專利名稱：用于從制革廠廢水中除去總?cè)芙夤腆w(tds)的細菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的(electrofloated)制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平、保藏號為MTCC 6091的細胞菌株，涉及用于從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平的菌株接種物的制備方法和使用所述菌株從制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平的需氧方法。
背景技術(shù)：
和現(xiàn)有技術(shù)文獻含有有害化合物的廢水排放到自然環(huán)境中嚴重地造成了生物積累性和頑抗性污染物的積累是眾所周知的事實。制革工業(yè)因其固體和液體廢物造成的高污染被稱為“紅色工業(yè)”。盡管努力控制，但其產(chǎn)生通常在環(huán)境中積累的廢物。因此我們的環(huán)境處在來自由皮革工業(yè)產(chǎn)生的固體和液體廢物不斷增加的壓力之下。
皮革加工和生產(chǎn)涉及多種侵害性化學藥品，同時也消耗大量的水，其中大約90％的水作為廢水被排放掉。制革廠廢水是皮革的生物來源物質(zhì)和制革過程中加入的大量有機和無機化學藥品的復雜混合物?；瘜W藥品例如硫化物、硫酸鹽、酸、堿金屬、廢鹵化和非鹵化有機溶劑和鉻被用于加工和生產(chǎn)皮革。所有這些化合物以一些形式或其它形式出現(xiàn)在排放物中，導致廢水中總?cè)芙夤腆w(TDS)含量的總體增加，所述廢水由有機和無機組分組成(M.Bosinic等人，2000)。制革廠廢水中的污染物也包括對所述廢水中TDS水平也有貢獻的易腐爛的有機物質(zhì)、硫化物、Ca、Na、K、Cr的鹽和堿、各種酚、有機酸、醛、胺、防腐劑等(Kadam，1990；Ramanujam，R.A.，1995)。許多這類無機離子和有機化合物是生物可利用的。然而其中一些保持著惰性并且對總體毒性載量有貢獻。
在未加工材料的保存過程中使用氯化鈉是造成制革廠廢水中高TDS水平的主要原因。絕大部分高質(zhì)量的未加工皮革和皮毛是通過使用相當于未加工皮革/皮毛的重量30-50％的普通食鹽進行鹽漬處理保存的。這是最普便使用的保存方法因為-通過干燥保存限于氣候溫暖而鹽和能量資源昂貴的國家。
-皮革和皮毛的鮮加工需要在未加工材料的質(zhì)量和數(shù)量上有恒定的來源。
-通過冷藏皮革或皮毛的保存只在能源廉價并且屠宰設備已經(jīng)配備了合適冷卻設備的國家可行。
-其它防腐化學藥品適合短期保存但不適合長期保存。
除了保存，一些氯化鈉也是制革前的腌漬程序所必需的。制革廠的其它加工單元，即浸泡、浸灰-脫灰、軟化和脫脂也對總TDS載量有貢獻，因為各單元排放含有無機組分如硫酸鹽、硫化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和鈣的廢水。一些有機組分如肽片斷、鞣質(zhì)和酚類也會被流放出來。
制革廠廢水和被處理廢水的有機載量的特征通常在于其化學需氧量(COD)和生物化學需氧量(BOD)。目前，仍然缺乏制革廠廢水及其處理的有機載量更詳細研究(Rudolf，1997)。不過重要參數(shù)如TDS通常是不容忽視的。這主要是由于缺乏用于減少該污染物組份的行之有效的技術(shù)。所述制革廠廢水中的TDS濃度可高達7,000mgl-1，這是令人觀關(guān)注的事情，因為高TDS載量可產(chǎn)生各種問題。
總?cè)芙夤腆w(TDS)告訴我們可能在許多情況下保持穩(wěn)定并導致累積毒性效應的有機和無機溶解性化合物的量(Genschow等人，1996)。無機溶解性固體的主要成份包括鈣、鎂、鈉、鉀、碳酸氫鹽、硫酸鹽、氯化物等的離子。溶解的無機固體對某些水生生物體的體內(nèi)平衡是很重要的。溶解固體量的改變可以是有害的，因為TDS的密度決定進出水生生物細胞的水流。
高濃度的TDS可降低水的清澈度導致光合作用的降低并且當加入有毒化合物和重金屬時，導致溫度的增加。這對許多水生生物形式經(jīng)常可以是有害的。
TDS不僅改變水的質(zhì)量還帶來污染。2100mg/l的量是按EPA標準所允許的水中TDS的極限。然而，該極限似乎沒有足夠嚴格到考慮到超過1200mg/l的TDS可對水生系統(tǒng)和人產(chǎn)生毒害。對于飲用水EPA已設立了500mg/l的上限。因此，盡管在廢水中可允許的TDS水平相當高，由于缺少行之有效的方法用于減少TDS，上面提到的在水中的水平是允許被排放的。廢水處理消除了大部分懸浮的固體、大量的溶解性有機物和幾乎對TDS無任何影響的氮。
常用的TDS減少技術(shù)包括物理化學處理方法。其中一些方法為反滲透(RO)法，電滲析反轉(zhuǎn)(EDR)、冰凍和蒸餾以及離子交換。
A)反滲透(RO)方法RO方法是一種膜分離方法，其中在壓力下加入水讓其沿著膜表面流動。被純化的水穿透所述膜并被收集，而含有不能流過所述膜的溶解和未溶解材料的濃縮水被排放到排水溝或傾倒在地表面，因而也污染了地下水。該技術(shù)涉及高成本的操作和維持并且目前只用于從飲用水中除去TDS。
B)電透析反轉(zhuǎn)(EDR)該方法使用半透膜，其中作為直流電對離子吸引力的結(jié)果，離子通過所述膜從不甚濃縮的溶液遷移到更為濃縮的溶液中。除了要求高能輸入外，該方法不適合于高水平的某些金屬離子并且被限制應用在具有低于3000mg/l TDS的水中。所述積累的固體的處置問題也是其應用于工業(yè)廢水的不利因素。
C)冰凍和蒸餾可用于較高濃度的TDS，如在海水或含鹽的水(大于3000mg/l)中所見到的。
D)離子交換該技術(shù)是基于在不同離子交換基質(zhì)之間的選擇性離子交換。然而，其應用限于更低TDS濃度。
因此，生物學處理方法是極其重要的，因為其不會如物理化學處理方法(Bajpai等人，1994)在不利地影響環(huán)境的情況下起作用，所述物理化學方法在工業(yè)上使用也具有經(jīng)濟負擔，因為其執(zhí)行要求昂貴的基礎設施和維持費用。此外，這類組分以一些其它形式在一些其它地點的積累問題是另一個可通過使用生物處理方法克服的至關(guān)重要的缺點。因此，通向解決上述問題的最好的可能途徑是設計用于減少TDS水平的生物學方法。
