季也蒙畢赤酵母3?j15及其應用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）3?J15，該季也蒙畢赤酵母高產(chǎn)揮發(fā)性香氣物質(zhì)2?苯基乙醇和3?甲基?1?丁醇，且至少能夠耐受15%鹽濃度，不但具有良好的醬油增香發(fā)酵潛力和良好的環(huán)境適應能力，有運用于實際醬油生產(chǎn)中的潛力，還可作為發(fā)酵菌株在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵制備3?甲基?1?丁醇和2?苯基乙醇，為3?甲基?1?丁醇和2?苯基乙醇的制備提供新的有效手段。CGMCC No. 1246520160518
【專利說明】
季也蒙畢赤酵母3-J15及其應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及微生物領域，具體涉及一株季也蒙畢赤酵母（#e_reroz_r?a 貧 u i i 0/3 c/i i ) 3-J15 及其應用。
【背景技術】
[0002] 傳統(tǒng)技藝釀制的醬油產(chǎn)品并不是單一工藝、單一風味的產(chǎn)品。由于中國地域廣闊， 各地溫度、濕度、水質(zhì)各異，飲食習慣不同，且經(jīng)過多代人的技術傳承，各地在原料組成、配 比、處理方式，醬醪(或醬醅）的含鹽量、含水量，發(fā)酵時間的長短及醬油的提取方法等方面 均存在許多差異，不同地區(qū)出產(chǎn)了名目繁多、風味各具特色的醬油，可供消費者多種選擇。 醬油中的香氣風味成分很多，成香機制復雜，迄今所檢測到的已近300余種，大體上可分為 醇、醛、酯、酮、酚、有機酸、呋喃、吡啶等類別，其中起主要作用的有數(shù)十種，最為常見的三種 有有機酸類、醇類和酯類。
[0003] 醬油釀造涉及到曲霉、酵母和細菌的協(xié)同作用，微生物的性能極大程度上決定了 醬油品質(zhì)及原料利用率?，F(xiàn)代速釀工藝常采用米曲霉、醬油曲霉等純菌株制曲，雖然能夠在 較短時期內(nèi)獲得具有穩(wěn)定性、重復性質(zhì)量的產(chǎn)品，但長此以往，不僅使產(chǎn)品的同質(zhì)化效應加 劇，也阻礙了珍貴傳統(tǒng)釀造工藝的傳承，同時發(fā)酵條件不利于微生物產(chǎn)酯生香。酵母菌能夠 在曲霉代謝產(chǎn)生的小分子糖類和氨基酸的基礎上，進行酒精發(fā)酵并參與多種香氣物質(zhì)的合 成。因此，為了補充醬油風味和保證醬油質(zhì)量，具有醬油發(fā)酵潛力的菌種選育是現(xiàn)代醬油釀 制工藝的必要選擇之一。如閆美，高耐鹽醬油酵母的選育及其在醬油釀造中的應用[D]，《湖 北工業(yè)大學》2014年，本文在辣椒醬中篩選出了一株耐鹽性達24%的酵母，可應用于醬油釀 造。經(jīng)26s rDNA鑒定其為魯氏酵母。經(jīng)香氣成分分析，該魯氏酵母主要產(chǎn)具有獨特玫瑰香味 的苯乙醇，高鹽對其香氣成分的影響較小。陳強，醬油中產(chǎn)香酵母菌的篩選及用于醬油增香 研究[D]，《華南農(nóng)業(yè)大學》2011年，本研究從天然發(fā)酵醬醪中篩選出了 8株能在10%氯化鈉麥 芽汁瓊脂培養(yǎng)基良好生長的酵母菌，通過感官評定篩選出兩株產(chǎn)香性能良好的菌株，鑒定 表明JM01、JM06分別屬于球擬酵母屬的球形球擬酵母和接合酵母屬的魯氏接合酵母。梁慧 等，臘魚產(chǎn)香酵母菌的篩選及其發(fā)酵產(chǎn)香特性初步研究[D]，《食品工業(yè)科技》2011年12期， 該研究從傳統(tǒng)臘魚中分離篩選得到了兩株產(chǎn)香酵母。結(jié)合形態(tài)學和酵母菌26S rDNA D1/D2 區(qū)序列分析，初步鑒定其中一株為季也蒙畢赤酵母（/^<^〗3^'0^^61'?0/3心_/ (J/ejei-ozjffia g't/ihiei-ffioWiihHg)，該菌發(fā)酵液中的揮發(fā)性成分主要為醇類和 酯類，但該酵母的耐鹽性低，食鹽量為8%~10%時，酵母H9生長幾乎停滯，因此在含鹽量高醬 油發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中的應用受到限制。