專利名稱：一種用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化顆粒制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞固定化技術(shù)，具體的說是一種用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化顆粒制備方法，其是以玉米芯為主要載體的吸附固定化微生物工藝。
背景技術(shù)：
多環(huán)芳烴(PAHs)是指2個或2個以上的苯環(huán)稠合在一起的一類化合物，它們在環(huán)境中普遍存在。人類活動特別是化石燃料的燃燒是環(huán)境中PAHs的主要來源。由于該類化合物的辛醇-水分配系數(shù)高，水溶性差，常被吸附于土壤顆粒上。因此，土壤就成為PAHs的主要載體。PAHs在土壤中比較穩(wěn)定而且難于分解，即便采用處理土壤中易揮發(fā)、易降解有機污染物較成功的方法也很難去除土壤中的PAHs。多環(huán)芳烴在自然界中的積累會對人類以及整個自然界造成極大的危害，一些多環(huán)芳烴進入人體和動物體內(nèi)后，會產(chǎn)生致癌、致畸、致突變的后果。因此，有關(guān)PAHs污染土壤的修復(fù)技術(shù)倍受關(guān)注。盡快開發(fā)出安全、高效、實用性強的多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)技術(shù)，是科研工作者面臨的艱巨而緊迫的任務(wù)。
近年來，發(fā)展起來的微生物修復(fù)技術(shù)為PAHs的降解提供了較好的途徑，但也存在一些缺陷，如單位體積內(nèi)有效降解菌濃度低、反應(yīng)啟動慢、與土著菌競爭處于劣勢、抗毒性侵害能力差、對環(huán)境條件敏感，加入到修復(fù)現(xiàn)場環(huán)境中的微生物可能由于競爭或難以適應(yīng)環(huán)境而導(dǎo)致作用結(jié)果與實驗結(jié)果有較大出入，使得不能很好的應(yīng)用于原位污染土壤修復(fù)。因此，亟需開發(fā)更高效更適合于原位多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的新型生物技術(shù)，而微生物固定化技術(shù)可以克服這些弊端。
所謂固定化技術(shù)，是利用化學(xué)或物理的手段，將游離的細胞(微生物)或酶定位于限定的空間區(qū)域使其保持活性并能反復(fù)使用的一種基本技術(shù)。其優(yōu)點是可以大幅度提高參加反應(yīng)的微生物濃度，固定化后的微生物耐環(huán)境沖擊性增強，根據(jù)需要可選擇適宜的微生物，可降低二次污染等優(yōu)點，因而被廣泛用于修復(fù)受污染的流體介質(zhì)(如廢水)和半流體介質(zhì)(如泥漿)環(huán)境中。但將固定化微生物用于降解非流體介質(zhì)(土壤)中有機污染物的研究，國內(nèi)外尚未見報道。本發(fā)明提出了一種用于修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤的固定化顆粒制備方法。
微生物固定化技術(shù)的關(guān)鍵是篩選適宜的載體材料和確定優(yōu)化的固定化工藝條件。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于修復(fù)多環(huán)芳烴污染土壤的固定化顆粒制備方法。本發(fā)明通過系統(tǒng)的正交試驗，以玉米芯為主要載體材料，添加不同濃度的促進劑、改良劑，使固定化條件更加簡化和溫和，提高了固定化微生物的多種技術(shù)指標，使其性能更加優(yōu)良。將制得的固定化顆粒應(yīng)用于多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)，結(jié)果表明按照該配方制得的固定化生物產(chǎn)品對高分子量多環(huán)芳烴污染土壤具有良好的修復(fù)效果，是一種可信賴的新型環(huán)保生物產(chǎn)品。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案(固定化顆粒制備方法)為一種用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化顆粒制備方法，其特征在于以玉米芯為主要載體材料，將新鮮、干燥、經(jīng)粉碎或輾碎至1.5～2cm玉米芯，與輔料棉仁餅、麩皮、豆餅粉、稻糠和/或麥麩混合，按重量百分比計，其中玉米芯70～85％，輔料15～30％；調(diào)節(jié)水分重量為含水量40～55％(以“手握成團，落地就散”無游離水滲出為適度)，調(diào)pH為6.3～6.5，高壓滅菌，接入長滿真菌孢子的原種，增殖培養(yǎng)，便制得所需固定化顆粒。
