后部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種后部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶的制備方法。該方法包括以下步驟：將編碼氨基酸序列SER的DNA分子重組到家蠶染色體上，利用熒光蛋白標(biāo)記篩選得到所述后部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶。其中，編碼氨基酸序列SER的DNA分子的核苷酸序列5'端至3'端依次為家蠶絲素重鏈蛋白Fib?H基因啟動子、家蠶Fib?H基因5'端信號肽編碼序列、家蠶絲膠蛋白質(zhì)SER3編碼序列Ser3和家蠶Fib?H基因3'端序列。本發(fā)明的方法能夠使家蠶中部絲腺特異表達的親水性絲膠蛋白基因能夠同時在后部絲腺高效表達和分泌，并在家蠶成熟幼蟲吐絲結(jié)繭后，獲得絲素纖維中含有親水性絲膠蛋白成分的蠶繭，進而獲得纖維吸水性能得到提高的家蠶絲。
【專利說明】
后部竺腺可合成和分泌親水性竺膠蛋白的家蠶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種后部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白 的家蠶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 家蠶吐絲結(jié)雖，雖絲則能夠生產(chǎn)絲蛋白質(zhì)纖維。絲腺是家蠶高度特化的合成和分 泌絲蛋白的器官，一條家蠶幼蟲擁有2條非常相似的絲腺，每條絲腺分前部絲腺、中部絲腺 和后部絲腺Ξ個功能區(qū)域。中部絲腺和后部絲腺是蠶絲蛋白質(zhì)的合成和分泌部位，而前部 絲腺是絲蛋白輸出體外的管道。
[0003] 家蠶后部絲腺主要合成和分泌絲素蛋白，運是一種具有β折疊結(jié)晶結(jié)構(gòu)，堅初而有 彈性的蛋白質(zhì)，占雖絲總量的70-80%，是制作絲銅等紡織品的基本原料。絲素蛋白質(zhì)包括 絲素輕鏈（light chain，F(xiàn)ib-L)和重鏈化eavy chain，F(xiàn);Lb-H)，還有Ρ25蛋白（又稱纖維六聚 素，fibrohexamerin，F(xiàn)hx/P25)等（Yamaguchi et al.,1989；Sprague 1975；Couble et al.，1983)。它們分別由絲素蛋白基因 fib-H、fib-L和p253編碼，它們的表達具有嚴格的組 織和發(fā)育時期特異性（Couble et al.，1983;Maekawa&Suzuki 1980;Tsujimoto et al.， 1981;Tsuda et al. ,1981)。在家蠶后部絲腺中，門b-H、門b-L和P25W6:6:1的摩爾比組成 復(fù)合體，作為絲素的基本結(jié)構(gòu)單位（Inoue 2000)，其中Fib-H和Fib-LW二硫鍵相互連接， P25則W非共價鍵一疏水相互作用與Fib-H/門b-L復(fù)合體結(jié)合。P25具有分子伴侶樣的功能， 在絲素蛋白復(fù)合體的折疊 W及非溶解性長鏈蛋白的分泌中具有重要的功能（Tanaka et al.，1999)。
[0004] 家蠶的中部絲腺細胞中含有超過7種主要的絲膠蛋白，它們主要由3個位于家蠶第 11 連鎖群的Serl、Ser2和Ser3基因編碼（Okamoto et al.，1982;Michaille et al.，1986; 1990;化kasu et al. ,2007)，它們的表達受到所處組織部位和發(fā)育階段的控制。Seri基因 只在中部絲腺后部的150個細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄4種不同長度的絲膠mRNA，其中1條2.8化的mRNA在整 個5齡幼蟲期，只在靠近后部絲腺的42個細胞內(nèi)表達，而10.5，9.0和4. Okb巧巾mRNA只在其 余的108個細胞中，分別在不同的發(fā)育階段通過不同的剪接途徑產(chǎn)生（Couble et al.， 1983)。編碼SerlmRNA的外顯子選擇性拼接，在幼蟲不同發(fā)育期會產(chǎn)生多種蛋白變體，導(dǎo)致 在同一個體內(nèi)，各個轉(zhuǎn)錄事件后，單個基因會生產(chǎn)出結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同的蛋白，Seri的初級轉(zhuǎn) 錄物的不同剪接也受發(fā)育階段調(diào)控(Couble et al.，1983;Garelet曰1.，1997)。在5齡初 期，Ser2基因在所有的中部絲腺細胞中表達，后來其表達就被限制在中部絲腺的前部 (Takasu et al.，2010);Ser3只在中部絲腺的中前部表達SER3蛋白（Takasu et al.， 2010)。