通過以上研究報道發(fā)現(xiàn)，增香酵母的開發(fā)對醬油發(fā)酵產(chǎn)業(yè) 具有重要意義，因此，在增香酵母的相對缺乏導致工業(yè)化生產(chǎn)的醬油香氣不足的背景下，以 傳統(tǒng)的天然曬露工藝為依托，篩選更多的具有增香潛能的酵母，可推動傳統(tǒng)工藝與現(xiàn)代產(chǎn) 業(yè)化的結(jié)合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)醬油中可應用的增香潛能酵母品種少，生產(chǎn)的 醬油香氣不足的問題，提供一株季也蒙畢赤酵母(J/ejerozjffia guiDierffio/Jc/ii ) 3-J15,該季也蒙畢赤酵母高產(chǎn)揮發(fā)性香氣物質(zhì)2-苯基乙醇和3-甲基-1-丁醇，且至少能夠 耐受15%鹽濃度，不但擁有良好的醬油增香發(fā)酵潛力和良好的環(huán)境適應能力，具有運用于實 際醬油生產(chǎn)中的潛力，還可作為發(fā)酵菌株在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵制備3-甲基-1-丁醇和2-苯 基乙醇。
[0005] 為解決上述技術問題，本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)： 菌株3-J 1 5，分類命名為季也蒙畢赤酵母，拉丁文學名Sjl/e/eroz/ffia g'uinierffio/jc/ii，于2016年5月18日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心（CGMCC)，其保藏編號為CGMCC No. 12465,保存單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號。
[0006] 所述季也蒙畢赤酵母3-J15是從四川省合江縣天然曬露高鹽固態(tài)釀制的先市醬油 發(fā)酵第三年的醬醅中分離得到。
[0007] 所述季也蒙畢赤酵母3-J15,在含150 g/L NaCl的酵母蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 上生長良好，菌落為乳白色，奶油狀，表面光滑，邊緣整齊。對菌體形態(tài)進行鏡檢，酵母3-J15 細胞呈卵圓形，出芽生殖，無假菌絲。
[0008] 所述季也蒙畢赤酵母3-J15在酵母膏蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，在麥 芽汁瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長一般，在察氏瓊脂培養(yǎng)基生長差。
[0009] 季也蒙畢赤酵母3-J15該菌的最適生長pH為4~8,最適生長溫度約30 °C左右，在 滿足最適溫度、最適pH且培養(yǎng)基中氯化鈉含量為15%的條件下，其在26 h內(nèi)的生長情況如 下:從第1~2 h起，菌株逐漸進入對數(shù)期，生長旺盛，18 h后進入穩(wěn)定期，菌株生長速率逐漸 平穩(wěn)，代謝產(chǎn)物積累。
[0010] 以上研究表明在實際應用到醬醅發(fā)酵過程中時，季也蒙畢赤酵母3-J15具有良好 的環(huán)境適應能力，有運用于實際醬油生產(chǎn)中的潛力。
[0011] 所述季也蒙畢赤酵母，使用針對酵母26S rDNA D1/D2區(qū)域的通用引物NL1/NL4對 其基因組總DNA為模板進行PCR擴增，得到由604堿基對（bp)組成的目的基因序列，如 Sequence Listing 1 所不； 將測序得到的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有序列進行BLAST比對，NL1/NL4引物對擴增 片段測序長 604 bp，與 Genbank 中的 i/ejerozj/sa g u i 11 i e rm on d i i 042640相似率達99%，可初步鑒定3_J 15為一株Meyerozyma guilliermondiiX 也稱 Pi cA ia i e_rffl〇/3c/i i)，即季也蒙畢赤酵母。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種適合所述季也蒙畢赤酵母3-J15快速搖瓶發(fā)酵的模擬醬醅液 體培養(yǎng)基:該培養(yǎng)基是將黃豆粉、小麥粉、新鮮醬醅用緩沖液Na 2HP〇4/KH2P〇4配置成緩沖體 系，然后煮勻，攪拌后四層紗布過濾，調(diào)節(jié)pH=5~5.2，滅菌即得，其中每1 L緩沖液Na2HP〇4/ KH2P〇4中含有黃豆粉10 g、小麥粉2.5 g、新鮮醬醅50 g。該種培養(yǎng)基可用于快速發(fā)酵制備3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇。
