專利名稱：一種溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及量子點(diǎn)熒光探針的制備技術(shù)，特別是一種溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針的制備方法。
背景技術(shù)：
量子點(diǎn)(quantum dots, QD)是一種由II-VI族或III-V族元素組成的、能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米晶粒。量子點(diǎn)具有激發(fā)光譜寬且連續(xù)、發(fā)射光譜窄且對(duì)稱、發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)、熒光量子產(chǎn)率高、光化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)越的熒光特性。近年來(lái)，量子點(diǎn)(半導(dǎo)體納米粒子)在生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，極大的拓展了量子點(diǎn)研究的深度和廣度，成為生物、 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最有生命力的發(fā)展方向之一。而且，量子點(diǎn)作為熒光探針在生物、醫(yī)學(xué)方面的研究中發(fā)揮巨大作用(M. Bruchez Jr.，M. Moronne, P. Gin, S. Weiss, Α. P. Alivisatos, Science, 1998，281 (5385) :2013-2016 ；W. C. W. Chan, S. Nie, Science,1998，281(5385) :2016-2018)。 由于理想的熒光探針必須能夠與相應(yīng)的目標(biāo)分析物發(fā)生特異性的結(jié)合。因此發(fā)展對(duì)目標(biāo)分析物具有特異性識(shí)別能力的熒光探針是主要研究?jī)?nèi)容之一。選擇合適的天然抗體對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)記，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的分析。但由于天然抗體價(jià)格昂貴、提取過(guò)程繁瑣，而且穩(wěn)定差，因此發(fā)展人工抗體技術(shù)(分子印跡技術(shù))是解決這一問(wèn)題的途徑之一。分子印跡(又稱分子模板或分子烙印)技術(shù)是指制備對(duì)目標(biāo)分子具有特異性識(shí)別能力的聚合物的技術(shù)(G.Valtakis，L. I. Andersson, R. Muller, K. Mosbach, Nature, 1993, 361(6413) :645-647 ；G. Wulff，Angew. Chem. Int. Ed. Engl.，1995，34 (17) 1812-1832)。由于印跡聚合物中空腔的空間結(jié)構(gòu)以及空穴中功能基團(tuán)的種類、數(shù)量和位點(diǎn)均與目標(biāo)分子高度互補(bǔ)，因而它對(duì)目標(biāo)分子的立體結(jié)構(gòu)具有記憶功能?；诜肿佑≯E技術(shù)的量子點(diǎn)熒光探針的制備技術(shù)，則將分子印跡技術(shù)應(yīng)用于量子點(diǎn)熒光探針的制備，目前，已被成功地應(yīng)用于小分子的識(shí)別分析(C. I. Lin, A. K. Joseph, C. K. Chang, Y. D. Lee, J. Chromatogr. A, 2004，1027 (1-2) :259-262 ；C. I. Lin, A. K. Joseph, C. K. Chang, Y. D. Lee, Biosens. Bioelectron. , 2004, 20 (1) :127-131 ；H. -F Wang, Y. He,T. -R Ji, X.-P. Yan, Anal. Chem. ,2009,81(4) :1615-1621)。