抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的重組ε蛋白及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的重組ε蛋白及其制備方法與應(yīng)用。該重組ε蛋白為a)或b)或c)：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)由SEQ ID No.2第51?370位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；c)在a)或b)所示的蛋白質(zhì)的羧基端或/和氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白。該重組ε蛋白免疫動(dòng)物后可使動(dòng)物產(chǎn)生較高的血清抗體水平，并且可抵抗產(chǎn)氣莢膜梭菌的攻擊。該重組ε蛋白可溶性好，純化簡(jiǎn)易，可作為診斷抗原、制備成單克隆抗體或進(jìn)一步對(duì)蛋白功能與構(gòu)象關(guān)系進(jìn)行研究。
【專利說(shuō)明】
抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的重組ε蛋白及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的重組ε蛋白及其制備方法與 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium Perfringens)也稱魏氏梭菌，是一種重要的人畜共 患病，該病原是創(chuàng)傷性氣性壞疽和人類食物中毒以及羊快疫、羔羊痢疾、牛羊壞死性腸炎、 牛羊腸毒血癥的主要病原之一，對(duì)畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。產(chǎn)氣莢膜梭菌主要的致 病因素是其分泌的外毒素，種類多達(dá)13種，其中α、β和ε是最主要的外毒素，根據(jù)產(chǎn)生外毒素 的種類不同，可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D、E這五個(gè)血清型。ε毒素僅見(jiàn)于Β型和D型產(chǎn)氣 莢膜梭菌中，是牛羊產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病的主要致病因子。產(chǎn)氣莢膜梭菌的ε毒素導(dǎo)致動(dòng)物傳 染病的防控是當(dāng)前困擾動(dòng)物疫病防控工作著的主要難題之一。傳統(tǒng)疫苗在治療和預(yù)防動(dòng)物 產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病方面雖然取得了一定的效果。但是，這些疫苗在使用過(guò)程中仍然暴露了 一些缺陷，例如傳統(tǒng)疫苗免疫易引起動(dòng)物局部炎癥以及毒性反應(yīng)等。研發(fā)能表達(dá)ε外毒素抗 原蛋白，并且不破壞ε外毒素抗原蛋白的免疫原性，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌ε外毒素引起的疫病起 到防控作用的基因工程疫苗是急需解決的技術(shù)難題。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌主要外毒素蛋白的表達(dá)與純化方法相對(duì)復(fù)雜，表達(dá)產(chǎn) 物通常以不溶性的包涵體形式存在，可溶性蛋白表達(dá)的報(bào)道在國(guó)內(nèi)外非常少。因?yàn)榘w 中的表達(dá)產(chǎn)物不具有生物學(xué)活性，因而需要進(jìn)行變性與復(fù)性處理。蛋白的變性與復(fù)性是一 個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，不同蛋白的復(fù)性條件各異，復(fù)性率往往很難提高。這是限制其應(yīng)用的主 要制約因素。采用可溶性表達(dá)方式可很好的克服這一問(wèn)題。如何構(gòu)建可溶性表達(dá)載體并且 優(yōu)化可溶性蛋白的高效表達(dá)方法，是本領(lǐng)域長(zhǎng)期以來(lái)一直研究的熱點(diǎn)課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是如何獲得抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的可溶性蛋 白質(zhì)疫苗。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了制備重組ε蛋白的方法。
[0006] 本發(fā)明所提供的制備重組ε蛋白的方法，包括使重組ε蛋白的編碼基因在生物中進(jìn) 行表達(dá)得到所述重組ε蛋白的步驟;所述生物為微生物、植物或非人動(dòng)物；
[0007] 所述重組ε蛋白為a)或b)或c)或d):
[0008] a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0009] b)由SEQ ID No.2第51-370位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0010] C)在a)或b)所示的蛋白質(zhì)的羧基端或/和氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白； [0011] d)將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加得到的可溶性蛋白質(zhì)。
[0012] 上述方法中，a)的蛋白質(zhì)名稱為ε-his，b)的蛋白質(zhì)名稱為ε-Y。SEQIDNo.2由353 個(gè)氨基酸殘基組成。
[0013] 上述方法中，蛋白標(biāo)簽是指利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一 種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和/或純化等。
[0014] 上述方法中，所述使重組ε蛋白的編碼基因在生物中進(jìn)行表達(dá)包括所述重組ε蛋白 的編碼基因?qū)胧荏w微生物，得到表達(dá)所述重組ε蛋白的重組微生物，培養(yǎng)所述重組微生 物，表達(dá)得到所述重組ε蛋白。
[0015] 上述方法中，所述受體微生物可為C1)_C4)中的任一種：
[0016] C1)原核微生物；
[0017] C2)革蘭氏陰性細(xì)菌；
[0018] C3)埃希氏菌屬細(xì)菌；
[0019] C4)大腸桿菌 BL21(DE3)〇
[0020] 上述方法中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)或4)所示的基因：
[0021] 1)編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子；
[0022] 2)編碼序列是SEQ ID No.l的第151-1113位所示的DNA分子；
[0023] 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述重組ε蛋白。
[0024] 其中，SEQ ID No.l由1068個(gè)核苷酸組成，其名稱為ε-hisY基因，編碼氨基酸序列 是SEQIDNo.2的蛋白質(zhì)ε-his。SEQIDNo.l的第151-1113位所示的DNA分子是ε-Y基因，編 碼由SEQ ID No.2第51-370位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)ε-Υ。
