一種環(huán)黃芪醇提取物及其制備方法與用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種環(huán)黃芪醇提取物，由如下方法制備得到：將黃芪粗粉用pH值11～13的堿性醇水溶液進(jìn)行提取，獲得黃芪甲苷粗提物；所得黃芪甲苷粗提物通過大孔樹脂富集純化，得到黃芪甲苷提取物；所得黃芪甲苷提取物進(jìn)行Smith降解，獲得所述的環(huán)黃芪醇提取物；本發(fā)明環(huán)黃芪醇提取物的制備，通過對(duì)提取條件中的pH值、高碘酸鈉用量、甲醇濃度的多次試驗(yàn)，得到了最適宜的提取方法，且該方法重現(xiàn)性良好，簡(jiǎn)便易行；本發(fā)明制備的環(huán)黃芪醇提取物能明顯減緩H2O2對(duì)PC12細(xì)胞造成的衰老傷害，提高細(xì)胞活力，提示本發(fā)明制備方法得到的環(huán)黃芪醇提取物具有一定的抗衰老活性，可應(yīng)用于抗衰老藥物及保健品的制備。
【專利說明】
一種環(huán)黃芪醇提取物及其制備方法與用途 (一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種環(huán)黃芪醇提取物以及該提取物的制備方法和用途，屬于醫(yī)藥領(lǐng) 域。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，世界各國(guó)人口老齡化速度日益加快，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年我國(guó)65歲及以上的老年 人口占全部人口的9.4%，聯(lián)合國(guó)預(yù)測(cè)到2025年，中國(guó)65歲以上的老年人口將達(dá)2.3億，接近 2012年老年人口數(shù)的2倍。在如此嚴(yán)峻形勢(shì)下，人類面臨著巨大的挑戰(zhàn)，衰老與抗衰老成為 當(dāng)今醫(yī)學(xué)討論的熱點(diǎn)。隨著人們生活水平日益提高以及回歸綠色生活理念的不斷加強(qiáng)，如 何有效預(yù)防衰老、提高生活質(zhì)量成為人們迫切需要解決的難題。因此，人們對(duì)抗衰老相關(guān)綠 色保健品及植物提取物的需求不斷增加。
[0003] 近年來，端粒酶（Telomerase)的發(fā)現(xiàn)和"端粒假說（Telomere hypothesis)"的提 出，極大地推動(dòng)了有關(guān)衰老的研究。端粒是染色體末端由DNA和蛋白質(zhì)組成的特異結(jié)構(gòu)，起 到保護(hù)染色體完整性的作用，研究顯示，端粒隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而逐漸縮短，最終失 去對(duì)染色體的保護(hù)能力，造成細(xì)胞衰老。與此同時(shí)，端粒酶是維持端粒長(zhǎng)度的反轉(zhuǎn)錄DNA聚 合酶，因而在細(xì)胞的增殖、衰老中起著重要作用，通過激活端粒酶活性，延緩端粒變短能起 到顯著的抗衰老作用，因此，有效的端粒酶激活劑也成為時(shí)下研究的熱點(diǎn)。
[0004] 黃芪作為一味傳統(tǒng)中藥，研究表明具有抗氧化、延緩衰老、抗腫瘤、抗病毒等功效。 黃芪皂苷是黃芪的有效成分之一，其中，黃芪甲苷常用作黃芪藥材質(zhì)量控制的主要指標(biāo)。有 報(bào)道指出，環(huán)黃苗醇(Cycloastragenol，CAG)是大部分黃苗阜苷的苷元，且具有顯著的端粒 酶激活作用，因而存在抗衰老、抗病毒、抗抑郁等一系列的藥用價(jià)值，現(xiàn)有報(bào)道多由黃芪甲 苷水解制備獲得，制備方法包括酸水解、Smith降解、酶解等，其中Smith降解因其反應(yīng)條件 溫和易控，耗時(shí)相對(duì)較短，同時(shí)高碘酸氧化反應(yīng)是一種選擇性反應(yīng)，因而具有一定的專一 性，常被用作制備CAG的方法。周先禮等發(fā)明了一種CAG的制備方法及用途，以黃芪甲苷為原 料，采用Smith降解的方法粗制CAG提取物，再用硅膠柱層析、重結(jié)晶等方法得到純度在95% 以上的CAGAeng等對(duì)Smith降解的條件進(jìn)行了優(yōu)化，包括高碘酸鈉用量、甲醇濃度、硼氫化 鈉用量等，降解得到高純度的CAG提取物。
[0005] 截至目前，大多數(shù)的工作集中在如何獲得高純度的CAG，CAG單品具有何種生物活 性，并且都是以黃芪甲苷單體為原料，極少對(duì)環(huán)黃芪醇提取物進(jìn)行相關(guān)研究。前期研究結(jié)果 顯示，從黃芪藥材制備CAG提取物中含有大量副產(chǎn)物，其中一部分為CAG結(jié)構(gòu)類似物。因此， 本發(fā)明主要對(duì)CAG提取物及其中的結(jié)構(gòu)類似物進(jìn)行相關(guān)研究，有助于推動(dòng)CAG提取物走向國(guó) 際市場(chǎng)，同時(shí)為開發(fā)抗衰老相關(guān)保健品及藥品提供一定的技術(shù)支持和理論依據(jù)。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種環(huán)黃芪醇提取物及其制備方法與用途，本發(fā)明制備方法 可以將黃芪中的黃芪甲苷有效水解為環(huán)黃芪醇，該方法具有一定的選擇性，可以提高環(huán)黃 芪醇的含量，且反應(yīng)條件易于控制優(yōu)化，工藝操作簡(jiǎn)便，相較于現(xiàn)有報(bào)道的另外兩種制備方 法一一酸水解及酶解法，歷時(shí)較短。本發(fā)明制得的環(huán)黃芪醇提取物具有抗衰老作用，可用于 制備抗衰老藥物及保健品。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種環(huán)黃芪醇提取物，由如下方法制備得到：
[0009] (a)將黃芪粗粉(粒度為20目）用pH值11~13的堿性醇水溶液進(jìn)行提取，蒸除溶劑 干燥后獲得黃芪甲苷粗提物；
[0010]步驟(a)中，具體的，所述提取的操作方法為:將黃芪粗粉與pH值11~13的堿性醇 水溶液以料液質(zhì)量比1:6~10混合，浸泡12~16h，之后升溫至回流提取2~3h，過濾，得到一 次濾液和一次濾渣;將所得一次濾渣與pH值11~13的堿性醇水溶液以料液質(zhì)量比1:8~10 混合，升溫至回流提取2~3h，過濾，得到二次濾液和二次濾渣;棄去二次濾渣，合并一次濾 液和二次濾液，減壓蒸除溶劑(45~60°C)，之后冷凍干燥(采用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行），得到 黃芪甲苷粗提物；