[0005] 家蠶后部絲腺細胞合成的絲素蛋白質(zhì)不斷向腺腔分泌，并逐漸由后部絲腺腺腔向 中部絲腺腺腔移動。家蠶幼蟲在成熟后吐絲結(jié)雖過程中，絲素蛋白質(zhì)分子不斷聚合成直徑 Ο.?μπι左右、斷面呈不規(guī)則圓形的原纖（也稱原纖維），并進一步緊密集束而成蠶絲的絲素 "忍"。原纖是由結(jié)晶纖維及非結(jié)晶纖維分子聚合體沿軸向交替串聯(lián)而成，原纖間緊密相靠， 通過周緣分子側(cè)鏈牢固聯(lián)接，無間質(zhì)充填，運是絲素纖維特殊光澤和能夠生產(chǎn)超細蛋白質(zhì) 纖維的分子基礎(chǔ)。
[0006] 家蠶絲腺中的絲素原纖在形成絲素纖維和向前部移動的過程中先后被包裹了 4層 絲膠蛋白，其中SER3蛋白由于在中部絲腺中前部合成，因此包裹在最外層，不會與絲素蛋白 質(zhì)纖維直接接觸。沈R3蛋白具有較低的結(jié)晶度和高流動性。絲膠占蠶絲量的20%-30%，分 子構(gòu)象主要為無規(guī)卷曲，含有少量β結(jié)構(gòu)存在，但無 α螺旋結(jié)構(gòu)，分子空間結(jié)構(gòu)松散、無序。
[0007] 家蠶絲腺分泌的絲膠蛋白質(zhì)與絲素蛋白質(zhì)的氨基酸組成有非常明顯的氨基酸偏 好性差異。絲素蛋白主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和酪氨酸組成。絲膠蛋白則主要由絲氨 酸、天口冬氨酸、蘇氨酸、甘氨酸和谷氨酸等組成。絲膠蛋白中的甘氨酸、丙氨酸和酪氨酸含 量顯著低于絲素蛋白，并且游離氨基酸含量顯著高于絲素。絲膠蛋白鏈上有許多精氨酸、賴 氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸等長側(cè)鏈氨基酸，多膚鏈表面還含有-〇H、-COOH、- N此等極性親水基團。因此，絲膠蛋白具有優(yōu)異的吸濕、保濕和吸除異味等作用，其中絲膠蛋 白SER3的吸水性和流動性顯著高于Seri基因翻譯的4種緊貼絲素的內(nèi)層絲膠蛋白質(zhì)。
[000引家蠶絲紡織品生產(chǎn)的繳絲和精練等操作過程中，蠶絲表面的絲膠蛋白幾乎被除 凈，其中作為外層絲膠主要成分的SER3被清除的更加徹底。保留絲膠的家蠶絲織物，不僅存 在光澤差和染色不勻的問題，還存在織物柔軟度差，服用舒適性變差的問題，因此脫膠是提 高蠶絲光澤、保證染色均勻性的工藝要求。雖然脫膠后基本W(wǎng)絲素構(gòu)成的蠶絲纖維分子的 吸水性仍然高于棉纖維近30%，但絲銅的服用感受沒有棉布吸水。運是由于蠶絲價格昂貴， 絲銅幾乎都是薄型織物，纖維總吸水量少。為此，在絲素蛋白質(zhì)中滲入絲膠蛋白質(zhì)，有望改 變絲素的纖維結(jié)構(gòu)與理化性能，實現(xiàn)改變纖維功能的目的，特別是同時兼用絲素和絲膠的 雙重特性，運是在絲素纖維表面殘留絲膠，或者在蠶絲纖維或織物表面進行絲膠涂層無法 實現(xiàn)的一種功能利用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種后部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白的 家蠶的制備方法，該方法所獲得的家蠶在成熟幼蟲吐絲結(jié)雖后能獲得絲素纖維中含有親水 性絲膠蛋白成分的蠶雖。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了 W下技術(shù)方案：
[0011] 在一方面，本發(fā)明提供了一種后部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶的制 備方法，包括W下步驟：