[0025]上述方法中，所述重組微生物為將pET30a-e_Y導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)得到的表 達(dá)氨基酸序列是SEQ ID No.2的重組ε蛋白的重組微生物，所述重組微生物命名為BL21 (DE3) /pET30a_ ε -Υ，所述pET30a_e -Υ為將載體pET30a (+)的BamHI和Xho I位點(diǎn)之間的序列替 換為SEQ ID No.l第151-1113位所示的DNA片段得到的重組載體。
[0026] 上述方法中，所述表達(dá)為誘導(dǎo)表達(dá)，所述誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo) 13-16小時(shí)或13-24小時(shí)或13小時(shí)或16小時(shí)。
[0027]下述任一種產(chǎn)品也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0028] P1)重組ε蛋白，所述重組ε蛋白為a)或b)或c)或d):
[0029] a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0030] b)由SEQ ID No.2第51-370位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0031] c)在a)或b)所示的蛋白質(zhì)的羧基端或/和氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白；
[0032] d)將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加得到的可溶性蛋白質(zhì)；
[0033] P2)與所述重組ε蛋白相關(guān)的生物材料，所述生物材料為下述B1)至B16)中的任一 種：
[0034] Β1)編碼所述重組ε蛋白的核酸分子；
[0035] Β2)含有Β1)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0036] Β3)含有Β1)所述核酸分子的重組載體；
[0037] Β4)含有Β2)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0038] Β5)含有Β1)所述核酸分子的重組微生物；
[0039] Β6)含有Β2)所述表達(dá)盒的重組微生物；
[0040] B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0041 ] B8)含有M)所述重組載體的重組微生物；
[0042] B9)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系；
[0043] B10)含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系；
[0044] B11)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系；
[0045] B12)含有M)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系；
[0046] B13)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0047] B14)含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0048] B15)含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0049] B16)含有M)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0050] P3)預(yù)防動(dòng)物產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的疫苗，其含有所述重組ε蛋白或所述生物材料。 [0051 ] 上述產(chǎn)品中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分 子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0052] 這里使用的術(shù)語(yǔ)"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或 計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比（％ ) 表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。
[0053] 上述產(chǎn)品中，所述重組ε蛋白按照上述任一種方法制備；
[0054]所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：
[0055] 1)編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子；
[0056] 2)編碼序列是SEQ ID No.l的第151-1113位所示的DNA分子；
[0057] 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0058] 所述重組載體為所述pET30a-e-Y;
[0059] 所述重組微生物為El)或E2):
[0060] E1)所述重組微生物為將所述重組ε蛋白的編碼基因?qū)胧荏w微生物，得到表達(dá)所 述重組ε蛋白的重組微生物，所述受體微生物為Cl )_C4)中的任一種：
[0061 ] C1)原核微生物；
[0062] C2)革蘭氏陰性細(xì)菌；
[0063] C3)埃希氏菌屬細(xì)菌；
[0064] C4)大腸桿菌 BL21(DE3);
[0065] 所述重組微生物為所述BL21(DE3)/pET30a-e-Y;
[0066] 所述預(yù)防動(dòng)物產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的疫苗的活性成分為所述重組ε蛋白或所述生物 材料。
[0067] 下述任一種應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0068] Υ1)所述重組ε蛋白在制備抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗中的應(yīng)用；
[0069] Υ2)所述生物材料在制備抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗中的應(yīng)用；
[0070] Υ3)所述方法在制備抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗中的應(yīng)用；
[0071] Υ4)所述重組ε蛋白在制備產(chǎn)氣莢膜梭菌病診斷抗原中的應(yīng)用；
[0072] Υ5)所述重組ε蛋白在制備單克隆抗體中的應(yīng)用。
[0073] 本發(fā)明中，所述產(chǎn)氣莢膜梭菌可為A、B、C、D和Ε這5種型產(chǎn)氣莢膜梭菌中的任5種、 任4種、任3種、任2種或任1種。
[0074] 本發(fā)明中，所述抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗具體可為上述預(yù)防動(dòng)物產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的 疫苗。