[0013] 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明從天然曬露發(fā)酵醬油的新鮮醬醅中篩選具有增香功能的季也蒙畢赤酵母3-J15,該菌能產(chǎn)生多種不同的香味成分，且高產(chǎn)對醬油口感具有正面影響的酸味和焦糖味(p 〈0.05)的3-甲基-1-丁醇、具有花草香味和瓜果氣息的2-苯基乙醇這兩種香味成分，為醬油 風味物質(zhì)及質(zhì)量安全奠定基礎。
[0014] 本發(fā)明的季也蒙畢赤酵母3-J15在15%鹽濃度下生長良好，并能夠適應較廣的pH范 圍，在醬油發(fā)酵的人工高鹽環(huán)境中具有較強的應用潛力，為現(xiàn)代醬油釀制工藝提供可靠，有 效的增香酵母，提高醬油風味和質(zhì)量。
[0015] 本發(fā)明的季也蒙畢赤酵母3-J15可接種于醬醅發(fā)酵醬油，在非鹽脅迫作用下也高 產(chǎn)3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇，因此可作為發(fā)酵菌種在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵制備3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇，為3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇的制備提供新的有效手段。
【附圖說明】
[0016] 圖1為利用Neighbor-Joining法構建的3-J15及其相關菌株關于26S rDNA D1/D2 區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹； 圖2為菌株3-J15在酵母膏蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖； 圖3為菌株3-J15在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖； 圖4為菌株3-J15在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖； 圖5為菌株3-J15在察氏瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖； 圖6為菌株3-J15在光學顯微鏡下的細胞形態(tài)圖； 圖7為菌株3-J15耐鹽曲線圖； 季也蒙畢赤酵母3-J15,于2016年5月18日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心(CGMCC)，其保藏編號為CGMCC No. 12465,保存單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西 路1號院3號。
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合【具體實施方式】說明本發(fā)明。
[0018] 本發(fā)明中，下述實施例中采用的培養(yǎng)基： 酵母膏蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YTOA):20 g蛋白胨，20 g葡萄糖，10 g酵母浸粉，15 g瓊脂粉，補水至1 L，自然pH滅菌。酵母膏蛋白胨液體培養(yǎng)基配方同YPDA，但不加瓊脂粉。
[0019] 麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA): 130 g麥芽汁培養(yǎng)基（購自杭州百思生物技術有限公 司），15 g瓊脂粉，補水至1 L，自然pH，滅菌。