由于制革工業(yè)使用了大量的水并且含有相當大量的總?cè)芙夤腆w，從而使得所述水耐受降解，此刻所需要的是選擇并改造用于減少來自制革廠廢水的TDS的微生物(Kapoor等人，1998，Kumar等人，1998)。因此，本發(fā)明者強調(diào)需要從自然環(huán)境中分離能降低廢水中TDS水平的細菌。最初，對細菌聚生體(consortia)進行研究但后來觀察到單一細菌同樣也能與細菌聚生體具有一樣的功能。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是分離用于從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平的細菌菌株。
本發(fā)明另一個主要目的是分離用于從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平的細菌。
而本發(fā)明的另一個目的是發(fā)展使用菌株B5(保藏號5097)降低制革廠廢水中總?cè)芙夤腆w(TDS)的需氧方法。
還有另一個本發(fā)明目的是確定廢水對生物量的比例以在減少TDS中獲得最優(yōu)的結(jié)果。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平的保藏號為MTCC 5097的細菌菌株、制備通過用于從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平的菌株接種物的方法和使用所述菌株減少來自制革廠廢水的總?cè)芙夤腆w(TDS)的需氧方法。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平的保藏號為MTCC 5097的細菌菌株、制備用于從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平的所述菌株接種物的方法和使用所述菌株從制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)的需氧方法。
在本發(fā)明的一個實施方案中，其中保藏號MTCC 5097的細菌菌株用于從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平。
而在本發(fā)明另一個實施方案中，其中制備用于從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平的上述菌株的接種物的方法，所述方法包括步驟a)分離所述菌株，b)在包含土壤提取物和營養(yǎng)瓊脂的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述菌株以獲得純培養(yǎng)物，c)將所述菌株接種到營養(yǎng)肉湯中以獲得起始培養(yǎng)物，d)將所述起始培養(yǎng)物在大約37℃下，優(yōu)選地在100rpm下溫育大約16-18小時，e)用所述起始培養(yǎng)物接種營養(yǎng)肉湯直至達到1.0的光密度，f)從所述培養(yǎng)物中收獲所述細胞以得到沉淀，g)通過將所述沉淀溶解在0.05M pH6.8的磷酸鹽緩沖液中對其進行洗滌，h)離心所述經(jīng)洗滌的沉淀，i)將所述洗滌過的沉淀溶解在最少量的廢水中，并且j)使所述溶解的沉淀勻漿以獲得準備用于從制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平的細胞漿液。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中在大約37+/-2℃下于瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述菌株大約16-24小時。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中營養(yǎng)肉腸包含大約5.0g動物組織的胃酶消化液、大約5.0g氯化鈉、大約1.5g牛肉膏和大約0.2mlTween-80。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中將所得的培養(yǎng)物于大約4℃下以大約6000rpm持續(xù)離心約20分鐘。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中通過將所得沉淀溶解在濃度0.05M和pH6.8的PO4-3緩沖液中進行洗滌。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中使用權(quán)利要求1的保藏號5097的菌株來從制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)的需氧方法，所述方法包括步驟a)用所述菌株接種所述廢水以獲得細胞漿液，b)于大約37℃下以大約100rpm溫育所述細胞漿液，c)使用修改的APHA方法估測TDS水平，在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中廢水與生物量的比例在1∶3到3∶1之間的范圍內(nèi)變動(很好地確定)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中廢水與生物量的比例是大約1∶1。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中制革廠廢水是未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中所述菌株在大約24小時的持續(xù)時間內(nèi)在未經(jīng)處理的制革廠廢水中顯示約8.5的TDS百分比減少。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中所述菌株在大約48小時的持續(xù)時間內(nèi)在未經(jīng)處理的制革廠廢水中顯示約8.3的TDS百分比減少。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中所述菌株在大約24小時的持續(xù)時間內(nèi)在電浮法處理的制革廠廢水中顯示約11的TDS百分比減少。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中所述菌株在大約48小時的持續(xù)時間內(nèi)在電浮法處理的制革廠廢水中顯示約10.7的TDS百分比減少。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中所述廢水的pH為大約7.0。