[0075] 在實(shí)際應(yīng)用中，可以將本發(fā)明的重組ε蛋白或其相關(guān)生物材料作為藥物直接給予 病人、或者與適宜的載體或賦形劑混合后給予病人，以達(dá)到治療產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的目的。 這里的載體材料包括但不限于水溶性載體材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有機(jī)酸等）、 難溶性載體材料(如乙基纖維素、膽固醇硬脂酸酯等）、腸溶性載體材料(如醋酸纖維素酞酸 酯和羧甲乙纖維素等）。其中優(yōu)選的是水溶性載體材料。使用這些材料可以制成多種劑型， 包括但不限于片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質(zhì)體、 透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等?？梢允瞧胀ㄖ苿?、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給 藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的 例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、 尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等;濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙 醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫 膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐 藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基 纖維素、乙基纖維素等;崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等;吸收促 進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸 鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包 衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將單位給藥劑型制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng) 域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可 月旨、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等;粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍 膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷 基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將單位給藥劑型制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng) 域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的 酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將單位給藥劑型制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉 針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3_丙二醇、 乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等 滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī) 的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香 料、矯味劑、甜味劑或其它材料。使用上述劑型可以經(jīng)注射給藥，包括皮下注射、靜脈注射、 肌肉注射和腔內(nèi)注射等;腔道給藥，如經(jīng)直腸和陰道;呼吸道給藥，如經(jīng)鼻腔;粘膜給藥。上 述給藥途徑優(yōu)選的是注射給藥。
[0076] 本發(fā)明將SEQ ID No.l的第151-1113位所示的DNA分子插入pET30a( + )的BamHI和 Xhol位點(diǎn)，得到表達(dá)SEQ ID No.2的重組蛋白ε-his的重組表達(dá)載體pET30a-ε-Y。將重組表 達(dá)載體pET30a_e -Y導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)獲得了可溶性的目的蛋白ε -hi s。本發(fā)明優(yōu)化了 e-hise-his的表達(dá)條件，進(jìn)一步提高了 ε-his的表達(dá)量，用0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13-24 小時(shí)，ε-his的含量達(dá)到菌體總蛋白的91%，表達(dá)的目的ε-his 99.4%可溶?！阓114免疫動(dòng)物 后可使動(dòng)物產(chǎn)生較高的血清抗體水平，并且可抵抗產(chǎn)氣莢膜梭菌的攻擊。ε-his在抵抗A型 產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí)的免疫保護(hù)率為90 % (18只存活，2只死亡），PBS對(duì)照組小鼠全部死亡； ε-his在抵抗B型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí)的免疫保護(hù)率為95%(19只存活，1只死亡），？85對(duì)照 組小鼠全部死亡；ε-his在抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí)的免疫保護(hù)率為80% (16只存活，4 只死亡），PBS對(duì)照組小鼠全部死亡；ε-his在抵抗D型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí)的免疫保護(hù)率為 95% (19只存活，1只死亡），PBS對(duì)照組小鼠全部死亡。第三次免疫ε-his后7-14天抗體效價(jià) 達(dá)到峰值，最高抗體效價(jià)達(dá)1:128000。ε-his可溶性好，純化簡(jiǎn)易，可作為診斷抗原、制備成 單克隆抗體或進(jìn)一步對(duì)蛋白功能與構(gòu)象關(guān)系進(jìn)行研究。
【附圖說(shuō)明】
[0077]圖1為各菌株表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜。