[0020] 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):300 g土豆，洗凈去皮切成小塊，加水補至1 L煮 沸20 min。八層紗布過濾，濾液加入20 g葡萄糖、18 g瓊脂并補水至1 L，加熱使其充分溶 解，自然PH，滅菌，在倒平板之前，需加入用少量乙醇溶解的0.1 g氯霉素，0.22 μπι濾膜過濾 到冷至50 °C左右的培養(yǎng)基中。
[0021] 察氏瓊脂培養(yǎng)基（CDA):3 g NaN03，l g KH2P〇4,0.5 g MgS〇4,0.5 g KC1，0.01 g FeS〇4,30 g鹿糖，15 g瓊脂粉，補水至1 L，自然pH，滅菌。
[0022] 本發(fā)明中下述實施例中的醬醅樣品由四川省合江縣先市釀造食品有限公司提供。 [0023] 實施例1 季也蒙畢赤酵母菌株3-J15的分離、培養(yǎng)及分子生物學鑒定。
[0024]無菌操作條件下，取醬醅樣品5 g加至提前裝有玻璃珠的45 mL滅菌生理鹽水中， 37 °C搖床振搖15 min。取1 mL樣品稀釋液依次進行10倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度涂布 于含10%氯化鈉的PDA培養(yǎng)基上。于28 °C培養(yǎng)72 h后挑選特征性菌落，經(jīng)反復劃線純化后， 從發(fā)酵醬醅中共分離出20余株酵母，考慮到不同菌種的食品發(fā)酵背景以及酵母對產(chǎn)品的增 香作用主要集中于發(fā)酵中后期，最終篩選出一株從第三年發(fā)酵醬醅中分離得到的酵母3-J15。分離得到的酵母3-J15接種至相應液體培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)。待擴大培養(yǎng)完成后，提取 目的菌株DNA，并使用通用引物NL1/NL4針對其26S rDNA D1/D2區(qū)域序列進行特異性擴增， PCR反應條件為94 °C預變性3 min;94 °C變性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸1 min，循環(huán) 30次;72 °C延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后在1.5%瓊脂糖凝膠上呈單一條帶，無非特異擴增 現(xiàn)象，條帶長短約600 bp，送出測序。
[0025] 上述通用引物對NL1/NL4由Invitrogen公司（上海)合成，序列如下： NL1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG； NL4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG； 將測序得到的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有序列進行BLAST比對，NL1/NL4引物對擴增 片段測序長604 bp，與Genbank中的7e_ro gt/i i 〇/3 c/i i 標準株NG_042640 相似率達 99%，可初步鑒定3-J15為一株Meyerozynm guilliermondi iX也稱P i ch i a g'uiDieiTffo/jc/ii)，即季也蒙畢赤酵母。
[0026] 篩選與季也蒙畢赤酵母3-J15同源性較高的序列，通過Neighbor-Joining法構建 系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示，3-J15與兩株# gt/iHierffio/jc/ii模式菌株處于 同一分支。
[0027]將所述季也蒙畢赤酵母3-J15劃線于四種常用酵母培養(yǎng)平板上，30 °C倒置培養(yǎng)48 h后，對菌株3-J15在各平板上培養(yǎng)特征進行觀察，如圖2所示，所述菌株在YPDA上生長良好， 菌落為乳白色，菌落較大，奶油狀，表面光滑，邊緣整齊;如圖3、圖4所示，季也蒙畢赤酵母3-J15在MEA和PDA上生長一般，菌落為白色，菌落較YPDA稍??；如圖5所示，在⑶A上生長差，菌 落為白色，菌落極小。
[0028]對菌體形態(tài)在光學顯微鏡下進行鏡檢，所述酵母細胞呈卵圓形，出芽生殖，無假菌 絲，如圖6所示。