將量子點(diǎn)和蛋白質(zhì)分子印跡聯(lián)合，結(jié)合分子印跡技術(shù)的高選擇性與量子點(diǎn)熒光檢測(cè)技術(shù)的高靈敏性，制備蛋白質(zhì)分子印跡-量子點(diǎn)熒光探針可以應(yīng)用于目標(biāo)蛋白的選擇性識(shí)別及測(cè)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)上述技術(shù)分析，提供一種溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針的制備方法，該量子點(diǎn)納米熒光探針，對(duì)模板分子的識(shí)別具有有較高的選擇性和靈敏性；且合成方法過(guò)程簡(jiǎn)單，不同批次間重現(xiàn)性較好，在實(shí)際樣品中溶菌酶的選擇性識(shí)別和檢測(cè)中有著良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的技術(shù)方案—種溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針的制備方法，是以碲化鎘量子點(diǎn)為載體，溶菌酶(N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶)為模板分子，結(jié)合分子印跡技術(shù)的選擇性和量子點(diǎn)的熒光特性合成的納米熒光探針，包括如下步驟1)將碲粉(Te) ,NaBH4與蒸餾水混合，在氮?dú)獗Ｗo(hù)并攪拌的條件下進(jìn)行還原反應(yīng)制得NaHTe溶液，將制得的NaHTe溶液快速加入到巰基丙酸(MPA)的CdCl2溶液中，用NaOH水溶液調(diào)節(jié)溶液的PH為9. 0，然后沸水浴加熱所述溶液2h，即可制得碲化鎘量子點(diǎn)溶液；2)將牛血清白蛋白溶于蒸餾水中，加入硼氫化鈉，攪拌一個(gè)小時(shí)，然后在70°C水浴中加熱30分鐘，得到變性的牛血清白蛋白(dBSA)溶液，將變性的牛血清蛋白溶液加入到碲化鎘量子點(diǎn)溶液中，磁力攪拌M小時(shí)，得到dBSA包覆的量子點(diǎn)溶液；3)在dBSA包覆的量子點(diǎn)溶液中依次加入模板分子溶菌酶、功能單體3-氨丙基三乙氧基丙烷、交聯(lián)劑正硅酸乙酯和氨水，室溫下磁力攪拌12小時(shí)，通過(guò)溶膠凝膠水解聚合反應(yīng)在量子點(diǎn)形成分子印跡層，即為探針；4)用十二烷基硫酸鈉水溶液與探針混合，振蕩20-60分鐘，離心去除上清液，重新用上述十二烷基硫酸鈉溶液洗滌，重復(fù)此過(guò)程，直到用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)模板分子洗凈為止，即可制得溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針。所述NaBH4與蒸餾水的用量比為45. 5mg/mL,Te與NaBH4的摩爾比為119 ；所述MPA 的CdCl2溶液中MPA與CdCl2的用量摩爾比為2.4 1，Te2_與MPA的摩爾比為1 4.8。所述調(diào)節(jié)溶液pH的NaOH水溶液的濃度為1. Omol/L。所述牛血清白蛋白與蒸餾水的用量比為20-40mg/mL;牛血清白蛋白與硼氫化鈉的質(zhì)量比為100 2-4，變性的牛血清白蛋白溶液與碲化鎘量子點(diǎn)溶液的體積比為1 10。所述氨水質(zhì)量百分比濃度為25%，dBSA包覆的量子點(diǎn)溶液、溶菌酶、3-氨丙基三乙氧基丙烷、正硅酸乙酯與氨水的用量比為5mL IOmg 60 μ L IOOyL 100 μ L。所述十二烷基硫酸鈉水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0. 5%，十二烷基硫酸鈉水溶液與探針混合的用量比為lml/lmg。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明制備的溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針，與傳統(tǒng)合成分子印跡聚合物的方法相比，有以下優(yōu)點(diǎn)1)以量子點(diǎn)為載體，在其表面修飾分子印跡層，結(jié)合了分子印跡的高選擇性和量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的高靈敏性；2)采用表面印跡的方式合成的納米粒子比表面積大，識(shí)別位點(diǎn)接近表面，易于選擇性識(shí)別模板分子；3)不但可以用于目標(biāo)蛋白的選擇性識(shí)別、富集，而且可以用于實(shí)際樣品中目標(biāo)蛋白的測(cè)定，其性能優(yōu)于傳統(tǒng)的分子印跡聚合物。