[0011 ]優(yōu)選所述的堿性醇水溶液為pH值11~13的75% (v/v)乙醇水溶液;更加優(yōu)選所述 的堿性醇水溶液為pH值13的75 % (v/v)乙醇水溶液;所述的堿性醇水溶液用氫氧化鈉進(jìn)行 調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)；
[0012] (b)步驟(a)所得黃芪甲苷粗提物通過大孔樹脂富集純化，得到黃芪甲苷提取物；
[0013] 步驟(b)中，具體的，所述大孔樹脂富集純化的操作方法為:將黃芪甲苷粗提物溶 于2~10質(zhì)量倍的水中，得到黃芪甲苷粗提液，將其加入填充有大孔樹脂的色譜柱中，靜態(tài) 吸附4~6h后，依次用5~20倍樹脂柱體積的水、30%~40% (v/v，優(yōu)選30%)乙醇水溶液、 70% (v/v)乙醇水溶液洗脫，收集70% (v/v)乙醇水洗脫液，減壓蒸除溶劑(45~60°C )，得到 黃芪甲苷提取物；
[0014] 所述的大孔樹脂選自ADS-17、AB-8、D101、HPD300中的一種，優(yōu)選D101樹脂；
[0015] (c)對(duì)步驟(b)所得黃芪甲苷提取物進(jìn)行Smith降解，獲得所述的環(huán)黃芪醇提取物；
[0016] 步驟(c)中，具體的，所述Smith降解的操作方法為:將黃芪甲苷提取物、高碘酸鈉 加入到純水或者20 %~90 % (v/v，優(yōu)選20 % )甲醇水溶液A中，于0~35 °C進(jìn)行氧化反應(yīng)11~ 13h，之后用乙二醇淬滅反應(yīng)，反應(yīng)液先進(jìn)行減壓濃縮，再用乙酸乙酯萃取，萃取液蒸除溶 劑，殘余物質(zhì)溶于40 %~90 % (v/v，優(yōu)選60 % )甲醇水溶液B中，加入硼氫化鈉，于0~35 °C進(jìn) 行還原反應(yīng)3~5h，再用濃硫酸(98wt%)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH至1~3,室溫(20~30 °C)水解22~ 26h，水解之后反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，萃取液蒸除溶劑，獲得所述的環(huán)黃芪醇提取物；
[0017] 所述黃芪甲苷提取物與高碘酸鈉的質(zhì)量比為1:0.4~6,優(yōu)選1:1;
[0018] 所述殘余物質(zhì)與硼氫化鈉的質(zhì)量比為1:1~5，優(yōu)選1:1;
[0019] 推薦所述純水或者甲醇水溶液A的體積用量以黃芪甲苷提取物的質(zhì)量計(jì)為120~ 200mL/g;推薦所述甲醇水溶液B的體積用量以殘余物質(zhì)的質(zhì)量計(jì)為150~800mL/g;
[0020] 所述的甲醇水溶液A、甲醇水溶液B沒有特殊的含義，標(biāo)記為"A"、"B"只是用于區(qū)分 不同操作步驟中用到的甲醇水溶液。
[0021] 本發(fā)明制得的環(huán)黃芪醇提取物中的環(huán)黃芪醇含量為16.45%~32.58%。
[0022]本發(fā)明制得的環(huán)黃芪醇提取物可應(yīng)用于抗衰老藥物及保健品的制備。
[0023]本發(fā)明的有益效果在于：
[0024] (1)本發(fā)明環(huán)黃芪醇提取物的制備，通過對(duì)提取條件中的pH值、高碘酸鈉用量、甲 醇濃度的多次試驗(yàn)，得到了最適宜的提取方法，且該方法重現(xiàn)性良好，簡(jiǎn)便易行；
[0025] (2)本發(fā)明制備的環(huán)黃芪醇提取物能明顯減緩H202對(duì)PC12細(xì)胞造成的衰老傷害，提 高細(xì)胞活力，提示本發(fā)明制備方法得到的環(huán)黃芪醇提取物具有一定的抗衰老活性。 (四）
【附圖說明】
[0026] 圖1為實(shí)施例17中黃芪甲苷提取物液相色譜圖；
[0027] 圖2為實(shí)施例18中環(huán)黃芪醇提取物液相色譜圖；
[0028] 圖3-A、3-B為實(shí)施例19中基于HPLC-LTQ-〇rbitrap-MSn技術(shù)的環(huán)黃芪醇提取物質(zhì) 譜圖；圖3-A表示正離子模式下的環(huán)黃芪醇提取物質(zhì)譜圖，圖3-B表示負(fù)離子模式下的環(huán)黃 芪醇提取物質(zhì)譜圖；
[0029]圖4-A、4-B為實(shí)施例20中MTT法檢測(cè)環(huán)黃芪醇提取物對(duì)PC12細(xì)胞的影響；圖4-A表 示環(huán)黃芪醇提取物對(duì)PC12細(xì)胞的毒性，圖4-B表示環(huán)黃芪醇提取物對(duì)H2〇2致衰PC12細(xì)胞的保 護(hù)作用;注：圖中的*表示P〈〇. 05; **表示P〈0.01;
[0030] 圖5為實(shí)施例21中環(huán)黃芪醇提取物對(duì)PC12細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性的影響；其中，A 表示對(duì)照組最終的染色情況，B表示造模組的最終染色情況，C表示低濃度藥物保護(hù)組的染 色情況，D表示中濃度藥物保護(hù)組的染色情況，E表示高濃度藥物保護(hù)組的染色情況；（丨)表 示被染色的PC12衰老細(xì)胞，標(biāo)尺示50μΜ;
[0031] 圖6為實(shí)施例22中環(huán)黃芪醇提取物對(duì)Η202致衰細(xì)胞端粒酶活性的影響;注：圖中的* 表示Ρ〈0.05; 表示Ρ〈0.01。 (五)
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此。
[0033] 實(shí)施例1本發(fā)明黃芪甲苷粗提物的制備方法：
[0034]所用黃芪符合《中國(guó)藥典》2010年版一部有關(guān)規(guī)定。取黃芪粗粉30g加入pH為13的 75%乙醇10倍量浸泡過夜，用同樣的溶液回流提取2次，每次2h，過濾，合并濾液，減壓蒸除 溶劑后冷凍干燥，獲得黃芪甲苷粗提物〇 . 8084g，經(jīng)高效液相檢測(cè)，確定黃芪甲苷含量為 0.7399%。
[0035]實(shí)施例2本發(fā)明黃芪甲苷粗提物的制備方法：
[0036]所用黃芪符合《中國(guó)藥典》2010年版一部有關(guān)規(guī)定。取黃芪粗粉30g加入pH為12的 75%乙醇10倍量浸泡過夜，用同樣的溶液回流提取2次，每次2h，過濾，合并濾液，減壓蒸除 溶劑后冷凍干燥，獲得黃芪甲苷粗提物〇 . 8080g，經(jīng)高效液相檢測(cè)，確定黃芪甲苷含量為 0.7381%。
[0037]實(shí)施例3本發(fā)明黃芪甲苷粗提物的制備方法：