其中玉米芯和輔料的混合物中還添加有它們總重量0.5～1.5％的石膏、1～2％的生石灰，以及1.5～2.5％的(NH4)2HPO4、0.5～1.5％的白糖、0.1～0.3％的MgSO4·7H2O或0.5～1.5％的尿素、2～4％的過磷酸鈣。
載體配方可為1.玉米芯2kg，棉仁餅0.2kg，麩皮0.16kg，石膏0.02kg，尿素0.016kg，過磷酸鈣0.04kg，石灰0.06kg；2.玉米芯2kg，麩皮0.06kg，豆餅粉0.02kg，尿素0.02kg，過磷酸鈣0.06kg，石膏0.02kg，石灰0.06kg；3.玉米芯2kg，棉仁餅0.15kg，尿素0.02kg，過磷酸鈣0.05kg，石膏0.02kg，生石灰0.06kg；4.玉米芯80％，稻糠20％，石膏1％，(NH4)2HPO42％，白糖1％，MgSO4·7H2O 0.1％，生石灰1％；5.玉米芯80％，麥麩20％，石膏1％，(NH4)2HPO42％，白糖1％，MgSO4·7H2O 0.1％，生石灰1-2％；其中第4和5兩配方較佳。
所述玉米芯在與輔料混合前應(yīng)先進行軟化處理，具體操作方法為采用玉米芯重量0.5～1.5％生石灰溶于水中后，澆入料中，浸透拌勻，蓋上薄膜悶24～48h，用水沖洗后即可；所述原種為毛霉、木霉、產(chǎn)黃青霉、黑曲霉和/或曲霉菌種，增殖培養(yǎng)為的避光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25～32℃；原種的培養(yǎng)基重量組成最好為玉米粒98～99％，石膏1～2％，pH6.3～6.5；其中還可添加培養(yǎng)基總重量0.1～0.3％的KH2PO4，0.05～0.2％的MgSO4·7H2O，0.5～1％的尿素；較佳的原種培養(yǎng)基配方為玉米粒99％，石膏1％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，尿素0.8％。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.本發(fā)明通過優(yōu)化載體配方各組分的含量，采用軟化等技術(shù)，制備的固定化顆粒為微生物提供了更適合的微環(huán)境，與土著菌的競爭力增強，對環(huán)境中毒物的抗性增加，可以在不良環(huán)境中仍然發(fā)揮高效降解菌對多環(huán)芳烴的降解作用；載體表面具有許多化學(xué)活性基團，這些基團經(jīng)該固定化方法活化后可以與微生物偶聯(lián)，使微生物細胞吸附到玉米芯載體表面，或者以共價方式與玉米芯結(jié)合，提高了固定化效率；該固定化方法簡單易行，適宜原位土壤大規(guī)模修復(fù)。
2.本發(fā)明通過向載體中添加麥麩、稻糠等輔助材料，使得C、N比更適合微生物生長，菌絲體密集且粗壯，穿透性、傳質(zhì)性增強，從而極大地縮短了固定化微生物的制備周期，提高了對多環(huán)芳烴的降解能力；高分子量多環(huán)芳烴一般以共代謝的方式被降解，玉米芯除作為微生物載體外，還可為微生物提供初級共代謝底物，誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生降解多環(huán)芳烴所必需的酶類，從而實現(xiàn)對高分子量多環(huán)芳烴的共代謝降解；固定化顆粒對受芘(PYR或苯并[a]芘(BaP)等高分子量多環(huán)芳烴污染土壤的修復(fù)中具有明顯的修復(fù)效果，在投粒比10％、修復(fù)時間56d的條件下，土壤中PYR去除率為81.2％，最高可達90％，而對BaP的去除率為62％，較游離菌提高20％。
3.本發(fā)明亦可用于產(chǎn)黃青霉屬、青霉屬、毛霉屬、木酶屬等多種菌種的固定化，是一種普適的固定化方法。載體材料價格便宜，成本低，來源廣泛，通氣性良好，無毒，不會造成土壤的二次污染，亦可增加土壤肥力。
具體實施方案下面通過實例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
實施例1(1)固定化菌斜面培養(yǎng)在裝有無機鹽培養(yǎng)基(蔗糖4.0％，(NH4)2HPO40.4％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，維生素B10.005％，pH6.5)的試管中接種毛霉，置于28～30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。
(2)原種制備選取新鮮無霉變玉米粒，煮30min，裝入培養(yǎng)瓶中，用聚乙烯薄膜塑料密封，于121℃條件下高壓滅菌90min，置于無菌室中待溫度降至20℃，用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上接入真菌孢子，密封，放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中，待玉米粒上長滿灰白色菌絲時取出，備用。