本申請的菌株于2003年3月5日保存在微生物典型培養(yǎng)物中心(Microbial Type Culture Collection)(MTCC)，保藏號為MTCC5097。本申請的保藏單位位于印度的Chandigarh。近年來，其被授予布達佩斯條約的國際保藏單位的地位。
如臨時專利中所描述的，在預備實驗中細菌聚生體在15天時間內(nèi)能夠減少約16％的制革廠廢水總?cè)芙夤腆w(TDS)。然而，后來進行研究以減少相同實驗的持續(xù)天數(shù)。該研究通過單一細菌分離物在48小時的時間內(nèi)導致電浮法處理的制革廠廢水的TDS水平下降約11％，在所述未經(jīng)處理廢水中降低約8.0％的結(jié)果，所述結(jié)果無疑優(yōu)于更早前公開的所述聚生體的15天持續(xù)時間。因此，在所述完整的專利說明書中，已展現(xiàn)了通過使用單一細菌分離物獲得的結(jié)果；所述結(jié)果明顯優(yōu)于通過所述細菌聚生體獲得的。
本發(fā)明提供了用于從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)的新的需氧生物學方法。同時也公開了從富含鹽例如硫酸鹽，碳酸鹽，氯化物，硝酸鹽等的特殊地點(土壤)中分離的菌株。所述公開的分離物顯著地從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平。本發(fā)明也提供了修改的標準TDS分析方法。
本發(fā)明提供了用于減少制革廠廢水中TDS水平的新的需氧方法和修改的用于TDS分析的方法。同時公開的還有能夠顯著減少電浮法處理的和未經(jīng)處理制革廠廢水中TDS載量的需氧細菌分離物。
本發(fā)明涉及通過使用細菌分離物從制革廠廢水中減少TDS水平的新的需氧方法和修改的用于TDS分析的方法。
本發(fā)明中的細菌分離物被用于減少制革廠廢水中TDS水平。
本發(fā)明中的細菌分離物已從獲自制革廠廢水處理廠的干燥傾倒廢物的土壤中分離出來。
將來自上述地點的5g新鮮取樣土壤接種到加富培養(yǎng)基上。通過加入200ml具有1.3gm營養(yǎng)肉湯和67μl的Candid B制備加富培養(yǎng)基，在15lbs下于121℃滅菌20分鐘。
土壤提取物從采集自各場地的固體廢物中制備。將1kg所述固體廢物于50℃干燥48小時直至極少濕氣保留，類似于園藝土壤。
將400gm來自各場地的干燥固體廢物連同960ml單蒸水在15lbs下滅菌1小時。滅菌后，將所述樣品在5℃下以5000rpm離心10分鐘。收集上清液(提取物)并貯存在無菌容器中以制備用于分離的培養(yǎng)基。
將濃縮的土壤樣品在Na2HPO4-NaH2PO4(pH6.8，0.05M)緩沖液中進行系列稀釋。將100μl各個稀釋物以雙份涂布在具有各種不同濃度土壤提取物和營養(yǎng)瓊脂的培養(yǎng)皿中。將由此獲得的培養(yǎng)皿于37±2℃下倒置溫育16-24小時。
將單個分離的菌落挑出并在含有相同培養(yǎng)基的新鮮平板上劃線。重復上述步驟直至獲得純克隆。
用滅菌的鎳鉻耐熱合金環(huán)將上述細菌分離物接種到15-20ml含有(每升)5.0g動物組織的胃酶消化液、5.0g氯化鈉、1.5g牛肉膏、1.5g酵母提取物和0.2ml Tween-80的無菌營養(yǎng)肉湯(NB)中。將所述培養(yǎng)物于37℃下在震蕩培養(yǎng)器中溫育約16-18小時。為了溫和地搖動，將所述震蕩培養(yǎng)器保持合適的rpm，優(yōu)選地100rpm。在獲得充分生長后，將所述營養(yǎng)液貯存在4℃直至進一步使用。用250μl上面制備的起始培養(yǎng)物接種250ml無菌NB。將培養(yǎng)瓶保持在37℃/100rpm條件下溫育16-18小時直至光密度(650nm)達到1.0。
通過以合適rpm，優(yōu)選地6000rpm離心20分鐘收獲所述細胞。通過將所獲得的沉淀溶解在最小量的0.05M pH6.8的磷酸鹽緩沖液中并在相同rpm和時間條件下再離心的方式將其洗滌兩次。在離心過程中，溫度保持在4℃。將由此獲得的沉淀用最小體積的各自廢水洗滌并且重新離心以將緩沖液鹽份進入所述樣品的任何機會減少到最小，因而減少通過其造成的任何增加總?cè)芙恹}份的機會。接著將由此獲得的沉淀懸浮于最小體積的各自廢水中渦流振蕩以形成均勻懸浮液并應用于減少來自所制革廠的TDS。
在本發(fā)明中對未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的廢水都進行減少TDS的處理。為建立TDS減少實驗，將250ml樣品裝入螺絲擰緊封口的圓錐型振蕩燒瓶中。在檢查所述廢水的pH達到優(yōu)選的7.0左右后向廢水樣品中加入所述接種物。同時也保持不加入任何接種物的對照燒瓶以便比較。所述燒瓶于37℃/100rpm下溫育24小時。
為估量TDS水平的減少，對標準APHA方法進行修改。取出約70ml并作處理以進行分析。將所述取出的樣品以7000rpm在干燥和干凈的離心管(用三蒸水漂洗的)中優(yōu)選地在4℃下離心20分鐘。立即將所述上清液收集在預先用三蒸水漂洗過的干凈和干燥的容器中。然后將所述上清液通過0.45μ的薄膜濾器(Milipore)進行過濾。接著用干凈和預先漂洗過的量筒測取25ml該濾液并轉(zhuǎn)移至清洗過的、干燥過夜的、干燥和預先稱重的燒杯中。再次用20ml三蒸水漂洗量筒并同樣轉(zhuǎn)移至含有所述樣品的燒杯中。重復相同過程以處理所有樣品。然后將所述燒杯在180±2℃的熱空氣烤箱中進行干燥。干燥后，將所述燒杯轉(zhuǎn)移至真空干燥器中并冷卻約45分鐘到1小時以達到室溫并稱重。