[0038]所用黃芪符合《中國(guó)藥典》2010年版一部有關(guān)規(guī)定。取黃芪粗粉30g加入pH為11的 75%乙醇10倍量浸泡過夜，用同樣的溶液回流提取2次，每次2h，過濾，合并濾液，減壓蒸除 溶劑后冷凍干燥，獲得黃芪甲苷粗提物〇 . 9088g，經(jīng)高效液相檢測(cè)，確定黃芪甲苷含量為 0.6596%。
[0039] 實(shí)施例4本發(fā)明黃芪甲苷提取物的制備方法：
[0040] 根據(jù)實(shí)施例1制備獲得的黃芪甲苷粗提物3g，將其溶于10倍量水中，通過D101大孔 樹脂填充的樹脂柱，依次用1 〇倍量樹脂柱體積的水、30 %乙醇水溶液除去大極性雜質(zhì)、再用 70%乙醇水溶液洗脫，收集70%乙醇水洗脫液，回收乙醇，減壓濃縮至干粉，得到黃芪甲苷 提取物，經(jīng)高效液相檢測(cè)，確定黃芪甲苷含量為14.63 %。
[0041] 實(shí)施例5本發(fā)明黃芪甲苷提取物的制備方法：
[0042]根據(jù)實(shí)施例1制備獲得的黃芪甲苷粗提物3g，將其溶于10倍量水中，通過D101大孔 樹脂填充的樹脂柱，依次用1 〇倍量樹脂柱體積的水、35 %乙醇水溶液除去大極性雜質(zhì)、再用 70%乙醇水溶液洗脫，收集70%乙醇水洗脫液，回收乙醇，減壓濃縮至干粉，得到黃芪甲苷 提取物，經(jīng)高效液相檢測(cè)，確定黃芪甲苷含量為9.08 %。
[0043]實(shí)施例6本發(fā)明黃芪甲苷提取物的制備方法：
[0044]根據(jù)實(shí)施例1制備獲得的黃芪甲苷粗提物3g，將其溶于10倍量水中，通過D101大孔 樹脂填充的樹脂柱，依次用10倍量樹脂柱體積的水、40 %乙醇水溶液除去大極性雜質(zhì)、再用 70%乙醇水溶液洗脫，收集70%乙醇水洗脫液，回收乙醇，減壓濃縮至干粉，得到黃芪甲苷 提取物，經(jīng)高效液相檢測(cè)，確定黃芪甲苷含量為9.91 %。
[0045]實(shí)施例7本發(fā)明環(huán)黃芪醇提取物的制備方法：
[0046]取根據(jù)實(shí)施例4方法獲得的黃芪甲苷提取物200mg，加入0.6倍量的高碘酸鈉，在 60%的甲醇水溶液(30mL)環(huán)境中，于25°C進(jìn)行氧化反應(yīng)12小時(shí)，滴加乙二醇(0.0781g)停止 反應(yīng);反應(yīng)液減壓濃縮除去甲醇，用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，除去溶劑，殘?jiān)?溶于60%甲醇水溶液(20mL)中，加入與殘?jiān)亓康缺读康呐饸浠c，于25°C進(jìn)行還原反應(yīng)4 小時(shí)；用濃硫酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至2,室溫水解24小時(shí)；反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī) 相，除去有機(jī)溶劑，獲得環(huán)黃芪醇提取物0. 〇263g，HPLC測(cè)得環(huán)黃芪醇含量為20.11 %。
[0047]實(shí)施例8本發(fā)明環(huán)黃芪醇提取物的制備方法：
[0048]取根據(jù)實(shí)施例4方法獲得的黃芪甲苷提取物200mg，加入1倍量的高碘酸鈉，在60 % 的甲醇水溶液（30mL)環(huán)境中，于25°C進(jìn)行氧化反應(yīng)12小時(shí)，滴加乙二醇（0.0985g)停止反 應(yīng);反應(yīng)液減壓濃縮除去甲醇，用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，除去溶劑，殘?jiān)?于60 %甲醇水溶液(20mL)中，加入與殘?jiān)亓康缺读康呐饸浠c，于25°C進(jìn)行還原反應(yīng)4小 時(shí)；用濃硫酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至2,室溫水解24小時(shí)；反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相， 除去有機(jī)溶劑，獲得環(huán)黃芪醇提取物0. 〇171g，HPLC測(cè)得環(huán)黃芪醇含量為25.44%。
[0049] 實(shí)施例9本發(fā)明環(huán)黃芪醇提取物的制備方法：
[0050] 取根據(jù)實(shí)施例4方法獲得的黃芪甲苷提取物lOOOmg，加入1倍量的高碘酸鈉，在 90 %的甲醇水溶液（112mL)環(huán)境中，于15 °C進(jìn)行氧化反應(yīng)12小時(shí)，滴加乙二醇(0.42g)停止 反應(yīng);反應(yīng)液減壓濃縮除去甲醇，用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，除去溶劑，殘?jiān)?溶于60%甲醇水溶液（100mL)中，加入殘?jiān)亓?倍量的硼氫化鈉，于15°C進(jìn)行還原反應(yīng)4小 時(shí)；用濃硫酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至2,室溫水解24小時(shí)；反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相， 除去有機(jī)溶劑，獲得環(huán)黃芪醇提取物0. 〇62g，HPLC測(cè)得環(huán)黃芪醇含量為25.05 %。
[0051] 實(shí)施例10本發(fā)明環(huán)黃芪醇提取物的制備方法：
[0052]取根據(jù)實(shí)施例4方法獲得的黃芪甲苷提取物200mg，加入1倍量的高碘酸鈉，在20 % 的甲醇水溶液（30mL)環(huán)境中，于35°C進(jìn)行氧化反應(yīng)12小時(shí)，滴加乙二醇（0.1025g)停止反 應(yīng);反應(yīng)液減壓濃縮除去甲醇，用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，除去溶劑，殘?jiān)?于60 %甲醇水溶液(20mL)中，加入與殘?jiān)亓康缺读康呐饸浠c，于35°C進(jìn)行還原反應(yīng)4小 時(shí)；用濃硫酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至2,室溫水解24小時(shí)；反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相， 除去有機(jī)溶劑，獲得環(huán)黃芪醇提取物0. 〇291g，HPLC測(cè)得環(huán)黃芪醇含量為32.58%。
[0053]實(shí)施例11本發(fā)明環(huán)黃芪醇提取物的制備方法：