[0078] 圖中，Μ為Marker，從上到下分別為從上到下分別為130kD、95kD、70kD、62kD、51kD、 40kD、29kD，1、誘導(dǎo)表達(dá)的受體菌全菌蛋白液體，2、未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3 )/pET30a-e-Y全 菌蛋白液體，3、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e-Y全菌蛋白液體，4、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-e-Y含蛋白上清液，5、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e-Y含蛋白沉淀，6、未 誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e-W全菌蛋白液體，7、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e-W全 菌蛋白液體，8、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e-W含蛋白上清液，9、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-e-W含蛋白沉淀，10、未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-pme-W全菌蛋白液體， 11、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-pmε-W全菌蛋白液體，12、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/ pET30a-pme -W含蛋白上清液，13、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3) /pET30a-pme -W含蛋白沉淀。
[0079] 圖 2 為Western-blot 圖譜。
[0080] 圖中Μ是Marker，1、誘導(dǎo)表達(dá)的受體菌全菌蛋白液體，2、未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/ pET30a-e-Y全菌蛋白液體，3、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e-Y全菌蛋白液體，4、誘導(dǎo)表 達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e-Y含蛋白上清液，5、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e-Y含蛋白沉 淀，6、未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e-W全菌蛋白液體，7、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/ pET30a-e_W全菌蛋白液體，8、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e_W含蛋白上清液，9、誘導(dǎo)表 達(dá)的 BL21(DE3)/pET30a-e-W 含蛋白沉淀，10、未誘導(dǎo)表達(dá)的 BL21(DE3)/pET30a-pme-W 全菌 蛋白液體，11、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-pme-W全菌蛋白液體，12、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-pme-W含蛋白上清液，13、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-pme-W含蛋白沉淀。
[0081] 圖3為重組蛋白ε-his的AKTA純化鑒定。箭頭所指的為純化的目的蛋白峰。
[0082] 圖4為重組蛋白ε-his的分子篩純化鑒定。箭頭所指的為純化的目的蛋白峰。
[0083] 圖5為純化的目的蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜。箭頭示目的條帶。
[0084] 其中Μ是Marker，從上到下分別為從上到下分別為130kD、95kD、70kD、62kD、51kD、 40kD、29kD;l是誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-ε-Y全菌蛋白液體 ；2是誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-e_Y含蛋白上清液;3是分子篩純化的ε-his蛋白；4是誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/ pET30a-e_Y含蛋白沉淀;5是是未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-a-Y全菌蛋白液體。
【具體實(shí)施方式】
[0085] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為 常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0086] pET30a( + )為 Novagen 公司產(chǎn)品。pET28a( + )為 Novagen 公司產(chǎn)品。
[0087] A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C57_10、B型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C58_5、C型產(chǎn)氣莢膜梭 菌強(qiáng)毒株C59-4、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C60-11均為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品。
[0088] 實(shí)施例1、可溶性表達(dá)ε-hisY
[0089] 1、合成基因
[0090] 本申請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)了3種重組ε基因，分別為SEQ ID No. 1所示的ε-hisY基因 、SEQ ID No·3所示的ε-hisW基因、SEQIDNo·4所示的pmε-hisW基因。
[0091] ε-hisY基因和ε-hisW基因均編碼SEQ ID如.2所示的蛋白質(zhì)￡-11丨8(^111￡-11丨81基因 編碼SEQ ID No. 5所示的蛋白質(zhì)pme-hisW^-his是將ρπιε-hisW的第52-59位氨基酸殘基缺 失得到的蛋白質(zhì)。
[0092]用化學(xué)合成的方法合成出SEQ ID No. 1的第151-1113位所示的ε-Υ基因（編碼SEQ ID No.2的第51-370位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)），SEQ ID No.3的第151-1113位所示的ε-W 基因（編碼SEQ ID No.2的第51-370位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)），SEQ ID No.4的第151-1137位所示pme-W基因（編碼SEQ ID No.5的第51-378位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)pme-W)。
[0093] 2、重組表達(dá)載體和重組菌的構(gòu)建
[0094] 以ε - Y基因作為模板，利用上游引物F 1 (序列為'-ggatcc atggcgattgcgagcgcggttattag-3'）和下游弓丨物 Rl(序列為5'-CTCGAGTCATTTGATGCCCGGTGCTTTGA-3 '）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在ε-Υ基因的兩端加上BamHI位點(diǎn)（帶 下劃線的序列）和Xhol識(shí)別位點(diǎn)（帶下劃線的序列），得到SEQ ID No. 1的第145-1119位所示 的￡-￥基因 PCR產(chǎn)物。