使用下列公式計算TDS(mg/l)TDS(mg/l)＝(A-B)/樣品體積其中，A＝具有干燥濾液的燒杯終重量B＝無樣品燒杯的起始重量本發(fā)明進一步提供了用于制備所述細菌(MTCC 5097)分離物并用其從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TSD)的方法，所述方法包括a)從采集自制革廠廢水處理廠的傾倒廢物土壤中分離細菌分離物；b)在含有不同濃度來自所述采集土壤制備的土壤提取物的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細菌分離物以獲得純的培養(yǎng)物；c)將所述細菌分離物接種在含有0.01％Tween 80的營養(yǎng)肉湯中以獲得起始培養(yǎng)物。
d)通過用所述起始培養(yǎng)物接種合適的營養(yǎng)肉湯等份試樣并于37℃/100rpm在上述培養(yǎng)基上溫育16-18小時培養(yǎng)上述細菌分離物以獲得所需的生物量；e)在達到1.0的光密度后將所得的培養(yǎng)物離心獲得沉淀，通過將所述收集的沉淀溶解在0.05M pH6.8的PO4-3緩沖液中然后再離心沉淀對其進行洗滌；f)收集從步驟(e)獲得的所述沉淀，通過將其溶解在10ml各廢水中并重新離心以獲得用于處理可行性研究的細胞沉淀g)將上面形成的沉淀溶解在最小體積的各廢水中并通過渦流振蕩均勻化以獲得細胞漿液；h)用獲自步驟(g)中的細胞漿液接種合適的制革廠廢水等份試樣以進行TDS減少研究，所述研究伴有不含任何添加接種物的廢水樣品的對照燒瓶。
i)在37℃/100rpm下將設置于步驟(h)的燒瓶溫育24小時；j)從上述燒瓶中以70ml等份試樣取出樣品并對其進行處理以估量TDS水平；k)使用如(1)中所描述的改良的APHA方法分析上述樣品中的TDS；l)將上述樣品以8000rpm離心20分鐘并將上清液通過0.45μ薄膜濾器(Millipore)進行過濾然后使用該濾液估量干重。
m)24小時后通過與對照樣品中的TDS水平比較分析上面所述細菌分離物的TDS消除效率。
在本發(fā)明的實施方案中，所述細菌分離物是在確定的培養(yǎng)上從采集自制革廠廢水處理廠的傾倒廢物土壤中分離出來的。
在本發(fā)明的另一實施方案中，將上述細菌分離物接種到含有0.01％Tween 80的營養(yǎng)肉湯中以獲得起始培養(yǎng)物。
在本發(fā)明的另一實施方案中，通過用起始培養(yǎng)物接種營養(yǎng)肉湯制備所述細菌分離物的培養(yǎng)物。
在本發(fā)明的另一實施方案中，通過以100rpm的溫和攪動對所述菌株進行溫育。
在本發(fā)明的另一實施方案中，將所述溫育的菌株在37℃的溫度下培養(yǎng)16-18小時。
在本發(fā)明的另一實施方案中，在達到約1.0的光密度后，將所述細菌分離物以合適的rpm優(yōu)選地6000rpm于4℃下離心約20分鐘。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，將所得到的沉淀溶解在最少量的0.05M，pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中并用相同的rpm和時間條件離心以洗滌所述沉淀。在離心過程中，溫度保持在4℃。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，通過將所述由此獲得的沉淀溶解在10ml廢水中并在如前述的相同條件下離心的方式對所述沉淀進行洗滌。
在本發(fā)明的實施方案中，將所得到的沉淀重新懸浮于最小體積的廢水中并進行渦流振動以形成均勻的懸浮液。
在本發(fā)明的實施方案中，將上面得到的細胞漿液用于接種所述廢水樣品以減少TDS。
本發(fā)明進一步提供用于減少來自未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水樣品的TDS水平的方法。
在本發(fā)明的另一實施方案，將所述含有上述接種物的燒瓶于37℃以120rpm溫育24小時。
在本發(fā)明的另一實施方案，用下面實施方案中所述的修改的APHA方法分析上述樣品中的TDS；在本發(fā)明的進一步實施方案中，將上述樣品以8000rpm離心20分鐘。
在本發(fā)明的另一實施方案中，將所述上清液通過0.45μ薄膜濾器(Millipore)進行過濾然后用于估量干重。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，經(jīng)24小時觀察總?cè)芙夤腆w水平的下降。
如臨時專利中所描述的，在預備實驗中所述細菌聚生體在15天內(nèi)可減少約16％的制革廠廢水總?cè)芙夤腆w(TDS)水平。另外，后來進行研究以減少相同實驗的持續(xù)天數(shù)。該研究通過單一細菌分離物在48小時的時間內(nèi)導致電浮法處理的制革廠廢水TDS水平下降約11％和在所述未經(jīng)處理廢水中降低約8.0％的結(jié)果，所述結(jié)果無疑優(yōu)于更早前公開的使用所述聚生體的15天持續(xù)時間。因此，在完整的專利說明書中，已展示了通過使用所述單一細菌培養(yǎng)物所獲得的結(jié)果；所述結(jié)果明顯優(yōu)于通過所述細菌聚生體獲得的結(jié)果。
本發(fā)明的菌株保存在國際保藏單位中。保藏號為MTCC 5097。本發(fā)明的貯藏庫位于印度的Chandigarh，稱為微生物典型培養(yǎng)物中心(MTCC)。近年來，其依布達佩斯條約被賦予國際保藏單位的地位。
上述發(fā)明利用少數(shù)幾個實施例來驗證說明之。這些實施例只是用作說明性的而不應該被認為是限制本發(fā)明范圍的。
實施例I從制革廠的共同廢水處理廠的未經(jīng)處理和電浮法處理的廢水中分離細菌。檢查所述廢水的pH并發(fā)現(xiàn)未經(jīng)處理廢水的為7.0±0.2和電浮法處理的廢水的為8.3±0.2，用1N HCl中和所述廢水。用于分離的不同培養(yǎng)基是培養(yǎng)基A將帶有瓊脂的經(jīng)過濾和滅菌的廢水用作培養(yǎng)基。使用2％瓊脂制備廢水瓊脂培養(yǎng)皿。
培養(yǎng)基B嗜鹽培養(yǎng)基所使用的具有不同NaCl濃度(即1％、2.5％、5％和10％)的嗜鹽培養(yǎng)基的組成如下KCl 2gMgSO4.7H2O 20g檸檬酸三鈉 3g酵母提取物(Oxoid) 10g酪蛋白水解物7.5gFeCl2.4H2O 36mgMnCl2.4H2O 0.36mgpH 7.0±0.2瓊脂2％通過將所述濃縮接種物系列稀釋至10-12的稀釋度來進行系列稀釋涂板。通過取出9ml等份的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 6.8，0.05M)并且在第一個小瓶中加入1ml濃縮接種物，渦流振蕩并從該小瓶中取出1ml加到下一個小瓶中進行稀釋，直至獲得10-12的稀釋度來進行系列稀釋。