[0054]取根據(jù)實(shí)施例4方法獲得的黃芪甲苷提取物200mg，加入3倍量的高碘酸鈉，在60 % 的甲醇水溶液（30mL)環(huán)境中，于10°C進(jìn)行氧化反應(yīng)12小時(shí)，滴加乙二醇（0.2772g)停止反 應(yīng);反應(yīng)液減壓濃縮除去甲醇，用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，除去溶劑，殘?jiān)?于60 %甲醇水溶液（20mL)中，加入與殘?jiān)亓康缺读康呐饸浠c，于5°C進(jìn)行還原反應(yīng)4小 時(shí)；用濃硫酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至2,室溫水解24小時(shí)；反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相， 除去有機(jī)溶劑，獲得環(huán)黃芪醇提取物0. 〇254g，HPLC測(cè)得環(huán)黃芪醇含量為23.07 %。
[0055]實(shí)施例12本發(fā)明環(huán)黃芪醇提取物的制備方法：
[0056]取根據(jù)實(shí)施例4方法獲得的黃芪甲苷提取物200mg，加入5倍量的高碘酸鈉，在60 % 的甲醇水溶液(30mL)環(huán)境中，于15°C進(jìn)行氧化反應(yīng)12小時(shí)，滴加乙二醇(0.42g)停止反應(yīng)； 反應(yīng)液減壓濃縮除去甲醇，用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，除去溶劑，殘?jiān)苡?60%甲醇水溶液（20mL)中，加入與殘?jiān)亓康缺读康呐饸浠c，于10°C進(jìn)行還原反應(yīng)4小 時(shí)；用濃硫酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至2,室溫水解24小時(shí)；反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相， 除去有機(jī)溶劑，獲得環(huán)黃芪醇提取物0. 〇329g，HPLC測(cè)得環(huán)黃芪醇含量為20.71 %。
[0057]實(shí)施例13本發(fā)明環(huán)黃芪醇提取物的制備方法：
[0058]取根據(jù)實(shí)施例4方法獲得的黃芪甲苷提取物200mg，加入5倍量的高碘酸鈉，在純水 溶液(30mL)環(huán)境中，于10°C進(jìn)行氧化反應(yīng)12小時(shí)，滴加乙二醇(0.4364g)停止反應(yīng);反應(yīng)液 減壓濃縮除去甲醇，用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，除去溶劑，殘?jiān)苡?0%甲 醇水溶液(20mL)中，用殘?jiān)亓康缺读康呐饸浠c，于10 °C進(jìn)行還原反應(yīng)4小時(shí)；用濃硫酸 調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至2，室溫水解24小時(shí)；反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，除去有機(jī)溶 劑，獲得環(huán)黃芪醇提取物〇. 〇235g，HPLC測(cè)得環(huán)黃芪醇含量為21.71 %。
[0059] 實(shí)施例14本發(fā)明環(huán)黃芪醇提取物的制備方法：
[0060] 取根據(jù)實(shí)施例4方法獲得的黃芪甲苷提取物200mg，加入5倍量的高碘酸鈉，在20 % 的甲醇水溶液（30mL)環(huán)境中，于10°C進(jìn)行氧化反應(yīng)12小時(shí)，滴加乙二醇（0.4360g)停止反 應(yīng);反應(yīng)液減壓濃縮除去甲醇，用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，除去溶劑，殘?jiān)?于60 %甲醇水溶液(20mL)中，加入與殘?jiān)亓康缺读康呐饸浠c，于10°C進(jìn)行還原反應(yīng)4小 時(shí)；用濃硫酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至2,室溫水解24小時(shí)；反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相， 除去有機(jī)溶劑，獲得環(huán)黃芪醇提取物0. 〇274g，HPLC測(cè)得環(huán)黃芪醇含量為24.17 %。
[0061] 實(shí)施例15本發(fā)明環(huán)黃芪醇提取物的制備方法：
[0062]取根據(jù)實(shí)施例4方法獲得的黃芪甲苷提取物200mg，加入5倍量的高碘酸鈉，在60 % 的甲醇水溶液(30mL)環(huán)境中，于3°C進(jìn)行氧化反應(yīng)12小時(shí)，滴加乙二醇(0.4377g)停止反應(yīng)； 反應(yīng)液減壓濃縮除去甲醇，用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，除去溶劑，殘?jiān)苡?20 %甲醇水溶液(20mL)中，加入與殘?jiān)亓康缺读康呐饸浠c，于5 °C進(jìn)行還原反應(yīng)4小時(shí)； 用濃硫酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至2,室溫水解24小時(shí);反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，除去 有機(jī)溶劑，獲得環(huán)黃芪醇提取物〇. 〇284g，HPLC測(cè)得環(huán)黃芪醇含量為16.45 %。
[0063]實(shí)施例16本發(fā)明環(huán)黃芪醇提取物的制備方法：
[0064]取根據(jù)實(shí)施例4方法獲得的黃芪甲苷提取物200mg，加入5倍量的高碘酸鈉，在60 % 的甲醇水溶液(30mL)環(huán)境中，于8°C進(jìn)行氧化反應(yīng)12小時(shí)，滴加乙二醇(0.4506g)停止反應(yīng)； 反應(yīng)液減壓濃縮除去甲醇，用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并有機(jī)相，除去溶劑，殘?jiān)苡?60%甲醇水溶液(20mL)中，加入與殘?jiān)亓康缺读康呐饸浠c，于8°C進(jìn)行還原反應(yīng)4小時(shí)； 用濃硫酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH至2,室溫水解24小時(shí);反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，除去 有機(jī)溶劑，獲得環(huán)黃芪醇提取物〇. 〇331g，HPLC測(cè)得環(huán)黃芪醇含量為18.80%。