圖1是該溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針的透射電鏡圖。圖2是該溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針對(duì)模板分子溶菌酶的識(shí)別性能的熒光表征。圖3是非印跡納米粒子(參比)對(duì)模板分子溶菌酶的識(shí)別性能的熒光表征。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一種溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針的制備方法，是以碲化鎘量子點(diǎn)為載體，溶菌酶(N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶)為模板分子(本專利用的溶菌酶是購(gòu)買于 Sigma-Aldrich公司)，結(jié)合分子印跡技術(shù)的選擇性和量子點(diǎn)的熒光特性合成的納米熒光探針，包括如下步驟1)將0. 064g碲粉(Te)、0. 36g NaBH4與81^蒸餾水混合，在氮?dú)獗Ｗo(hù)并攪拌的條件下進(jìn)行還原反應(yīng)制得NaHTe溶液，將制得的NaHTe溶液快速加入到巰基丙酸(MPA)的CdCl2 溶液中，該CdCl2溶液的制備用料是12. 5mL氯化鎘、53 μ L巰基丙酸和ISOmL蒸餾水，然后用濃度為1. Omol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)溶液的pH為9. 0，然后沸水浴加熱所述溶液2小時(shí)， 即可制得碲化鎘量子點(diǎn)溶液；2)將^Omg牛血清白蛋白溶于IOmL蒸餾水中，加入6. 8mg硼氫化鈉，攪拌一個(gè)小時(shí)，然后在70°C的水浴中加熱30min，得到變性的牛血清白蛋白(dBSA)溶液，將ImL變性的牛血清蛋白加入到IOmL碲化鎘量子點(diǎn)溶液中，磁力攪拌M小時(shí)，得到dBSA包覆的量子點(diǎn)溶液；3)在5mL dBSA包覆的量子點(diǎn)溶液中依次加入IOmg模板分子溶菌酶、60 μ L功能單體3-氨丙基三乙氧基丙烷、100 μ L交聯(lián)劑正硅酸乙酯和100 μ L質(zhì)量百分比濃度為25 % 的氨水，室溫下磁力攪拌12小時(shí)，通過(guò)溶膠凝膠水解聚合反應(yīng)在量子點(diǎn)形成分子印跡層， 即為探針；4)用質(zhì)量百分比濃度為0. 5%的十二烷基硫酸鈉水溶液與上述探針混合，十二烷基硫酸鈉水溶液與探針混合的用量比為lml/lmg，振蕩20-60分鐘，離心去除上清液，重新用上述十二烷基硫酸鈉溶液洗滌，重復(fù)此過(guò)程，直到用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)模板分子洗凈為止，即可制得溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針。溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針對(duì)模板分子溶菌酶的識(shí)別性能稱取溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針和參照物各2份，每份20mg，分別置于 2個(gè)離心管中，然后分別加入20mL緩沖溶液，超聲lOmin，使納米粒子均勻分散在緩沖溶液中，分別移取一定體積的探針和參照物溶液于不同的離心管中，然后加入不同濃度的蛋白質(zhì)溶液，用熒光分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定探針及參照物與模板分子的響應(yīng)(熒光分光光度計(jì)日立，日本，F(xiàn)-4500型；激發(fā)和發(fā)射都是5nm，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定在400nm，在430-700范圍內(nèi)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，光電管的電壓為950V)。圖1是該溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針的透射電鏡圖。圖中顯示該方法制備的納米粒子的尺寸在50-80nm，具有一定的分散性。圖2是該溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針對(duì)模板分子溶菌酶的識(shí)別性能的熒光表征。通過(guò)比較直線的斜率(探針的斜率與參比的斜率之比)，可以說(shuō)明納米粒子的識(shí)別行為。圖3是非印跡納米粒子(參比)對(duì)模板分子溶菌酶的識(shí)別性能的熒光表征。通過(guò)比較印跡納米探針和非印跡納米粒子(參比)對(duì)模板分子的熒光變化，可以看出，對(duì)相同濃度的模板分子，印跡納米粒子的熒光響應(yīng)大，說(shuō)明了探針具有良好的識(shí)別行為。
權(quán)利要求