按三份重字樣本將100μl各稀釋物進行平板涂布、傾倒平板和以菌環(huán)劃線于不同瓊脂培養(yǎng)基上。將由此獲得的平板顛倒放置于37+2℃下溫育16-24小時。
對具有不同形態(tài)的菌落進行相應的標記，挑出并劃線到相應的培養(yǎng)皿中以獲得純培養(yǎng)物。將所述純培養(yǎng)物保持在各自的斜面和穿刺上，于4℃下保存等待進一步用于實驗。
選擇出15個形態(tài)學上有差異的細菌分離物并制備起始培養(yǎng)物。取出菌環(huán)量的培養(yǎng)物并接種在滅菌的營養(yǎng)肉湯等份中，渦流振蕩并保持在37℃/120rpm下溫育16-18小時。檢查這些起始培養(yǎng)物在650nm的光密度并保存在4℃下等待進一步使用。制備工作培養(yǎng)物以篩選其降低電浮法處理的制革廠廢水總?cè)芙夤腆w的能力。用100μl各起始培養(yǎng)物接種100ml滅菌NB等份并在37℃/120rpm下溫育16-18小時。記錄起始和最終650nm的光密度。按照所述聚生體的組成以相同比例取出OD650為2.0的培養(yǎng)物并混合在一起。以7000rpm于4℃下離心所得的細菌懸浮液20分鐘。用無菌磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4-NaH2PO4pH 6.8，0.05M)將獲得的沉淀洗滌兩遍并且重新懸浮于很小體積的相同緩沖液中。然后將該懸浮液以1∶1的比例進行處理可能性測定，即用從100ml培養(yǎng)基中獲得的沉淀處理100ml廢水樣品。
在圓錐形振蕩燒瓶中于37℃以120rpm對電浮法處理的廢水的大量(batch)培養(yǎng)物樣品中進行為期15天的所述TDS減少實驗。也維持著無任何添加接種物的對照燒瓶并且將結(jié)果與這些樣品對比。根據(jù)APHA中所述的標準方法對15天內(nèi)的TDS進行分析。觀察到TDS水平隨加入的生物量上升，這可能是由于穿過GFC濾器(孔徑大小1.2μ)細菌的通過造成的，因此對所獲殘留物重量作出貢獻(表1)。因此在所有將來的實驗中對所述分析方法進行修改。
實施例II再次制備所述細菌聚生體并用于檢查其降低電浮法處理的制革廠廢水TDS的功效，通過使用如進一步所述的修改版的標準APHA方法。將所述單個包含所述聚生體的細菌培養(yǎng)在合適的NB等份試樣中直至O.D.650為1.0。以實施例I中所述的相同方式制備所述細菌聚生體。用所述制備的聚生體以1∶1的比例處理100ml等份試樣。通過下面描述的修改的標準APHA方法對15天內(nèi)TDS水平進行分析。
以合適的等份取出所述樣品并以7000rpm離心20分鐘。然后將所述上清液通過0.45μ(Millipore)濾器。然后用干凈、預先漂洗的量筒測量所述濾液并轉(zhuǎn)移至干凈、預先稱重的燒杯中。在轉(zhuǎn)移所述樣品前預先稱重時，所述燒杯已用三蒸水預先漂洗，在180℃烘烤過夜，干燥。接著將含有所述樣品的燒杯置于熱空氣烘箱中于180℃下干燥過夜。然后將所述燒杯干燥以冷卻到室溫并稱重以計算殘留物的重量。接著進行同樣的計算以發(fā)現(xiàn)實際TDS值，用mg/l(表2)表示。15天后在電浮法處理的樣品中記錄到超過4％的最大TDS減少。
實施例III由于TDS的減少甚至在15天后仍非常低，所以從加灰處理的洗滌水中分離細菌。通過使用實施例I中所描述的稀釋涂板方法在營養(yǎng)瓊脂板上分離細菌。將分離物作為斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物貯存在4℃下直至進一步使用。
以如實施例1中所描述的相同方法用這些細菌分離物配制三種不同的聚生體并篩選其減少來自電浮法處理的制革廠廢水的TDS的能力。通過實施例II中所描述的修改的TDS分析方法分析樣品中TDS的水平。15天后觀察到13-16％的百分比減少。
實施例IV將實施例III中所使用的來自所述聚生體的單一細菌重新組合以形成如前面所述的不同聚生體并篩選其減少未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中TDS的能力。更早前的聚生體在15天后顯示TDS減少13-16％。因此，為了減少持續(xù)時間同時也想知道通過配制新的聚生體是否可以獲得更好的表現(xiàn)。
以如實施例III中所描述的相同方式連同其對照一起設立實驗并且在五天內(nèi)進行分析。在電浮法處理的樣品中觀察到高達8％的百分比減少(表4b)而在未經(jīng)處理的廢水中高達5％(表4a)。
實施例V選擇產(chǎn)生超過7.0％和超過4.5％TDS減少的聚生體并單個地篩選組成的細菌分離物。根據(jù)實施例II中所描述的相同方法制備所述單獨的細菌沉淀。不過，通過用磷酸緩沖液(0.05M，pH 6.8)對其進行第一次洗滌和通過將所述磷酸緩沖液洗滌過的沉淀懸浮在10ml各廢水中進行最后的洗滌來對所述細胞進行洗滌。接著將所述懸浮液以7000rpm離心20分鐘并將所獲得的細胞懸浮在最小量所述廢水中以用于接種適合等份的未經(jīng)處理和電浮法處理的制革廠廢水。在5天的時間內(nèi)觀察到分離物ET7在電浮法處理的樣品中產(chǎn)生高達9.0％的百分比減少(表5b)而在未經(jīng)處理廢水中高達7.0％(表5a)。
實施例VI為了進一步提高TDS減少效率，決定從采自制革廠廢水處理廠不同位置的不同樣品中分離細菌。選擇來自8個不同位置的固體廢物，在所述位置收集了從獸皮到皮革的加工過程中產(chǎn)生的廢水。所述如位置如下位置A傾倒的廢物[廢水處理廠的淤泥和其它廢物的堆積場]位置B舊池廢物[更早前用于收集來自鉻鞣皮、染色和加灰漂洗水的廢水的場地]。
位置C灰處理廢物[皮革灰處理后收集廢水和固體廢物的場地]。
位置D公共廢水[來自所有皮革加工過程即從鉻鞣革、染色和灰處理加工的固體廢物和廢水存放的池子]。
位置E鉻廢物[在鉻鞣革后收集廢水的場地]。
位置F淤泥(制革廠的廢水處理廠)。
位置G染色廢物(皮革染色后收集廢水的池子)。
位置H鉻和染色廢物(鉻鞣革和染色后收集廢水的池子)。