[0065] 實(shí)施例17黃芪甲苷提取物中黃芪甲苷含量的確定：
[0066] 1色譜條件
[0067] 色譜柱Phenomenex C18(4.6mm*250mm，5ym);流動(dòng)相乙臆(Α)-〇·3% 甲酸水(B);流 速0.5mL/min;柱溫35°C ;進(jìn)樣量5yL;漂移溫度40°C ;氮?dú)饬魉?.5L/min;洗脫梯度如下：〇-15min,66%B；15-20min,66%-55%B；20-25min,55%-50%B；25-35min,50%-49%B；35-40min，49 %-30 % B;40-45min，30 %-0 % B。
[0068] 2供試品溶液的制備
[0069]取根據(jù)實(shí)施例1所制備得到的黃芪甲苷提取物0.8084g于50mL容量瓶中，用甲醇定 容，超聲溶解，作為供試品溶液。
[0070] 3對(duì)照品溶液的制備
[0071] 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品l.Olmg，置lmL容量瓶中，加甲醇使之溶解并稀釋至刻 度，作為對(duì)照品溶液。
[0072] 4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)
[0073]供試品進(jìn)樣5yL測(cè)定，結(jié)果表明，黃芪甲苷的保留時(shí)間約為27min，樣品中黃芪甲苷 色譜峰與其他雜質(zhì)峰能完全分離，因此可見樣品中含有黃芪甲苷。黃芪甲苷提取物液相色 譜圖見圖1。
[0074] 5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍的考察
[0075] 取對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣3以1^、5以1^、7以1^、1(^1^、15以1^，按上述色譜條件依法測(cè)定峰面 積值，以進(jìn)樣量yg的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)直線回歸，得回歸方程為Y = 1.3019X+7.3249，R2 = 0.9984，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn) 表明：黃芪甲苷對(duì)照品在3.03yg-15.15yg進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)與峰面積的自然對(duì)數(shù)呈良好的 線性關(guān)系。
[0076]表1黃芪甲苷線性范圍考察表 [0077]
[0078] 6樣品中黃芪甲苷的含量測(cè)定
[0079] 取按照實(shí)施例1~6制備的供試品，按上述試驗(yàn)方法，分別制備適宜濃度的供試品 溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2。
[0080] 表2樣品中黃芪甲苷含量測(cè)定
[0081]
[0082] 實(shí)施例18環(huán)黃芪醇提取物中環(huán)黃芪醇含量的確定：
[0083] 1色譜條件
[0084] 色譜柱Phenomenex C18(4.6mm*250mm，5ym);流動(dòng)相乙臆(Α)-〇·3% 甲酸水（B);流 速0.5mL/min;柱溫35°C ;進(jìn)樣量5yL;漂移溫度40°C ;氮?dú)饬魉?.5L/min;洗脫梯度如下：〇-lOmin,50 %-40 % B；l〇-20min,40 %-30 % B；2〇-30min,30 %-25 % B；3〇-35min,25 %-10 % B； 35-40min,10%-0%B〇
[0085] 2供試品溶液的制備
[0086] 取根據(jù)實(shí)施例9所制備得到的CAG提取物15mg于5mL容量瓶中，用70%甲醇水溶液 定溶，超聲溶解，作為供試品溶液。
[0087] 3對(duì)照品溶液的制備
[0088] 精密稱取環(huán)黃芪醇對(duì)照品2.04mg，置2mL容量瓶中，加70%甲醇水溶液使之溶解并 稀釋至刻度，搖勻，作為環(huán)黃芪醇對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液200此至lmL容量瓶中，加 70%甲醇水溶液稀釋至刻度，超聲溶解，作為對(duì)照品溶液。
[0089] 4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)
[0090]供試品進(jìn)樣5yL測(cè)定，結(jié)果表明，環(huán)黃芪醇的保留時(shí)間約為19min，樣品中環(huán)黃芪醇 色譜峰與其他雜質(zhì)峰能完全分離，因此可見樣品中含有環(huán)黃芪醇。環(huán)黃芪醇提取物液相色 譜圖見圖2。
[0091] 5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍的考察
[0092] 分別精密吸取對(duì)照品溶液10yL、50yL、1 OOyL、200yL、500yL，置于lmL容量瓶中，加 70 %甲醇水稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量yg的自然對(duì)數(shù)為橫坐 標(biāo)，峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)直線回歸，得回歸方 程為￥=1.237乂+7.2748，妒=0.9986，結(jié)果見表3。實(shí)驗(yàn)表明：環(huán)黃芪醇對(duì)照品在0.2554 8-5.100yg進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)與峰面積的自然對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系。
[0093]表3環(huán)黃芪醇線性范圍考察表
[0094]
[0095] 6樣品中環(huán)黃芪醇的含量測(cè)定
[0096]取按照實(shí)施例7~16制備的供試品，按上述試驗(yàn)方法，分別制備成適宜濃度的供試 品溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表4。
[0097]表4樣品中環(huán)黃芪醇含量測(cè)定