1.一種溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針的制備方法，其特征在于是以碲化鎘量子點(diǎn)為載體，溶菌酶(N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶)為模板分子，結(jié)合分子印跡技術(shù)的選擇性和量子點(diǎn)的熒光特性合成的納米熒光探針，包括如下步驟1)將碲粉(Te)、NaBH4與蒸餾水混合，在氮?dú)獗Ｗo(hù)并攪拌的條件下進(jìn)行還原反應(yīng)制得 NaHTe溶液，將制得的NaHTe溶液快速加入到巰基丙酸(MPA)的CdCl2溶液中，用NaOH水溶液調(diào)節(jié)溶液的PH為9. 0，然后沸水浴加熱所述溶液2h，即可制得碲化鎘量子點(diǎn)溶液；2)將牛血清白蛋白溶于蒸餾水中，加入硼氫化鈉，攪拌1小時(shí)，然后在70°C水浴中加熱 30分鐘，得到變性牛血清白蛋白(dBSA)溶液，將dBSA溶液加入到碲化鎘量子點(diǎn)溶液中，磁力攪拌M小時(shí)，得到dBSA包覆的量子點(diǎn)溶液；3)在dBSA包覆的量子點(diǎn)溶液中依次加入模板分子溶菌酶、功能單體3-氨丙基三乙氧基丙烷、交聯(lián)劑正硅酸乙酯和氨水，室溫下磁力攪拌12小時(shí)，通過(guò)溶膠凝膠水解聚合反應(yīng)在量子點(diǎn)形成分子印跡層，即為探針；4)用十二烷基硫酸鈉水溶液與探針混合，振蕩20-60分鐘，離心去除上清液，重新用上述十二烷基硫酸鈉溶液洗滌，重復(fù)此過(guò)程，直到用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)模板分子洗凈為止， 即可制得溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針的制備方法，其特征在于所述NaBH4與蒸餾水的用量比為45. 5mg/mL, Te與NaBH4的摩爾比為1 19 ；所述MPA 的CdCl2溶液中MPA與CdCl2的用量摩爾比為2.4 1，Te2_與MPA的摩爾比為1 4.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針的制備方法，其特征在于所述調(diào)節(jié)溶液PH的NaOH水溶液的濃度為1. 0mol/Lo
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針的制備方法，其特征在于所述牛血清白蛋白與蒸餾水的用量比為20-40mg/mL ；牛血清白蛋白與硼氫化鈉的質(zhì)量比為100 2-4，變性的牛血清白蛋白溶液與碲化鎘量子點(diǎn)溶液的體積比為1 10。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針的制備方法，其特征在于所述氨水質(zhì)量百分比濃度為25%，dBSA包覆的量子點(diǎn)溶液、溶菌酶、3-氨丙基三乙氧基丙烷、正硅酸乙酯與氨水的用量比為5mL IOmg 60 μ L 100 μ L 100 μ L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針的制備方法，其特征在于所述十二烷基硫酸鈉水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0. 5%，十二烷基硫酸鈉水溶液與探針混合的用量比為lml/lmg。
全文摘要
一種溶菌酶分子印跡-量子點(diǎn)納米熒光探針的制備方法，是以量子點(diǎn)為載體，溶菌酶為模板分子，在量子點(diǎn)表面修飾一層分子印跡聚合物，結(jié)合分子印跡技術(shù)的選擇性和量子點(diǎn)的熒光特性合成的新型熒光探針；步驟如下量子點(diǎn)的制備、通過(guò)變性的牛血清蛋白修飾量子點(diǎn)的表面、選擇功能單體和交聯(lián)試劑引發(fā)聚合在量子點(diǎn)形成分子印跡層、選擇洗脫液洗去模板分子。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)該熒光探針將分子印跡準(zhǔn)確專一的識(shí)別特性和量子點(diǎn)熒光檢測(cè)的高靈敏性相結(jié)合，對(duì)模板分子的識(shí)別具有有較高的選擇性和靈敏性；該合成方法過(guò)程簡(jiǎn)單，不同批次間重現(xiàn)性較好，在實(shí)際樣品中溶菌酶的選擇性識(shí)別和檢測(cè)中有著良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C09K11/88GK102313725SQ20111020479
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月21日
發(fā)明者何錫文, 張衛(wèi), 張玉奎, 李文友 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)