[0012]將編碼氨基酸序列SER的DNA分子重組到家蠶染色體上，表達、翻譯并經(jīng)篩選得到 所述后部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶；
[0013] 其中，所述編碼氨基酸序列S邸的DNA分子的核巧酸序列5'端至3'端依次為家蠶絲 素重鏈蛋白Fib-H基因啟動子、家蠶Fib-H基因5'端信號膚編碼序列、家蠶絲膠蛋白質(zhì)SER3 編碼序列Ser3和家蠶Fib-H基因3'端序列。
[0014] 在一具體實施例中，家蠶絲膠蛋白質(zhì)SER3具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。 [001引優(yōu)選地，編碼SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有沈Q ID N0:2所示的 核巧酸序列。
[0016]在另一具體實施例中，氨基酸序列S邸具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。
[0017] 優(yōu)選地，編碼SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的DNA分子具有沈Q ID NO:4所示的 核巧酸序列。
[001引在一具體實施例中，將編碼氨基酸序列S邸的DNA分子重組到家蠶染色體上具體包 括W下步驟：
[0019] 構(gòu)建包含編碼氨基酸序列Sm?的DNA分子的轉(zhuǎn)座載體;及將所述轉(zhuǎn)座載體導(dǎo)入到家 蠶蠶卵中。
[0020] 優(yōu)選地，將轉(zhuǎn)座載體導(dǎo)入家蠶蠶卵的方法為顯微注射。
[0021] 優(yōu)選地，轉(zhuǎn)座載體為piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建的重組基因 Serf轉(zhuǎn)座載體PB-ser。
[0022] 更優(yōu)選地，piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建重組基因 Ser3轉(zhuǎn)座載體PB-ser具體包括W下步 驟：
[0023] 在SER3蛋白編碼核酸序列的上游5'端連接家蠶Fib-H基因啟動子和家蠶Fib-H基 因5'端信號膚編碼序列，在SER3蛋白編碼核酸序列的下游3'端連接家蠶Fib-H基因的3'端 序列得到重組基因 Ser;將帶有眼部和神經(jīng)特異性啟動子SV40及紅色巧光蛋白化Red元件的 PiggyBac-3xP3-DsRed質(zhì)粒(序列如SEQ ID ^:6所示）與人工合成的5日1'序列分別進行43(：1 和Fsel雙酶切；將酶切后的piggybac-3xP3-DsRed質(zhì)粒和Ser序列連接，從而得到轉(zhuǎn)座載體 PB-Ser〇
[0024] 優(yōu)選地，轉(zhuǎn)座載體PB-Ser具有SEQ ID NO:5所示核巧酸序列。
[0025] 在另一方面，本發(fā)明提供一種具有編碼SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的DNA分子的 轉(zhuǎn)座載體。
[00%]優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)座載體為piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建的重組基因 Serf轉(zhuǎn)座載體PB-ser。
[0027] 優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)座載體具有SEQ ID NO:5所示核巧酸序列。
[0028] 借由上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下優(yōu)點:本發(fā)明提供了一種后 部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶的制備方法，該方法能夠使家蠶中部絲腺特異 表達的親水性絲膠蛋白SER3能夠同時在后部絲腺高效表達和分泌，并在家蠶成熟幼蟲吐絲 結(jié)雖后，獲得絲素纖維中含有親水性絲膠蛋白成分的蠶雖，進而獲得纖維吸水性能得到提 高的家蠶絲和絲織物。