[0098]
[0099] 實(shí)施例19環(huán)黃芪醇提取物的成分推測(cè)：
[0100]本發(fā)明采用HPLC-LTQ-〇rbitrap-MSn技術(shù)獲得環(huán)黃芪醇提取物樣品的質(zhì)譜圖，根 據(jù)圖譜，結(jié)合部分標(biāo)準(zhǔn)品的比對(duì)，進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。由于標(biāo)準(zhǔn)品種類的限制，目前僅對(duì)提取物 組分做一個(gè)大致推測(cè)，以供進(jìn)一步研究的參考。
[0101] 1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備
[0102] 取適量黃芪甲苷、環(huán)黃芪醇及芒柄花素標(biāo)準(zhǔn)品于1.5mL離心管中，用800yL的70% 甲醇水溶液超聲溶解，備用。
[0103] 2樣品溶液的制備
[0104] 考慮到提取物中化合物種類的多樣性，選取含有成分較多的實(shí)施例9所制備得到 的環(huán)黃芪醇提取物為樣品，稱取約l〇mg，用70%甲醇水溶液定容到lmL，作為樣品溶液。
[0105] 3質(zhì)譜條件
[0106] HPLC-LTQ-Orbitrap-MSn質(zhì)譜條件:采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，鞘氣壓 力303 · 4kPa，輔助氣壓力34 · 5kPa，噴霧電壓2 · 5kV，毛細(xì)管溫度350°C，管透鏡電壓96V，毛細(xì) 管電壓35V;樣品先采用FT進(jìn)行全掃描，質(zhì)量掃描范圍m/z 120~1200,分辨率FS 30000，MS2 7500,二級(jí)質(zhì)譜采用動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)依賴性掃描(data d印endent scan，DDS)，碰撞能量設(shè)為25% ~35 %，取上一級(jí)豐度最高峰進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)碎片掃描，以離子講（dynode)檢測(cè)。 通過Xcal ibur軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。
[0107] 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析
[0108] 提取物在正、負(fù)離子模式下的質(zhì)譜圖見圖3-A、3_B。
[0109] 經(jīng)過質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，比對(duì)大量文獻(xiàn)中相關(guān)化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì) 譜數(shù)據(jù)，對(duì)提取物中部分峰組分進(jìn)行初步鑒定，鑒定結(jié)果如表5、表6所示。
[0110]表5正離子模式下質(zhì)譜圖中峰組分鑒定 [0111]
[0112]
[0113]表6負(fù)離子模式下質(zhì)譜圖中峰組分鑒定
[0114]
[0116]實(shí)施例20CAG提取物對(duì)H2〇2氧化損傷的PC12細(xì)胞活性的影響：
[0117] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0118] 1.1藥物:環(huán)黃芪醇提取物由實(shí)施例9所述制備方法制得，純度為25.05%。臨用前 用分析級(jí)DMS0配制成200mg/mL的母液，除菌備用。
[0119] 1.2材料:PC12細(xì)胞由中國(guó)藥科大學(xué)李萍教授饋贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、 馬血清(HS)、胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)粉劑、PBS購(gòu)買自禹杰生物科技有限公司；雙氧水、DMS0 購(gòu)買自Sigma公司。
[0120] 1.3儀器與器械:無菌室、超凈臺(tái)、低速離心機(jī)、普通光學(xué)顯微鏡、酒精燈、培養(yǎng)皿、 離心管、酶標(biāo)儀、震蕩儀。
[0121] 2實(shí)驗(yàn)步驟
[0122] 2.1細(xì)胞培養(yǎng):將PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、5%馬血清及1%雙抗(青鏈霉 素混合液)的DMEM培養(yǎng)基中，置于5 %C02、飽和濕度、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。細(xì)胞貼壁約80 %時(shí) 用0.25 %胰蛋白酶消化傳代。
[0123] 2.2環(huán)黃芪醇提取物的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
[0124] 2.2.1細(xì)胞檢測(cè)前處理:將貼壁約80%時(shí)的PC12細(xì)胞制成密度為2.0*10~5個(gè)/mL的 細(xì)胞混懸液，按照每孔200yL的體積接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于上述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞 貼壁約8 0 %時(shí)分組處理。設(shè)置對(duì)照組、調(diào)零組及給藥組（給藥濃度依次為：0.01 m g / m L、 0 · lmg/mL、0 · 5mg/mL、0 · 8mg/mL、1 · 0mg/mL、2 · 0mg/mL、5 · Omg/mL、10mg/mL)。給藥24小時(shí)后進(jìn) 行MTT檢測(cè)。
[0125] 2.2.2MTT檢測(cè)：每孔加入20yLMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，吸凈培養(yǎng)液，每孔加入 DMS0 150yL，震蕩15min，用酶標(biāo)儀測(cè)檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm，參比波長(zhǎng)為630nm的0D值，根據(jù)0D值 計(jì)算出細(xì)胞活力，計(jì)算公式如下：
[0126]