從來自各位置采集的固體中制備提取物。將1kg各固體廢物于50℃下干燥48小時直至保留非常少量的濕氣并且達到與園藝土壤相似的粘度。將400gm上述各干燥固體廢物與960ml單蒸水一起在15psi下滅菌1小時。滅菌后，以6000rpm于5℃下將樣品離心10分鐘。收集上清液(提取物)并貯存在無菌容器中用于制備不同培養(yǎng)基。
通過向200ml來自各位置的各自提取物中加入1.3gm營養(yǎng)肉湯和67μl Candid B、在15lbs下于121℃滅菌20分鐘制備濃縮培養(yǎng)基。加入5gms來自各位置的新鮮土壤并且將所述培養(yǎng)基以120rpm于37℃溫育48小時。
將濃縮的土壤樣品在Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 6.8，0.05M)中進行系列稀釋。將100μl各自分別的稀釋物成雙份涂布在培養(yǎng)基平板上，所述培養(yǎng)基具有來自各自位置、不同濃度的提取物和營養(yǎng)肉湯(培養(yǎng)基A營養(yǎng)瓊脂，培養(yǎng)基B具有2％瓊脂的土壤提取物(200ml)+1.3gm營養(yǎng)肉湯，培養(yǎng)基C具有2％瓊脂的土壤提取物)。將由此所得的平板顛倒放置于37±2℃下溫育16-24小時。
挑出具有不同形態(tài)的菌落并劃線于各自的培養(yǎng)基平板上以獲得純培養(yǎng)物。將純培養(yǎng)物維持在各自的斜面和穿刺上并保存在4℃等待進一步使用。
獲得136個細菌培養(yǎng)物并且設計聚生體以篩選其減少來自電浮法處理的和未經(jīng)處理制革廠廢水的TDS的功效。以前面實施例中描述的相同方式制備所述聚生體并且以如實施例I中所描述的1∶1廢水∶生物量比例進行接種。在48小時內(nèi)通過實施II中所描述的修改的TDS分析方法對所述樣品進行分析。
與在實施例IV和V中展示的在5天后觀察的類似減少相比，在48小時內(nèi)觀察到在電浮法處理的制革廠廢水中高達9.0％的百分比減少(表6b)和在未經(jīng)處理制革廠廢水中高達7％的百分比減少(表6a)。
實施例VII據(jù)猜測生長在富含氯化物、硫酸鹽和硝酸鹽位置的細菌是TDS貢獻組分的更佳降解者。因此，從富含上述鹽的位置收集土壤樣本并且用各種培養(yǎng)基從上述樣品中分離細菌。
在下列培養(yǎng)基(每升的組分)中進行所述細菌群落的濃縮培養(yǎng)基A培養(yǎng)基A的組分如下溶液A980ml溶液B10ml溶液C10ml溶液A(每1000ml蒸餾水)由KNO3(5.0g)、(NH4)2SO4(1.0g)、K2HPO4.3H2O(0.87g)、KH2PO4(0.54g)和葡萄糖(4.0g)組成。溶液B通過加入2g/100ml MgSO4.7H2O制備和溶液C通過每100ml 0.1NHCl溶解下列鹽制備，即CaCl2.2H2O(0.2g)、FeSO4.7H2O(0.1g)、MnSO4.H2O(0.05g)、CuSO4.5H2O(0.01g)、Na2MoO4.2H2O(0.01g)。將所有上述溶液于121℃在15psi下滅菌15分鐘并冷卻到25℃。然后將這些在無菌條件下混合并用于濃縮和分離細菌。
培養(yǎng)基B使用不同NaCl百分比，即，1.0、2.5、5.0、10.0和12.5制備該培養(yǎng)基。其它的組分是(每升蒸餾水)MgCl2.6H2O(50.0g)、K2SO4(5.0g)、CaCl2.6H2O(0.2g)、胰化蛋白胨(5.0g)和酵母提取物(5.0g)。將所述培養(yǎng)基于121℃在15psi下滅菌15分鐘并冷卻到25℃并用于濃縮和分離細菌。
培養(yǎng)基C制備含有(每升蒸餾水)5.0g動物組織胃酶消化液、5.0g氯化鈉、1.5g牛肉膏、1.5g酵母提取物和0.2ml Tween-80的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，對其進行滅菌并用于濃縮和分離細菌。
于37℃在7天時間內(nèi)進行濃縮。如更早前所描述的對細菌進行分離并將所獲得的純的培養(yǎng)物貯存在4℃下直至進一步使用。
將分離的細菌單個地培養(yǎng)和配制成前面所描述的聚生體并用于篩選其減少電浮法處理的和未經(jīng)處理廢水TDS的能力。在48小時的時間內(nèi)，根據(jù)實施例II中所述的修改的TDS分析方法對TDS進行分析(表7a和7b)。在電浮法處理的廢水中觀察到聚生體EDK2產(chǎn)生高達9.3％的減少而在未經(jīng)處理廢水中聚生體RDK3和RDK5產(chǎn)生高達5.5％的減少。
實施例VIII對組成實施例VI中最優(yōu)表現(xiàn)的細菌聚生體的單一細菌進行篩選以篩選出其從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少TDS的能力。以前面實施例所描述的相同方式形成用于接種處理可能性實驗的細菌沉淀。維持1∶1廢水∶生物量比例并使用如實施例II中所描述的修改的TDS分析方法在48小時內(nèi)對TDS水平進行分析。
在48小時內(nèi)，展現(xiàn)了在電浮法處理的樣品中保藏號MTCC 5097的分離物造成大約10.3％的百分比減少(表8b)和在未經(jīng)處理廢水中保藏號5097的分離物造成高達8.0％的百分比減少(表8a)。
實施例IX為了找出何種生物上樣量可產(chǎn)生最好的結(jié)果，以不同的廢水∶生物量比例即1∶0.5和1∶1對在未經(jīng)處理廢水中表現(xiàn)超過6.0％和在電浮法處理的廢水中表現(xiàn)超過9.0％的細菌在各自對應的廢水樣品進行重新檢驗。以如前面描述的方法培養(yǎng)所述單一細菌并在最終O.D.650為1.5時進行收獲。
在第0小時和第24小時取出合適樣品等份進行TDS分析。據(jù)發(fā)現(xiàn)與1∶0.5的比例相比，廢水∶生物量比例為1∶1時表現(xiàn)出更優(yōu)的結(jié)果。同樣，將培養(yǎng)物的O.D增加到1.5，表現(xiàn)出在電浮法處理的廢水中保藏號MTCC 5097的分離物造成高達11.1的百分比減少而在未經(jīng)處理廢水中造成8.1的百分比減少。
表-1用從來自制革廠廢水的細菌分離物制備的不同聚生體產(chǎn)生的電浮法處理的制革廠廢水TDS的百分比減少(通過標準Standard APHA方法分析)