[0095] 以ε - W基因作為模板，利用上游引物F 1和下游引物R 2 (序列為5 ' -CTCGAGTCATTTGATACCCGGCGCTTTGA-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在ε-W基因的兩端加上BamHI和Xhol識(shí) 別位點(diǎn)，得到SEQ ID No. 3的第145-1119位所示的ε-W基因 PCR產(chǎn)物。
[0096] 以p m ε - W基因作為模板，利用上游引物F 3 (序列為5'_ ggatccatgaaaaagaacctggtcaaaagcct-3 '）和下游引物R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在ρπιε-W基因的兩端 加上BamHI和Xhol識(shí)別位點(diǎn)，得到SEQ ID No.4的第145-1143位所示的ρπιε-W基因 PCR產(chǎn)物。 [0097] 將上述ε-Υ基因 PCR產(chǎn)物用BamHI和Xhol酶切，回收目的片段（ε-Υ基因）；同時(shí)用 BamHI和Xhol酶切載體pET30a( + )，回收載體大片段;將回收的目的片段與回收的載體大片 段連接，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將其均勾涂布于 含卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。單菌落振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒用BamHI和Xhol 進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果表明是用SEQ ID No. 1的第 151 -1113位所示的ε -Y基因替換pET30a (+)的BamHI和Xho I識(shí)別位點(diǎn)間的片段，保持pET30 (+ )的其它序列不變得到的重組表達(dá)載體，命名為pETSOa-e-Y^ETSOa-e-Y含有帶His標(biāo)簽 的ε-hisY基因，ε-hisY基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1，編碼SEQ ID No.2所示的蛋白質(zhì) ε-his。將含有pET30a-e-Y的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET30a-e-Y。
[0098] 將上述ε-W基因 PCR產(chǎn)物用BamHI和Xhol酶切，回收目的片段（ε-W基因）；同時(shí)用 BamHI和Xhol酶切載體pET30a( + )，回收載體大片段;將回收的目的片段與回收的載體大片 段連接，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將其均勾涂布于 含卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。單菌落振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒用BamHI和Xhol 進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果表明是用SEQ ID No.3的第 151 -1113位所示的ε -W基因替換pET30a (+)的BamHI和Xho I識(shí)別位點(diǎn)間的片段，保持pET30 (+ )的其它序列不變得到的重組表達(dá)載體，命名為pETSOa-e-W^ETSOa-e-W含有His標(biāo)簽融 合蛋白ε-hisW基因，ε-hisW基因的核苷酸序列是SEQIDNo.3，編碼SEQIDNo.2所示的蛋 白質(zhì)ε-his。將含有pET30a-e-W的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET30a-e-W。
[0099] 將上述ρπιε-W基因 PCR產(chǎn)物用BamHI和Xho頂每切，回收目的片段(ρπιε-W基因）；同時(shí) 用BamHI和Xhol酶切載體pET30a( + )，回收載體大片段;將回收的目的片段與回收的載體大 片段連接，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將其均勻涂布 于含卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。單菌落振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒用BamHI和 Xhol進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果表明是用SEQ ID No.4 的第151-1137位所示的pme-W基因替換pET30a( + )的BamHI和Xhol識(shí)別位點(diǎn)間的片段，保持 pET30( + )的其它序列不變得到的重組表達(dá)載體，命名為pETSOa-pme-WdETSOa-pme-W含有 帶His標(biāo)簽的pmε-hisW基因，pmε-hisW基因的核苷酸序列是SEQIDNo.4，編碼SEQIDNo.5 所示的蛋白質(zhì)pme-hisW。將含有pET30a-pme-W的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET30a-pme-ff 0
[0100] 3、蛋白表達(dá)形式的分析與鑒定
[0101] 將BL21(DE3)/pET30a-e-Y、BL21(DE3)/pET30a-e-W、BL21(DE3)/pET30a_pme-W和 大腸桿菌BL21(DE3)(簡(jiǎn)稱受體菌)這四個(gè)菌株分別單獨(dú)接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液 體培養(yǎng)基（在LB液體培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基） 中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600值（以含50μg/ml卡那 霉素的LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，取出lmL菌液作為未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液(對(duì)照）， 其余液體中加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。上述四株菌的誘導(dǎo)表達(dá) 均是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時(shí)。