【附圖說明】
[0029] 圖1圖示編碼Sm?氨基酸序列的重組基因 Ser序列；
[0030] 圖2圖示重組基因 Ser的轉(zhuǎn)座載體PB-Ser;
[0031] 圖3圖示重組基因 Ser突變體家蠶和野生型家蠶的區(qū)別。
【具體實施方式】
[0032] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。應(yīng)理解的是，W下實 施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)理解為對本發(fā)明范圍的限制。
[0033] 本發(fā)明提供了一種后部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶的制備方法，將 編碼氨基酸序列S邸的DNA分子重組到家蠶染色體上，然后經(jīng)表達、翻譯即得。其中，編碼氨 基酸序列S邸的DNA分子的核巧酸序列5'端至3'端依次為家蠶絲素重鏈蛋白Fib-H基因啟動 子、家蠶Fib-H基因5'端信號膚編碼序列、家蠶絲膠蛋白質(zhì)SER3編碼序列Ser3和家蠶Fib-H 基因3'端序列。
[0034] 在本發(fā)明的制備方法中，編碼氨基酸序列SER是一種能夠在家蠶后部絲腺高效表 達，在家蠶中部絲腺特異表達的絲膠蛋白質(zhì)序列SER3的重組表達序列。將編碼氨基酸序列 S邸的DNA分子重組到家蠶染色體上，編碼氨基酸序列S邸在家蠶體內(nèi)表達后，家蠶幼蟲后部 絲腺細胞中在合成絲素蛋白質(zhì)的同時能夠合成絲膠蛋白質(zhì)SER3。進一步的，后部絲腺細胞 合成的絲膠蛋白質(zhì)SER3能夠向腺腔分泌，共存在后部絲腺腺腔中的絲素蛋白質(zhì)分子間。進 一步的，伴隨后部絲腺腺腔中的絲素蛋白一起逐漸向中部絲腺腺腔移動。進一步的，在家蠶 幼蟲成熟后吐絲結(jié)雖過程中，伴隨絲素蛋白質(zhì)分子的原纖形成充填在原纖之間，使原本無 間質(zhì)充填的絲素原纖間出現(xiàn)絲膠充填物。也有部分SER3在家蠶幼蟲吐絲過程中，伴隨前部 絲腺管道的約束和吐絲孔的擠壓，從絲素原纖間溢出，被包裹在內(nèi)層絲膠與絲素之間。
[0035] 在一具體實施方案中，家蠶絲膠蛋白質(zhì)SER3具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。 編碼SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的DNA分子具有SEQ ID NO:2所示的核巧酸序列。
[0036] 在一具體實施方案中，氨基酸序列sm?具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。
[0037] 由于密碼子的簡并性，可W存在很多種能夠編碼本發(fā)明的氨基酸序列sm?的DNA分 子。
[0038] 在一具體實施方案中，編碼SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的DNA分子具有SEQ ID NO: 4所示的核巧酸序列。
[0039] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可W根據(jù)通用的家蠶轉(zhuǎn)基因操作及轉(zhuǎn)基因蠶獲得步驟，將編碼氨 基酸序列Sm?的DNA分子重組到家蠶染色體上，制備得到穩(wěn)定遺傳的后部絲腺高效合成和分 泌親水性絲膠蛋白的家蠶模型。
[0040] 在一具體實施方案中，將編碼氨基酸序列S邸的DNA分子重組到家蠶染色體上包括 W下步驟:構(gòu)建包含編碼氨基酸序列SER的DNA分子的轉(zhuǎn)座載體;及將轉(zhuǎn)座載體導(dǎo)入到家蠶 蠶卵中。
[0041] 在又一具體實施方案中，采取如下的步驟將編碼氨基酸序列S邸的DNA分子整合到 家蠶染色體上：
[0042] 1、構(gòu)建轉(zhuǎn)座載體