[0127]根據(jù)細(xì)胞活力，計(jì)算出細(xì)胞抑制率=1-細(xì)胞活力。根據(jù)細(xì)胞抑制率繪制出藥物毒 性曲線。
[0128] 2.3環(huán)黃芪醇提取物的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)
[0129] 2.3.1細(xì)胞檢測(cè)前處理：給藥前處理同2.2所述。設(shè)置對(duì)照組、造模組、調(diào)零組及給 藥組（給藥濃度依次為0 · 001mg/mL、0 · 01mg/mL、0 · 05mg/mL、0 · lmg/mL、0 · 5mg/mL、lmg/mL)。 給藥12小時(shí)后，用DMEM配制的濃度為800μΜ的H2〇2溶液進(jìn)行造模，6小時(shí)后進(jìn)行MTT檢測(cè)。 [0130] 2.3.2MTT檢測(cè):步驟同2.2所述。最后根據(jù)細(xì)胞活力繪制出藥物保護(hù)作用柱狀圖。
[0131] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0132] 結(jié)果顯示實(shí)施例9制備得到的環(huán)黃芪醇提取物對(duì)PC12細(xì)胞的IC50值為1.39mg/mL。 在實(shí)驗(yàn)濃度范圍〇.〇〇11^/1^~0.111^/1^內(nèi)，該提取物對(duì)!1 2〇2致衰的？(：12細(xì)胞體現(xiàn)出了一定 的保護(hù)作用。結(jié)果見圖4-A、4-B。
[0133] 實(shí)施例21CAG提取物對(duì)PC12細(xì)胞β-半乳糖苷酶活性的影響：
[0134] 1.實(shí)驗(yàn)材料
[0135] 1.1藥物：同實(shí)施例20所述。
[0136] 1.2材料:PC12細(xì)胞由中國(guó)藥科大學(xué)李萍教授饋贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、 馬血清(HS)、胰蛋白酶、PBS購(gòu)買自禹杰生物科技有限公司；雙氧水、DMS0購(gòu)買自Sigma公司； 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色試劑盒購(gòu)買自碧云天生物技術(shù)有限公司。
[0137] 1.3儀器與器械:無菌室、超凈臺(tái)、低速離心機(jī)、普通光學(xué)顯微鏡、酒精燈、培養(yǎng)皿、 離心管、震蕩儀、恒溫水浴鍋。
[0138] 2實(shí)驗(yàn)步驟
[0139] 2.1細(xì)胞培養(yǎng):同實(shí)施例20所述。
[0140] 2.2細(xì)胞檢測(cè)前處理:將貼壁約80%時(shí)的PC12細(xì)胞制成密度為4.0*10~5個(gè)/mL的細(xì) 胞混懸液，按照每孔800yL的體積接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于上述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼 壁約80 %時(shí)分組處理。設(shè)置對(duì)照組、造模組及給藥組(給藥濃度依次為0.00 lmg/mL、0.05mg/ mL、0. lmg/mL)。給藥12小時(shí)后，用DMEM配制的濃度為800μΜ的H2〇2溶液進(jìn)行造模，6小時(shí)后進(jìn) 行半乳糖苷酶染色檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
[0141 ] 2.3衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性檢測(cè):a.吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用roS洗滌一次，每孔加 入250μ?3-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15min; b.吸除細(xì)胞固定液，用PBS洗滌三次，每 次三分鐘；c.吸除roS，每孔加入250yL染色工作液(染色液A:染色液B:染色液C: X-Gal溶液 =1:1:93:5;v/v/v/v) ;d.parafilm封住24孔板防止蒸發(fā)，37°C水浴鍋中孵育過夜；e.吸除 染色工作液，用PBS洗滌一次，置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。
[0142] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0143] 結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組細(xì)胞，經(jīng)過H202處理的細(xì)胞染色情況更明顯，而相對(duì)于造 模組細(xì)胞，低的給藥濃度下的細(xì)胞染色情況與造模組相差不大，中、高給藥濃度下的染色細(xì) 胞數(shù)低于造模組，給藥組的染色細(xì)胞數(shù)隨給藥濃度的上升而呈下降趨勢(shì)。由于衰老細(xì)胞表 達(dá)pH6.0時(shí)有高酶活性的β-半乳糖苷酶，而試劑盒正是以X-Gal為底物，在衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下會(huì)產(chǎn)生深藍(lán)色產(chǎn)物，即被染色的細(xì)胞就是處于衰老狀態(tài)的細(xì)胞。由此可 見，對(duì)Η 2〇2致衰的PC12細(xì)胞，環(huán)黃芪醇提取物體現(xiàn)出了一定的抗衰老活性。結(jié)果見圖5。
[0144] 實(shí)施例22環(huán)黃芪醇提取物對(duì)PC12細(xì)胞的端粒酶活性影響：
[0145] 1實(shí)驗(yàn)材料
[0146] 1.1藥物：同實(shí)施例20所述。
[0147] 1.2材料:PC12細(xì)胞由中國(guó)藥科大學(xué)李萍教授饋贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、 馬血清(HS)、胰蛋白酶、PBS購(gòu)買自禹杰生物科技有限公司；雙氧水、DMS0購(gòu)買自Sigma公司； RIPA裂解液(強(qiáng)）、PMSF(100mM)購(gòu)買自碧云天生物技術(shù)有限公司；大鼠端粒酶(TE)酶聯(lián)免疫 分析(ELISA)試劑盒購(gòu)買自上海江萊生物有限公司。
[0148] 1.3儀器與器械:無菌室、超凈臺(tái)、低速離心機(jī)、倒置顯微鏡、酒精燈、培養(yǎng)皿、離心 管、震蕩儀、低溫離心機(jī)、冰袋。
[0149] 2實(shí)驗(yàn)步驟