(3)固定化載體預(yù)處理將新鮮、干燥、經(jīng)粉碎或輾碎至1.5～2cm大小的玉米芯，1％生石灰溶于水中后，澆入料中，浸透拌勻，蓋上薄膜悶24h，用自來水沖洗2次，然后與其他輔料混合均勻(玉米芯80％，稻糠20％，石膏1％，(NH4)2HPO42％，白糖1％，MgSO4·7H2O 0.1％，生石灰1％)，含水量50％，調(diào)pH6.5，分裝瓶中，壓實，打孔后用聚乙烯薄膜塑料密封，高溫蒸汽滅菌90min，置于無菌室中待溫度降到20℃，備用。
(4)固定化顆粒制備取8粒長滿真菌孢子的玉米粒原種，接入裝有載體的培養(yǎng)瓶，密封后放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，待菌絲體穿透玉米芯載體，布滿培養(yǎng)瓶，便制得以玉米芯為載體的固定化顆粒。
經(jīng)上述步驟制得的固定化顆粒周期短，只需24d，孢子數(shù)1×106個/g。
(5)對受多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)效果將制備好的固定化顆粒按10％投粒比，投入受多環(huán)芳烴污染的土壤中，56d后，土壤中PYR的去除率為75％；土壤中BaP的去除率為48％。在整個降解過程中，固定化顆粒的降解速度快，90d后固定化顆粒仍然具有90％以上的活性。
實施例2與實施例1不同處之一在于原種制備時配方為玉米粒99％，石膏1％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，尿素0.8％，高溫蒸汽滅菌后，接入孢子懸著液，1×104孢子/ml，于28℃恒溫培養(yǎng)10d后即可制得原種；不同處之二在于在載體的預(yù)處理過程中，輔料成分由稻糠改為麥麩，即玉米芯80％，麥麩20％，石膏1％，(NH4)2HPO42％，白糖1％，MgSO4·7H2O0.1％，生石灰1-2％，高壓蒸汽分兩次滅菌，第1次，121℃，60min，第2次，121℃，30min，冷卻后接入原種，密封，室溫下培養(yǎng)，白天溫度25-28℃，夜間溫度15-20℃，待菌絲體穿透玉米芯載體，布滿培養(yǎng)瓶，便制得了以玉米芯為載體的固定化顆粒。
經(jīng)上述步驟制得的固定化顆粒周期只需10d，孢子數(shù)5×106個/g。
固定化顆粒按照10％投粒比修復(fù)受多環(huán)芳烴污染的土壤，修復(fù)56d，PYR的去除率為85％，BaP的去除率為54％。
實施例3與實施例1不同之處在于沒有原種制備過程，而是直接采用母種進行固定化。在載體的制備過程中，玉米芯未經(jīng)軟化處理，直接與輔料混合制得載體。結(jié)果表明，按照該法制備的固定化顆粒，雖然因沒有原種的培養(yǎng)階段而縮短了5d時間，但固定化顆粒培養(yǎng)增殖時間卻延長了11d，35d才長滿瓶，而且固定化顆粒孢子數(shù)少，1×104個/g。
經(jīng)該法制得的固定化顆粒按照10％投粒比修復(fù)受多環(huán)芳烴污染的土壤，56d后，PYR的去除率為70％，BaP的去除率僅為30％。
實施例4與實施例2不同之處在于在修復(fù)受多環(huán)芳烴污染土壤的過程中，采用的是兩種真菌共固定的方式投加。按照實施例3制得5種不同菌株的固定化顆粒，分別為固定化毛霉、木霉、產(chǎn)黃青霉、黑曲霉和曲霉，兩兩組合，按1∶1比例投加到土壤中，不同時間測定土壤中芘和BaP的殘留量。結(jié)果表明不同固定化顆粒間對多環(huán)芳烴降解作用存在相加、協(xié)同或抑制效應(yīng)，其中固定化產(chǎn)黃青霉顆粒與固定化毛霉顆粒組合對多環(huán)芳烴的降解效果最好，56d后，PYR的降解率90％，BaP的降解率58％。
實施例5與實施例2不同之處在于在修復(fù)受多環(huán)芳烴污染土壤的過程中，采用三種不同固定化顆粒的聯(lián)合修復(fù)方式，按照實施例3的方法分別制備固定化產(chǎn)黃青霉、固定化毛霉和固定化黑曲霉，按照1∶1∶1投粒比，接種于不同濕度污染土壤中，56d后，PYR的降解率90％，BaP的降解率62％，而且降解效果不受土壤濕度條件的限制。
實施例6(1)固定化菌斜面培養(yǎng)在裝有無機鹽培養(yǎng)基(葡萄糖2％，土豆20％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，酵母膏0.3％，pH6.5)的試管中接種毛霉，置于28-30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。