[0102] 取誘導(dǎo)表達(dá)的菌液和未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液用于蛋白表達(dá)形式分析。具體步驟為，取 lmL菌液置于1.5mL離心管中，做好標(biāo)記，4°C條件下8000rpm/min離心30min，棄掉上清液，收 集菌體沉淀。加入lmL PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體 沉淀中加入200yL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液體。將全菌蛋 白液體于4°C離心機(jī)中16000rpm/min離心30min，分別收集上清液(命名為含蛋白上清液)和 沉淀(命名為含蛋白沉淀），向含蛋白沉淀中加入50yL PBS重懸洗滌沉淀。向全菌蛋白液體、 含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入l〇yL 5 XSDS-PAGE loading Buffer，充分混勻后，置沸 水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分析，并且結(jié) 合蛋白灰度分析軟件初步分析蛋白含量。將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)印于NC膜，以抗His標(biāo)簽的羊抗 鼠抗體為結(jié)合抗體DAB顯色，進(jìn)行Western-blot鑒定。將上述全菌蛋白液體和含蛋白上清液 用0.22μπι濾膜過(guò)濾后上樣至預(yù)先用溶液1(溶質(zhì)及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶 劑是水，PH8.0的溶液)平衡好的鎳柱。將鎳柱接入AKTA機(jī)器上，分別用10個(gè)柱體積的溶液1 與10個(gè)柱體積的溶液2(溶質(zhì)及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑，溶劑是水， PH8.0的溶液)清洗鎳柱中的雜質(zhì)蛋白，并在AKTA機(jī)器上監(jiān)測(cè)蛋白峰。用溶液3(溶質(zhì)及其濃 度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶劑是水，pH8.0的溶液)沖洗鎳柱掛在鎳柱上 的目的蛋白，并使用AKTA收集出現(xiàn)目的蛋白峰的洗脫樣品，將該樣品稱為鎳柱純化目的蛋 白樣品。
[0103] 將鎳柱純化的目的蛋白樣品用GE公司生產(chǎn)的Superdex200凝膠柱通過(guò)分子篩進(jìn)一 步純化。流動(dòng)相使用溶液1。通過(guò)分子篩純化后可以除去樣品中的含有的大量咪唑，收集洗 脫峰，得到分子篩純化的目的蛋白樣品，使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(ND2000)對(duì) 得到的分子篩純化的目的蛋白樣品中蛋白（即可溶性目的蛋白）的含量進(jìn)行定量分析。并用 NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(ND2000)測(cè)定全菌蛋白液體中的蛋白質(zhì)含量，得到菌體總 蛋白含量。將含蛋白沉淀用尿素溶解后，用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(ND2000)測(cè)定 含蛋白沉淀中的蛋白質(zhì)的含量。結(jié)果表明誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e-Y的全菌蛋白液 體、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均含有大小為41kD的目的蛋白ε-his，未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-e_Y的全菌蛋白液體中不含有大小為41kD的目的蛋白ε-his;誘導(dǎo)表達(dá)的 BL21 (DE3)/pET30a_e-Y的全菌蛋白液體中目的蛋白ε-his占菌體總蛋白（全菌總蛋白）的 91%，誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e_Y的含蛋白上清液中的目的蛋白ε-his占誘導(dǎo)表達(dá) 的BL21 (DE3)/pET30a_e-Y的全菌蛋白液體中目的蛋白ε-his的99.4 %，該99.4%的目的蛋 白ε-his為可溶性蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e_Y的含蛋白沉淀中的目的蛋白ε-hi s占誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3) /pET30a_ε-Υ的全菌蛋白液體中目的蛋白ε-hi s的0.6 %，該 0.6%的目的蛋白ε-his為不溶性包涵體蛋白；說(shuō)明誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e-Y的目 的蛋白ε-his占菌體總蛋白的91%，BL21(DE3)/pET30a-ε-Y表達(dá)的目的蛋白ε-his中99.4% 為可溶性蛋白，0.6%的目的蛋白ε-his為不溶性包涵體蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/ pET30a-e_W的全菌蛋白液體、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均含有大小為41kD的目的蛋白 ε-his，未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e_W的全菌蛋白液體不含有大小為41kD的目的蛋 白ε -h i s;誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3) /pET30a_ε -W的全菌蛋白液體中目的蛋白ε -hi s占菌體總蛋 白的91 %，誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3) /pET30a_ε -W的含蛋白上清液中的目的蛋白ε-hi s占誘導(dǎo) 表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a_e-W的全菌蛋白液體中目的蛋白ε-hi s的0.5 %，該0.5 %的目的 蛋白ε-his為可溶性蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e_W的含蛋白沉淀中的目的蛋白 ε-his占誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-ε-W的全菌蛋白液體中目的蛋白ε-his的99.5%，該 99.5%的目的蛋白ε-his為不溶性包涵體蛋白；說(shuō)明誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-e_W的 目的蛋白ε-his占菌體總蛋白的91%，BL21(DE3)/pET30a-ε-W表達(dá)的目的蛋白 ε-hiS中 0.5%為可溶性蛋白，99.5%為不溶性包涵體蛋白。未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-pme-W 的全菌蛋白液體、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3 )/pET30a-pme-W的全菌蛋白液體、含蛋白上清液和 含蛋白沉淀中均不含有大小為43kD的目的蛋白ρπιε-his;說(shuō)明BL21(DE3)/pET30a-pme-W沒(méi) 有表達(dá)目的蛋白pme-his。誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌BL21(DE3)的全菌蛋白液體不含有大小為 4lkD的目的蛋白ε-his ;說(shuō)明大腸桿菌BL21 (DE3)沒(méi)有表達(dá)目的蛋白ε-his。菌落形成單位 (CFU)數(shù)量相同的誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e-Y和誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-e-W 表達(dá)的菌體總蛋白質(zhì)量相同（圖1和圖2)。
[0104] 4、e-his 的純化