所有值都是重復實驗的平均值，SD為±0.2％表-2用不同聚生體產(chǎn)生的電浮法處理的制革廠廢水百分比減少(修改的APHA方法)

所有值都是重復實驗的平均值，SD為±0.2％表-3用從分離的處理水制備的不同聚生體產(chǎn)生的電浮法處理的制革廠廢水TDS的百分比減少

所有值都是重復實驗的平均值，SD為±0.2％
表-4a使用不同由聚生體P1、P2、P3配制的不同聚生體產(chǎn)生的未經(jīng)處理制革廠廢水TDS的百分比減少

所有值都是重復實驗的平均值，SD為±0.2％表-4b使用由聚生體P1、P2、P3配制的不同聚生體產(chǎn)生的電浮法處理的制革廠廢水TDS的百分比減少

所有值都是重復實驗的平均值，SD為±0.2％
表-5a通過使用改變的洗滌沉淀的方法用單一細菌產(chǎn)生的未經(jīng)處理制革廠廢水TDS的百分比減少

所有值都是重復實驗的平均值，SD為±0.2％表-5b通過使用改變的漂洗沉淀的方法用單一細菌產(chǎn)生的電浮法處理的制革廠廢水TDS的百分比減少

所有值都是重復實驗的平均值，SD為±0.2％
表-6a用來自制革廠不同位置的聚生體產(chǎn)生的經(jīng)處理制革廠廢水TDS的百分比減少

所有值都是重復實驗的平均值，SD為±0.2％表-6b用來自制革廠不同位置的聚生體產(chǎn)生的電浮法處理的制革廠廢水TDS的百分比減少

所有值都是重復實驗的平均值，SD為±0.2％
表-7a用不同的從來自富含氯化物、硫酸鹽和硝酸鹽場地的細菌分離物制備的聚生體產(chǎn)生的未經(jīng)處理的制革廠廢水TDS的百分比減少