(2)原種制備選取新鮮無霉變玉米粒，煮30min，與輔料(載體總重量1％的石膏，0.1％的KH2PO4，0.05％的MgSO4·7H2O，0.8％的尿素)混均后一起裝入培養(yǎng)瓶中，用聚乙烯薄膜塑料密封，于121℃條件下高壓滅菌120min，置于無菌室中待溫度降至25℃，用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上接入真菌孢子，密封，放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中，待玉米粒上長滿灰白色菌絲時取出，備用。
(3)固定化載體預(yù)處理將新鮮、干燥、經(jīng)粉碎或輾碎至1.5～2cm大小的玉米芯，1％生石灰溶于水中后，澆入料中，浸透拌勻，蓋上薄膜悶48h，用自來水沖洗3次，然后與其他輔料混合均勻(玉米芯80％，稻糠20％，石膏1％，(NH4)2HPO42％，白糖1％，MgSO4·7H2O 0.1％，生石灰1％)，含水量45％，調(diào)pH6.3，分裝瓶中，壓實，打孔后用聚乙烯薄膜塑料密封，1個壓高溫蒸汽滅菌90min，置于無菌室中待溫度降到25℃，備用。
(4)固定化顆粒制備取10粒長滿真菌孢子的玉米粒原種，按10％接種量將原種接入裝有載體的培養(yǎng)瓶，密封后放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)30天，待菌絲體穿透玉米芯載體，布滿培養(yǎng)瓶，除去表面老的菌絲體，便制得以玉米芯為載體的固定化顆粒。
權(quán)利要求
1.一種用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化顆粒制備方法，其特征在于以玉米芯為主要載體材料，將新鮮、干燥、經(jīng)粉碎或輾碎至1.5～2cm玉米芯，與輔料棉仁餅、麩皮、豆餅粉、稻糠和/或麥麩混合，按重量百分比計，其中玉米芯70～85％，輔料15～30％；調(diào)節(jié)水分重量為含水量40～55％，調(diào)pH為6.3～6.5，高壓滅菌，接入長滿真菌孢子的原種，增殖培養(yǎng)，便制得所需固定化顆粒。
2.按照權(quán)利要求1所述用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化顆粒制備方法，其特征在于其中玉米芯和輔料的混合物中還添加有它們總重量0.5～1.5％的石膏、1～2％的生石灰，以及1.5～2.5％的(NH4)2HPO4、0.5～1.5％的白糖、0.1～0.3％的MgSO4·7H2O或0.5～1.5％的尿素、2～4％的過磷酸鈣。
3.按照權(quán)利要求1所述用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化顆粒制備方法，其特征在于所述玉米芯在與輔料混合前應(yīng)先進行軟化處理，具體操作方法為采用玉米芯重量0.5～1.5％生石灰溶于水中后，澆入料中，浸透拌勻，蓋上薄膜悶24～48h，用水沖洗后即可。
4.按照權(quán)利要求1所述用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化顆粒制備方法，其特征在于所述原種為毛霉、木霉、產(chǎn)黃青霉、黑曲霉和/或曲霉菌種，增殖培養(yǎng)為避光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25～32℃。
5.按照權(quán)利要求1或4所述用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化顆粒制備方法，其特征在于所述原種的培養(yǎng)基重量組成為玉米粒98～99％，石膏1～2％，pH6.3～6.5。
6.按照權(quán)利要求5所述用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化顆粒制備方法，其特征在于原種的培養(yǎng)基中還添加有培養(yǎng)基總重量0.1～0.3％的KH2PO4，0.05～0.2％的MgSO4·7H2O，0.5～1％的尿素。
全文摘要
本發(fā)明涉及細胞固定化技術(shù)，具體的說是一種用于多環(huán)芳烴污染土壤修復(fù)的固定化顆粒制備方法，以玉米芯為主要載體材料，將新鮮、干燥、經(jīng)粉碎或輾碎至1.5～2cm玉米芯，與輔料棉仁餅、麩皮、豆餅粉、稻糠和/或麥麩混合，按重量百分比計，其中玉米芯70～85％，鋪料15～30％；調(diào)節(jié)水分重量為含水量40～55％，調(diào)pH為6.3～6.5，高壓滅菌，接入長滿真菌孢子的原種，增殖培養(yǎng)，便制得所需固定化顆粒。本發(fā)明的優(yōu)點為成本低，固定化效率高，方法簡單易行，適宜原位土壤大規(guī)模修復(fù)。
文檔編號B09C1/10GK1952124SQ20051004747
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者蘇丹, 李培軍, 鞠京麗 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所