[0043] 在SER3蛋白編碼核酸序列的上游5'端連接家蠶Fib-H基因啟動子和家蠶Fib-H基 因5'端信號膚編碼序列，在SER3蛋白編碼核酸序列的下游3'端連接家蠶Fib-H基因的3'端 序列得到重組基因 Ser。將帶有眼部和神經(jīng)特異性啟動子SV40及紅色巧光蛋白化Red元件的 piggyBac-3xP3-DsRed質(zhì)粒(序列如SEQ ID ^:6所示）與人工合成的5日1'序列分別進行43(：1 和Fsel雙酶切。將酶切后的piggybac-3xP3-DsRed質(zhì)粒和Ser序列連接，組成轉(zhuǎn)座載體PB- Ser。重組基因 Ser和轉(zhuǎn)座載體PB-Ser結(jié)構(gòu)示意圖見圖1和圖2。
[0044] 2、獲得轉(zhuǎn)基因的家蠶
[0045] (1)無菌和無核酸污染的環(huán)境中，采用顯微注射方法向每粒蠶卵注入4000ng- 5000ng的轉(zhuǎn)座載體質(zhì)粒；
[0046] (2)注射后的蠶卵用無毒材料封涂注射孔，然后在無菌環(huán)境，用26°C-27°C、75%- 80%相對濕度、自然光照保護蠶卵至解化，解化后幼蟲繼續(xù)在相同溫度、濕度和光照環(huán)境中 用桑葉或人工飼料飼養(yǎng)，結(jié)雖后幼蟲繼續(xù)用相同溫、濕度和光照環(huán)境保護至成蟲羽化；
[0047] (3)羽化后蠶蛾自交或回交后，所產(chǎn)卵解化后幼蟲用桑葉或人工飼料飼養(yǎng)，幼蟲3- 5齡期、蛹期或成蟲期巧光顯微鏡下調(diào)查，眼部呈現(xiàn)紅色巧光的個體，作為轉(zhuǎn)基因 G1代個體； [004引（4)選擇轉(zhuǎn)基因 G1代個體胚胎、幼蟲、蛹或成蟲的眼部呈現(xiàn)紅色巧光的個體繼代， 至G6代后即獲得穩(wěn)定遺傳的后部絲腺高效合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶。
[0049] 本發(fā)明還提供了一種G1代后鑒定后部絲腺高效合成和分泌親水性絲膠蛋白的轉(zhuǎn) 基因家蠶的方法，在巧光顯微鏡下觀察，所結(jié)蠶雖的雖絲呈現(xiàn)綠色巧光的幼蟲個體為后部 絲腺高效合成和分泌親水性絲膠蛋白的轉(zhuǎn)Serf基因家蠶。
[0050] 本發(fā)明還提供了一種具有編碼SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的DNA分子的轉(zhuǎn)座載 體。
[0051 ]在一些實施方案中，轉(zhuǎn)座載體為PB-Ser，包含piggyBac轉(zhuǎn)座酶識別序列piggyBac 3'LTR和piggyBac 5'LTR、眼部及神經(jīng)特異啟動子3xP3、EGFP報告基因、SV40的多聚腺巧酸 加尾序列、重組基因 Ser。其中piggyBac轉(zhuǎn)座酶識別序列分別位于轉(zhuǎn)座載體上的piggyBac 3'LTR的左端和piggyBac 5'LTR的右端上的TTAA位點；piggyBac轉(zhuǎn)座酶識別序列piggyBac 3'LTR與piggyBac5'LTR之間依次為人工啟動子3XP3、EGFP報告基因、SV40的多聚腺巧酸加 尾序列和重組基因 Ser。
[0052] 在一些優(yōu)選實施方案中，轉(zhuǎn)座載體具有如SEQ ID N0:5所示核巧酸序列。
[0053] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明的方法制備得到的穩(wěn)定遺傳的后部絲腺高效合成和分泌 親水性絲膠蛋白SER3的家蠶。
[0054] 本發(fā)明所提供的后部絲腺高效合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶，在5齡幼蟲期 后部絲腺細胞和后部絲腺腺腔分泌蛋白質(zhì)中能夠檢測到親水性絲膠蛋白質(zhì)SER3成份。在一 些優(yōu)選實施方案中，成熟幼蟲后部絲腺腺腔中累積的分泌絲蛋白質(zhì)中絲膠蛋白質(zhì)SER3含量 大于5%，在吐出的絲蛋白質(zhì)中絲膠蛋白質(zhì)SER3含量大于10%。
[0055] 為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的方法進行詳細說明。 [0化6] 實施例1
[0化7] 制備重組基因 Ser的轉(zhuǎn)座載體
[005引在絲膠蛋白質(zhì)SER3編碼核巧酸序列Serf的上游連接家蠶Fib-H基因的啟動子和5' 端信號膚編碼序列，下游連接家蠶Fib-H基因的3'端序列得到重組基因 Ser，其核巧酸序列 如沈Q ID NO:4所示。