[0150] 2.1細(xì)胞培養(yǎng):同實(shí)施例20所述。
[0151] 2.2細(xì)胞檢測(cè)前處理:將貼壁約80%時(shí)的PC12細(xì)胞制成密度為5.0*10~5個(gè)/mL的細(xì) 胞混懸液，按照每孔2mL的體積接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于上述培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁 約80%時(shí)分組處理。設(shè)置對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(濃度為2μΜ的環(huán)黃芪醇單體)及環(huán)黃芪醇提取 物給藥組(給藥濃度依次為0.01mg/mL、0. lmg/mL、0.5mg/mL)。給藥12小時(shí)后，用DMEM配制的 濃度為800μΜ的H2〇2溶液進(jìn)行造模，6小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞裂解液的制備。
[0152] 2.3細(xì)胞裂解液的制備:a.吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌兩次;b.吸除PBS，每孔加入 配制好的裂解液400yL，震搖30min; c.用lmL移液槍反復(fù)吹打，將裂解液吸取到1.5mL離心管 中，4°C離心，1500rpm，15min;d.移液槍吸取上清液300yL/支于1.5mL離心管中，封口，干冰 環(huán)境下保存，送檢。
[0153] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0154] 結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組及給藥組的端粒酶活性顯著高于對(duì)照組，且給藥組的端粒 酶活性隨著給藥濃度的增加而有所提高，可見在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，實(shí)施例9所制備的環(huán)黃芪 醇提取物具有較為明顯的端粒酶激活作用，提示該提取物具有良好的抗衰老作用。結(jié)果見 圖6 〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種環(huán)黃芪醇提取物，其特征在于，所述的環(huán)黃芪醇提取物由如下方法制備得到： (a) 將黃芪粗粉用pH值11~13的堿性醇水溶液進(jìn)行提取，蒸除溶劑干燥后獲得黃芪甲 昔粗提物； (b) 將步驟(a)得到的黃芪甲苷粗提物溶于2~10質(zhì)量倍的水中，得到黃芪甲苷粗提液， 將其加入填充有大孔樹脂的色譜柱中，靜態(tài)吸附4~6h后，依次用5~20倍樹脂柱體積的水、 體積分?jǐn)?shù)30 %~40 %乙醇水溶液、體積分?jǐn)?shù)70 %乙醇水溶液洗脫，收集體積分?jǐn)?shù)70 %乙醇 水洗脫液，減壓蒸除溶劑，得到黃芪甲苷提取物； 所述的大孔樹脂選自△03-17、厶8-8、0101、!^300中的一種； (c) 將步驟(b)得到的黃芪甲苷提取物、高碘酸鈉加入到純水或者體積分?jǐn)?shù)20%~90% 甲醇水溶液A中，于0~35°C進(jìn)行氧化反應(yīng)11~13h，之后用乙二醇淬滅反應(yīng)，反應(yīng)液先進(jìn)行 減壓濃縮，再用乙酸乙酯萃取，萃取液蒸除溶劑，殘余物質(zhì)溶于體積分?jǐn)?shù)40%~90%甲醇水 溶液B中，加入硼氫化鈉，于0~35°C進(jìn)行還原反應(yīng)3~5h，再用濃硫酸調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH至1~ 3,室溫水解22~26h，水解之后反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，萃取液蒸除溶劑，獲得所述的環(huán)黃 苗醇提取物； 所述黃芪甲苷提取物與高碘酸鈉的質(zhì)量比為1:0.4~6;所述殘余物質(zhì)與硼氫化鈉的質(zhì) 量比為1:1~5。2. 如權(quán)利要求1所述的環(huán)黃芪醇提取物，其特征在于，步驟(a)中，所述提取的操作方法 為:將黃芪粗粉與pH值11~13的堿性醇水溶液以料液質(zhì)量比1:6~10混合，浸泡12~16h，之 后升溫至回流提取2~3h，過濾，得到一次濾液和一次濾渣;將所得一次濾渣與pH值11~13 的堿性醇水溶液以料液質(zhì)量比1:8~10混合，升溫至回流提取2~3h，過濾，得到二次濾液和 二次濾渣;棄去二次濾渣，合并一次濾液和二次濾液，減壓蒸除溶劑，之后冷凍干燥，得到黃 芪甲苷粗提物。3. 如權(quán)利要求1或2所述的環(huán)黃芪醇提取物，其特征在于，所述的堿性醇水溶液為pH值 11~13的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇水溶液，所述的堿性醇水溶液用氫氧化鈉進(jìn)行調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)。4. 如權(quán)利要求1所述的環(huán)黃芪醇提取物，其特征在于，步驟(b)中，所述的大孔樹脂為 D101樹脂。5. 如權(quán)利要求1所述的環(huán)黃芪醇提取物，其特征在于，步驟(c)中，所述純水或者甲醇水 溶液A的體積用量以黃芪甲苷提取物的質(zhì)量計(jì)為120~200mL/g。6. 如權(quán)利要求1所述的環(huán)黃芪醇提取物，其特征在于，步驟(c)中，所述甲醇水溶液B的 體積用量以殘余物質(zhì)的質(zhì)量計(jì)為150~800mL/g。7. 如權(quán)利要求1所述的環(huán)黃芪醇提取物，其特征在于，步驟(c)中，所述黃芪甲苷提取物 與高碘酸鈉的質(zhì)量比為1:1。8. 如權(quán)利要求1所述的環(huán)黃芪醇提取物，其特征在于，步驟(c)中，所述殘余物質(zhì)與硼氫 化鈉的質(zhì)量比為1:1。9. 如權(quán)利要求1所述的環(huán)黃芪醇提取物在抗衰老藥物及保健品制備中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A23L33/105GK106083979SQ201610445236
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月17日
【發(fā)明人】張慧, 章詩(shī)迪, 顏繼忠, 呂華偉, 沈芒芒
【申請(qǐng)人】浙江工業(yè)大學(xué)