[0029] 實施例2 菌株3-J15耐鹽特性探究： 使用Yro液體培養(yǎng)基活化菌株，隨后對菌株在含有不同梯度濃度NaCi的YH)培養(yǎng)基中的 生長情況進行測定。30 °C，120 rpm搖床振蕩24 h后，通過分光光度計在波長660 nm處測定 培養(yǎng)液的吸光值，繪制菌株對NaCl的耐受曲線，如圖7所示，結(jié)果表明該季也蒙畢赤酵母3-J15能夠至少耐受15%鹽濃度。
[0030] 實施例3 季也蒙畢赤酵母應用于模擬醬醅液體培養(yǎng)基發(fā)酵： 1、模擬醬醅液體培養(yǎng)基：10 g黃豆粉，2.5 g小麥粉，50 g新鮮醬醅，用緩沖液體系 Na2HP〇4/KH2P〇4配置為1 L體系，煮勻攪拌后四層紗布過濾，pH=5~5.2，滅菌。根據(jù)實驗設計 分為額外添加150 g/L氯化鈉的鹽脅迫型及不添加氯化鈉的非鹽脅迫型。
[0031] 2、將甘油管保藏的季也蒙酵母接入Yro液體培養(yǎng)基中活化后，4000 rpm離心，取無 菌生理鹽水反復洗滌菌體，將1 mL 5X106 CFU/mL的菌體懸浮液加入到30 mL所述模擬醬 醅液體培養(yǎng)基中，在最適生長溫度下120 rpm搖瓶至生長穩(wěn)定期后適當延長搖瓶時間，無菌 條件下過濾收集發(fā)酵液。
[0032] 3、發(fā)酵培養(yǎng)液香氣成分的GC-MS分析 所述發(fā)酵液的揮發(fā)性香氣物質(zhì)的檢測方法為:準確吸取6 mL發(fā)酵液樣品和20 yL 2-甲 基-3-庚酮稀釋液(5 yL/L)于15 mL頂空瓶中，加蓋密封，將已完成老化的萃取頭插入瓶子 的頂空部分，于60 °C的恒溫水浴中萃取30 min。檢測時以未添菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為陰性對 照。樣品通過DB-5MS型彈性石英毛細色譜柱(30 mX0.25 mmX0.25 μπι)進行分離;程序升 溫條件為起始溫度40 °C，以3 °C每分鐘升到120 °C，保持2 min，再以15 °C每分鐘升至 250 °C，保持2 min;載氣為高純氦氣（1.0 mL/min);分流比10:1。質(zhì)譜采用電子轟擊電離 源；電子能量70 eV;離子源溫度230 °C;掃描范圍35~350 m/z。對采集到的質(zhì)譜圖利用 NIST08和WILEY09譜庫檢索進行組分分析，并用氣相色譜峰面積歸一化計算出各香氣組分 的相對含量。結(jié)果見表1。
[0033]表1季也蒙畢赤酵母3-J15在鹽脅迫及非鹽脅迫條件的主要揮發(fā)性成分相對含量 (%)〇
[0034
從表1中可以看出，季也蒙畢赤酵母發(fā)酵液中的2-苯基乙醇和3-甲基-1-丁醇的相對含 量遠超其余成分，成為其揮發(fā)性香氣物質(zhì)的主要來源。Feng等通過研究發(fā)現(xiàn)3-甲基-1-丁醇 是高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中最強烈的香氣活性化合物之一，并證明在產(chǎn)品中添加適量3-甲基- 1-丁醇能夠?qū)ζ渥罱K口感貢獻具有正面影響的酸味和焦糖味(P〈〇. 05)。2_苯基乙醇作為酵 母菌降解苯丙氨酸的代謝產(chǎn)物，具有花草香味和瓜果氣息，已被研究者應用于醬油和豆醬 等發(fā)酵產(chǎn)品的增香手段中。
【主權項】
1 ·季也蒙畢赤酵母(# ejerozjffia g't/ihiei-ffio/Jt/ii )3_J15，其保存編號為 CGMCC No. 12465〇2. 根據(jù)權利要求1所述的季也蒙畢赤酵母3-J15在醬油增香發(fā)酵中的應用。3. 根據(jù)權利要求1所述的季也蒙畢赤酵母作為發(fā)酵菌種制備2-苯基乙醇和3-甲基-1-丁醇中的應用。4. 根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于:所述季也蒙畢赤酵母快速發(fā)酵液體培養(yǎng)基 是將黃豆粉、小麥粉、新鮮醬醅用緩沖液Na 2HP04/KH2P04配置成緩沖體系，然后煮勾，攪拌后 四層紗布過濾，調(diào)節(jié)pH=5~5.2，滅菌即得，其中每1L緩沖液Na 2HP〇4/KH2PO沖含有黃豆粉10 g、小麥粉2.5 g、新鮮醬醅50 g。
【文檔編號】C12P7/22GK106085889SQ201610467541
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】孫群, 楊陽, 鄧岳, 田圓圓, 劉絨梅, 金玉蘭
【申請人】四川大學