[0059] 將含有3個串聯(lián)的家蠶眼和神經(jīng)系統(tǒng)特異性轉(zhuǎn)錄因子PAX-6結(jié)合序列組成的人工 啟動子3 X P3的PiggyBac-3 X P3-DsRed質(zhì)粒(序列如沈Q ID NO: 6所示）與人工合成的Ser序 列分別進行AscI和Fsel雙酶切。將酶切后的piggyBac-3XP3-DsRed質(zhì)粒和Ser序列用T4連 接酶16Γ過夜反應(yīng)。然后將產(chǎn)物進行電泳檢測，并將酶切的Ser條帶進行純化回收和測序。 鑒定序列正確的即為轉(zhuǎn)座載體PB-Ser，其核巧酸序列如SEQ ID N0:5所示的。
[0060] 具體示意圖如圖1-圖2所示。圖1為重組基因 Ser，圖2為重組基因 Ser的轉(zhuǎn)座載體。
[0061] 實施例2
[0062] 制備后部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶
[0063] 根據(jù)通用的家蠶轉(zhuǎn)基因操作及轉(zhuǎn)基因蠶獲得步驟，將重組基因 Ser序列整合到家 蠶Μ品種的基因組，得到Ser家蠶的具體步驟為：
[0064] (1)無菌和無核酸污染的環(huán)境中，采用顯微注射方法向每粒蠶卵注入4000ng- 5000ng的轉(zhuǎn)座載體質(zhì)粒；
[0065] (2)注射后的蠶卵用無毒材料封涂注射孔，然后在無菌環(huán)境，用26°C-27°C、75%- 80%相對濕度、自然光照保護蠶卵至解化，解化后幼蟲繼續(xù)在相同溫度、濕度和光照環(huán)境中 用桑葉或人工飼料飼養(yǎng)，結(jié)雖后幼蟲繼續(xù)用相同溫、濕度和光照環(huán)境保護至成蟲羽化；
[0066] (3)羽化后蠶蛾自交或回交后，所產(chǎn)卵解化后幼蟲用桑葉或人工飼料飼養(yǎng)，蛹期巧 光顯微鏡下調(diào)查，眼部呈現(xiàn)紅色巧光的個體，為轉(zhuǎn)基因 G1代個體；
[0067] (4)選擇轉(zhuǎn)基因 G1代個體蛹的眼部呈現(xiàn)紅色巧光的個體繼代，至G6代后即獲得穩(wěn) 定遺傳的后部絲腺高效合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶。
[0068] 對G1至G6代獲得的轉(zhuǎn)基因突變體Ser家蠶觀察，結(jié)果如圖3所示。其中圖A為突變體 家蠶后部絲腺橫切面形態(tài)圖，外圈組織中的綠色巧光來自后部絲腺細胞合成的重組蛋白 S邸中的EGFP，內(nèi)部的綠色巧光圖示后部絲腺細胞合成后分泌到腺腔中的重組蛋白SER;圖B 為突變體家蠶中部絲腺橫切面形態(tài)圖，綠色巧光圖示從后部絲腺細胞轉(zhuǎn)移到中部絲腺腺腔 的重組蛋白SER;圖C為突變體家蠶吐出的絲蛋白質(zhì)纖維，綠色巧光圖示存在于絲素纖維內(nèi) 部和表面的重組蛋白SER;圖D圖示野生型和突變體家蠶所結(jié)蠶雖的巧光差異，突變體的蠶 雖絲蛋白中具有發(fā)綠色巧光的重組蛋白SER，而野生型雖絲沒有sm?的特征性綠色巧光；圖E 圖示圖D中對應(yīng)的野生型和突變體家蠶所結(jié)蠶雖的可見光圖像；圖F圖示野生型和突變體家 蠶5齡幼蟲眼部的巧光差異，突變體家蠶的幼蟲的眼部呈現(xiàn)紅光巧光，野生型家蠶的眼部不 呈紅光巧光，圖中箭頭所指為幼蟲的眼部位置。
[0069] 由圖3結(jié)果可見，突變體Ser家蠶的幼蟲的眼部呈現(xiàn)紅光巧光，野生型家蠶的眼部 不呈紅光巧光;Ser家蠶的雖絲呈現(xiàn)綠色巧光，野生型家蠶的雖絲不呈綠光巧光;Ser家蠶的 5齡幼蟲后部絲腺腺腔有重組蛋白sm?的綠色巧光存在，野生型家蠶的后部絲腺腺腔沒有重 組蛋白sm?的綠色巧光存在。
[0070] G6代Ser家蠶5齡搖擺期幼蟲后部絲腺腺腔中累積的分泌絲蛋白質(zhì)中絲膠蛋白質(zhì) 沈R3含量4.9%-5.5%，在吐出的絲蛋白質(zhì)中絲膠蛋白質(zhì)沈R3含量8.8%-10.6%。
