈1.5的活性菌制劑；b.在油污污染的濕地土壤中種植藨草幼苗或藨草種子，種植密度為2500～5000株/m2；待幼苗生長(zhǎng)旺盛時(shí)期，將步驟a所得的活性菌制劑按質(zhì)量比為100∶1的比例加入到種植有藨草幼苗的根系土壤中，待開花期、成熟期結(jié)束后，在嗜油菌群與植物根系的共同作用下，修復(fù)油污污染的濕地。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物與微生物聯(lián)合修復(fù)油污污染濕地的方法，其特征在于所 述的受油污污染為受汽油、柴油、重油、原油或廢棄油污排放帶來的油類有機(jī)物污染。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物與微生物聯(lián)合修復(fù)油污污染濕地的方法，其特征在于所 述的受油污污染的土壤中油污的濃度為1000 20000mg/kg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物與微生物聯(lián)合修復(fù)油污污染濕地的方法，其特征在于所 述的土著嗜油菌的篩選為在IOOml含有100mg/L油污濃度的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)IOg受 油污污染的土壤，每天取樣涂油污平板、分離菌種；再將該菌種加入到含有更高油污濃度的 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分離菌種，如此反復(fù)至最終含油污的濃度為8460mg/L，篩選出最終菌 種；將最終篩選得到的菌種接種于富集培養(yǎng)基中，置于37°C、100 150r/min的搖床培養(yǎng)至 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體；重新懸浮于滅菌營(yíng)養(yǎng)液中，制成0D_ ^ 1. 5的活性菌制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的受油污污染濕地的微生物修復(fù)方法，其特征在于所述的含有 所受的油污的無機(jī)鹽培養(yǎng)基為K2HP04lg，KH2PO4Ig, NaCl 0. 5g，NH4 (SO4) 20. 5g，MgSO4O. 2g， KNO3O. 2g，CaCl2O. 02g, NaCl 0. 5g，F(xiàn)eCl3 痕量，微生素母液 0. Iml,8.46 - 84. 6g 油污，蒸餾 水 1000ml，pH 7·5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的受油污污染濕地的微生物修復(fù)方法，其特征在于所述的富 集培養(yǎng)基為蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉5g/L，油污42. 3g/L，蒸餾水1000ml/L，pH 7. 5，
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的受油污污染濕地的微生物修復(fù)方法，其特征在于所述的菌制 劑營(yíng)養(yǎng)底物為尿素40g/L，過磷酸鈣15g/L，蒸餾水1000ml/L，pH 7. 5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物與微生物聯(lián)合修復(fù)油污污染濕地的方法。該方法具體為采集待修復(fù)的受油污污染濕地的土壤，用含有所受的油污的無機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行土著嗜油菌的篩選，并擴(kuò)大化培養(yǎng)篩選土著嗜油菌，將其以尿素濃度為40g/L，過磷酸鈣濃度為15g/L的營(yíng)養(yǎng)底物，制作成OD600≈1.5的活性菌制劑；在油污污染的濕地土壤中種植藨草幼苗或藨草種子，種植密度為2500～5000株/m2；待幼苗生長(zhǎng)旺盛時(shí)期，將步驟a所得的活性菌制劑按質(zhì)量比約為100∶1的比例加入到種植有藨草幼苗的根系土壤中，待開花期、成熟期結(jié)束后，在嗜油菌群與植物根系的共同作用下，修復(fù)油污污染的濕地。該方法與傳統(tǒng)土壤治理方法相比，具有投資少、工程量小、技術(shù)要求不很高等優(yōu)點(diǎn)，無二次污染。修復(fù)進(jìn)程不僅不會(huì)破壞土壤生態(tài)環(huán)境，還有助于改善因石油烴污染而引起的土壤退化和生產(chǎn)力下降，恢復(fù)并提高其生物多樣性。
文檔編號(hào)B09C1/00GK101954373SQ20101029095
公開日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者劉曉艷, 張新穎, 曹正楠, 杜靜麗, 王君, 王珍珍, 蘇鵬程, 蔡倩, 鐘成林 申請(qǐng)人:上海大學(xué)