所有值都是重復實驗的平均值，SD為±0.2％表-7b用不同的從來自富含氯化物、硫酸鹽和硝酸鹽場地的細菌分離物制備的聚生體產(chǎn)生的電浮法處理的制革廠廢水TDS的百分比減少

所有值都是重復實驗的平均值，SD為±0.2％
表-8a使用單一細菌分離物產(chǎn)生的來經(jīng)處理制革廠廢水TDS的百分比減少

所有值都是重復實驗的平均值，SD為±0.2％表-8b使用單一細菌培養(yǎng)物產(chǎn)生的電浮法處理的制革廠廢水TDS的百分比減少

所有值都是重復實驗的平均值，SD為±0.2％
表-9a使用不同生物量載量產(chǎn)生的未經(jīng)處理制革廠廢水TDS的百分比減少

所有值都是重復實驗的平均值，SD為±0.2％表-9b使用不同生物量載量產(chǎn)生的電浮法處理的制革廠廢水TDS的百分比減少

所有的值都是重復實驗的平均值，SD為±0.2％本發(fā)明的有利方面1.所述分離的細茵能夠以可重復的方式減少制革廠廢水的TDS水平。
2.所述天然分離的細菌是非致病性的并且可在無任何經(jīng)濟負擔的簡單營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
3.這種從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少TDS的細菌減少方法是新的方法。
權(quán)利要求
1.一種保藏號為MTCC 5097的細菌菌株，所述菌株用于從未經(jīng)處理的以及經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平。
2.制備權(quán)利要求1的菌株的接種物的方法，所述菌株用于從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平，所述方法包括步驟a)分離所述菌株，b)在包含土壤提取物和營養(yǎng)瓊脂的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述菌株以獲得純培養(yǎng)物，c)將所述菌株接種到營養(yǎng)肉湯中以獲得起始培養(yǎng)物，d)在大約37℃優(yōu)選地以100rpm溫育所述起始培養(yǎng)物約16-18小時，e)用所述起始培養(yǎng)物接種營養(yǎng)肉湯直至獲得具有光密度1.0的培養(yǎng)物，f)從所述培養(yǎng)物中收獲所述細胞以獲得沉淀，g)通過溶解在0.05M pH6.8的磷酸鹽緩沖液中洗滌所述沉淀，h)將經(jīng)洗滌的沉淀離心，i)將經(jīng)洗滌的沉淀溶解在最少量的廢水中，和j)勻漿化所述溶解的沉淀以獲得準備用于從制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平的細胞漿液。
3.權(quán)利要求2的方法，其中在大約37+/-2℃下在瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述菌株大約16-24小時。
4.權(quán)利要求2的方法，其中營養(yǎng)肉湯包含大約5.0g動物組織胃酶消化液、大約5.0g氯化鈉、大約1.5g牛肉膏、大約1.5g酵母提取物和大約0.2ml Tween-80。
5.權(quán)利要求2的方法，其中將所得到的培養(yǎng)物在大約4℃下以大約6000rpm離心大約20分鐘。
6.權(quán)利要求2的方法，其中通過溶解在濃度0.05M和pH6.8的PO4-3緩沖液中對所得到的沉淀進行洗滌。
7.一種通過使用權(quán)利要求1的保藏號為5097的細菌菌株減少來自制革廠廢水的總?cè)芙夤腆w(TDS)的需氧方法，所述方法包括步驟a)用所述菌株接種所述廢水以獲得細胞漿液，b)在大約37℃下以大約100rpm溫育所述細胞漿液，和c)使用改良的APHA方法估量TDS水平。
8.權(quán)利要求7的用途，其中廢水與生物量的比例在1∶3到3∶1之間的范圍內(nèi)變化(很好地確定)。
9.權(quán)利要求7的方法，其中廢水與生物量的比例是大約1∶1。
10.權(quán)利要求7的用途，其中制革廠廢水是未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水。
11.權(quán)利要求7和10的用途，其中所述菌株在大約24小時的持續(xù)時間內(nèi)在未經(jīng)處理的制革廠廢水中顯示大約8.5的TDS百分比減少。
12.權(quán)利要求7和10的用途，其中所述菌株在大約48小時的持續(xù)時間內(nèi)在未經(jīng)處理制革廠廢水中顯示大約8.3的TDS百分比減少。
13.權(quán)利要求7和10的用途，其中所述菌株在大約24小時的持續(xù)時間內(nèi)在經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中顯示大約11.1的TDS百分比減少。
14.權(quán)利要求7和10的用途，其中所述菌株在大約48小時的持續(xù)時間內(nèi)在經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中顯示大約10.7的TDS的百分比減少。
15.權(quán)利要求7的用途，其中所述廢水的pH約為7.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平的保藏號為MTCC 5097的菌株、制備用于從未經(jīng)處理的和經(jīng)電浮法處理的鞣革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)水平的菌株接種物的方法和使用所述菌株從制革廠廢水中減少總?cè)芙夤腆w(TDS)的需氧方法。
文檔編號C02F103/24GK1764606SQ200380110273
公開日2006年4月26日 申請日期2003年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月21日
發(fā)明者R·庫馬, P·沙爾馬, D·K·提庫 申請人:科學與工業(yè)研究會