[0071] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技 術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可W做出若干改進和 變型，運些改進和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。




















【主權(quán)項】
1. 一種后部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶的制備方法，其特征在于，包括 以下步驟： 將編碼氨基酸序列SER的DNA分子重組到家蠶染色體上，表達、翻譯得到所述后部絲腺 可合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶； 其中，所述編碼氨基酸序列SER的DNA分子的核苷酸序列5'端至3'端依次為家蠶絲素重 鏈蛋白Fib-H基因啟動子、家蠶Fib-H基因5'端信號肽編碼序列、家蠶絲膠蛋白質(zhì)SER3編碼 序列Ser3和家蠶Fib-H基因3'端序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的后部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶的制備方法， 其特征在于:所述氨基酸序列SER具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的后部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶的制備方法， 其特征在于:編碼SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的DNA分子具有SEQ ID NO:4所示的核苷 酸序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的后部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶的制備方法， 其特征在于，將編碼氨基酸序列SER的DNA分子重組到家蠶染色體上進一步包括以下步驟： 構(gòu)建包含編碼氨基酸序列SER的DNA分子的轉(zhuǎn)座載體;及將所述轉(zhuǎn)座載體導(dǎo)入到家蠶蠶 卵中。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的后部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶的制備方法， 其特征在于:所述轉(zhuǎn)座載體為piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建的重組基因 Ser3轉(zhuǎn)座載體PB-ser。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的后部絲腺可合成和分泌親水性絲膠蛋白的家蠶的制備方 法，其特征在于:所述轉(zhuǎn)座載體具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列。7. -種具有編碼SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的DNA分子的轉(zhuǎn)座載體。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)座載體，其特征在于:所述轉(zhuǎn)座載體為piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建 的重組基因 Ser 3轉(zhuǎn)座載體PB-s er。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的轉(zhuǎn)座載體，其特征在于:所述轉(zhuǎn)座載體具有SEQ ID NO:5所 示核苷酸序列。
【文檔編號】C12N15/85GK106011172SQ201610348866
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】徐世清, 王玉軍, 陳學(xué)冬, 王永鋒, 李秋穎, 陶卉, 邢瑞, 司馬楊虎, 陳息林, 殷為民
【申請人】蘇州大學(xué)