[0105] 將BL21(DE3)/pET30a-e-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB液體 培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。該誘導(dǎo)表達(dá) 是用0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時(shí)。
[0106] 取IPTG誘導(dǎo)表達(dá)13h后的菌液收集菌體沉淀。加入roS重懸沉淀，8000rpm/min離心 5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠， 于4°C離心機(jī)中16000rpm/min離心30min，收集上清液(命名為含蛋白上清液），棄沉淀。將含 蛋白上清液用〇.22μπι濾膜過(guò)濾后上樣至預(yù)先用溶液1(溶質(zhì)及其濃度如下：20mM Tris、 150mM NaCl，溶劑是水，pH8.0的溶液)平衡好的鎳柱。將鎳柱接入AKTA機(jī)器上，分別用10個(gè) 柱體積的溶液1與10個(gè)柱體積的溶液2(溶質(zhì)及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪 唑，溶劑是水，PH8.0的溶液)清洗鎳柱中的雜質(zhì)蛋白，并在AKTA機(jī)器上監(jiān)測(cè)蛋白峰。用溶液3 (溶質(zhì)及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶劑是水，pH8.0的溶液)沖洗鎳 柱掛在鎳柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出現(xiàn)目的蛋白峰的洗脫樣品，將該樣品稱為鎳 柱純化的ε-his(圖3)。
[0107] 將鎳柱純化的ε-his用GE公司生產(chǎn)的Superdex200凝膠柱通過(guò)分子篩進(jìn)一步純化。 流動(dòng)相使用溶液1。通過(guò)分子篩純化后可以除去樣品中的含有的大量咪唑，收集洗脫峰，得 到分子篩純化的ε-his蛋白（分子篩純化目的蛋白樣品）（圖5)，使用Nan 〇Dr〇p2000超微量分 光光度計(jì)(ND2000)對(duì)得到的蛋白的純度進(jìn)行定量分析。
[0108] 將純化的ε-his進(jìn)行質(zhì)譜分析其氨基酸序列，結(jié)果表明ε-his的氨基酸序列如SEQ ID No .2所示。
[0109] 將 BL21(DE3)/pET30a-e-Y、BL21(DE3)/pET30a-pme-W 和大腸桿菌 BL21(DE3)(簡(jiǎn)稱 受體菌)這三個(gè)菌株分別單獨(dú)接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB液體培養(yǎng)基 中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0D 6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，取出lmL菌液作為未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液(對(duì)照），其余液體中加入異丙 基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。上述三株菌的誘導(dǎo)表達(dá)均是用0.75mM的IPTG 在16°C誘導(dǎo)13小時(shí)。
[0110]取誘導(dǎo)表達(dá)的菌液和未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液用于蛋白表達(dá)形式分析。具體步驟為，取 lmL菌液置于1.5mL離心管中，做好標(biāo)記，4°C條件下8000rpm/min離心30min，棄掉上清液，收 集菌體沉淀。加入lmL PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體 沉淀中加入200yL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液體。將全菌蛋 白液體于4°C離心機(jī)中16000rpm/min離心30min，分別收集上清液(命名為含蛋白上清液)和 沉淀(命名為含蛋白沉淀），向含蛋白沉淀中加入50yL PBS重懸洗滌沉淀。向全菌蛋白液體、 含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入l〇yL 5 XSDS-PAGE loading Buffer，充分混勻后，置沸 水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表 明BL21(DE3)/pET30a-e_Y表達(dá)的目的蛋白ε-his以可溶性的形式存在于細(xì)菌破碎菌體的上 清液中，可溶性蛋白目的條帶表達(dá)明顯，上清液中雜質(zhì)較少。通過(guò)對(duì)AKTA機(jī)器純化洗脫條件 的優(yōu)化，可以得到純度更好的可溶性目的蛋白條帶。進(jìn)一步通過(guò)分子篩的純化后，可以除去 蛋白樣品中的含有的大量咪唑（圖4)。通過(guò)分子篩的純化后的可溶性蛋白可以作為診斷抗 原、制備成單克隆抗體或進(jìn)一步對(duì)蛋白功能與構(gòu)象關(guān)系進(jìn)行研究。
[0111]另外，按照上述方法，將pET28a( + )的限制性內(nèi)切酶Nhel和Notl位點(diǎn)之間的序列替 換為SEQ ID No.l第151-1113位所示的ε-Υ基因，保持pET28a( + )的其它序列不變，得到含有 ε-Y基因的重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體命名為pET28a-e_Y。將pET28a-e_Y轉(zhuǎn)入大腸桿 菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將得到的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET28a-e-Y。將BL21 (DE3)/pET28apET28a-e-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB液體培養(yǎng)基中 加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000 型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6Q()值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì) 照)達(dá)到0.6時(shí)，取出lmL菌液作為未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液(對(duì)照），其余液體中加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。該誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時(shí)。取 誘導(dǎo)表達(dá)的菌液和未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液按照上述方法進(jìn)行蛋白表達(dá)形式分析。結(jié)果表明，未 誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET28a-e-Y全菌蛋白液體、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET28a-e-Y全菌 蛋白液體、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET28a-e-Y含蛋白上清液和誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/ pET28a-e-Y含蛋白沉淀中均沒(méi)有目的蛋白的表達(dá)?？梢?jiàn)，雖然采用同一種外源目的基因（ε-Υ基因），在不同的BL21(DE3)表達(dá)載體-pET28a( + )和pET30a( + )中，外源目的基因的表達(dá)情 況相差很大，將ε -Y基因通過(guò)pET30a (+)導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)可獲得ε -Y基因的高效可溶 性表達(dá)，將ε -Υ基因通過(guò)pET28a (+)導(dǎo)入大腸桿菌BL21 (DE3)中，ε -Υ基因卻沒(méi)有表達(dá)。
[0112]實(shí)施例2、ε -hi s的動(dòng)物免疫保護(hù)性試驗(yàn) [0113] 1、抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗的制備
[0114] 將實(shí)施例1中分子篩純化的ε-his蛋白用無(wú)菌roS溶解，得到ε-his濃度為lOOOyg/ mL的ε-his溶液，用于免疫。將ε-his溶液與弗氏佐劑按1:1等體積混合，乳化制備油乳劑疫 苗，將其命名為首免疫苗。將ε-his溶液與不完全弗氏佐劑按1:1等體積混合，乳化制備油乳 劑疫苗，將其命名為二免疫苗。
[0115] 取出從中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所購(gòu)買到的B型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C58-5和D型產(chǎn)氣莢 膜梭菌強(qiáng)毒株C60-11。在超凈工作臺(tái)中，用75%酒精棉球仔細(xì)擦拭保存菌種的安瓿瓶外壁， 然后用砂輪在安瓶的上三分之一處做一劃痕，再用干燥的無(wú)菌紗布包裹安瓶將其掰開(kāi)。吸 取400yL厭氧肉肝湯液體培養(yǎng)基反復(fù)吹打安瓶中的菌種，使凍干菌種溶解菌懸液。按照1: 100的比例將菌懸液接種到含有牛肉膏的厭氧肉肝湯的試管中，并在試管上層加蓋l-2cm的 液體石蠟隔絕空氣。將接好菌的試管放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，置37°C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16-24h 后，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。復(fù)蘇后的菌種經(jīng)過(guò)涂片、染色、鏡檢，確認(rèn)無(wú)誤后傳1-2代后使用， 并將一部分菌種用30%的甘油鹽水-80°C冰箱保存。
[0116] 2、B型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒試驗(yàn)
[0117] 按照如下方法測(cè)試ε-his對(duì)B型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C58-5的抗性試驗(yàn)：
[0118] 將30只體重在18-22g的雌性昆明小鼠，隨機(jī)分成2組(攻毒劑量組20只，并設(shè)10只 小鼠的PBS對(duì)照組）。攻毒劑量組，首次免疫、第二次免疫與第三次免疫均采用皮下注射的方 法進(jìn)行免疫，首次免疫用首免疫苗，第二次免疫與第三次免疫用二免疫苗，每次免疫劑量均 為0.2mL/只（ε-his免疫劑量為100yg/只）；PBS對(duì)照組中的每只小鼠首次免疫、第二次免疫 與第三次免疫，皮下注射〇.2mL PBS。首次免疫之前，先對(duì)小鼠進(jìn)行一次割尾采血，分離血 清，用作陰性對(duì)照血清。首次免疫后，間隔14d進(jìn)行第二次免疫，二免后14d進(jìn)行第三次免疫。 第三次免疫兩周后每只攻毒劑量組小鼠和每只PBS對(duì)照組小鼠腹腔注射2 X109cfu的B型產(chǎn) 氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C58-5進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。自一免后開(kāi)始，每組小鼠每周米血一次，每組米5 只，分離血清，于-80°C冰箱保存，用于檢測(cè)抗體。采用間接ELISA檢測(cè)免疫動(dòng)物抗體水平，具 體方法如下：
[0119] 1)包被:將實(shí)施例1中分子篩純化的ε-his用0.05mol/L pH 9.0的碳酸鹽包被緩沖 液進(jìn)行稀釋，然后按1 ΟΟμL孔逐一加入ELISA板中，將加好的ELISA板置4°C冰箱中過(guò)夜；
[0120] 2)洗滌:從4°C冰箱中取出ELISA板，棄去板孔內(nèi)的液體，并在濾紙上拍干，向每孔 加入200yL PBST置于洗板機(jī)中進(jìn)行洗版，重復(fù)4次。
[0121] 3)封閉：向ELISA板的每個(gè)孔中加入100yL含有5%脫脂乳的PBST溶液，放入37°C溫 箱孵育lh;
[0122] 4)洗滌：向每孔加入200yL PBST置于洗板機(jī)中進(jìn)行洗版，重復(fù)4次；
[0123] 5)加待檢血清:將待檢血清按比例用滅菌ros進(jìn)行稀釋，每孔加100yL，同時(shí)設(shè)陰性 對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照孔，放入37°C溫箱孵育lh;
[0124] 6)洗滌：向每孔加入200yL PBST置于洗板機(jī)中進(jìn)行洗版，重復(fù)4次；
[0125] 7)酶標(biāo)二抗結(jié)合:將HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗用含有5 %脫脂乳的PBS封閉緩沖液按 1:20 000-1:40000濃度稀釋后，分別向每孔加入100yL，放入37°C溫箱孵育lh;
[0126] 8)洗滌：向每孔加入200yL PBST置于洗板機(jī)中進(jìn)行洗板，重復(fù)4次；
[0127] 9)顯色反應(yīng):將新鮮配制的TMB顯色液按100μL孔加入到ELISA板的各個(gè)孔中，放 入37°C溫箱避光顯色15min;
[0128] 10)終止反應(yīng)：向按照50yL/孔加入2mol/L的濃H2S〇4終止液，放入37°C溫箱反應(yīng) 5min，終止顯色；
[0129 ] 11)讀數(shù):將終止顯色的ELI SA板放酶標(biāo)儀中檢測(cè)0D45Q的值。
[0130] 12)判定檢測(cè)結(jié)果：用確定好的陰陽(yáng)性臨界值來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果。陽(yáng)性臨界值=陰性 樣本的OD450平均值+3S(S為標(biāo)準(zhǔn)方差）。待檢血清的效價(jià)為待檢血清的0D值多陽(yáng)性臨界值時(shí) 所對(duì)應(yīng)的血清稀釋度。
[0131] 3、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒試驗(yàn)
[0132] 除了將B型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C58-5替換為D型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C60-11，攻 毒劑量調(diào)整為1.8 X 109cfu外，其它操作完全相同。
[0133] 攻毒劑量組和PBS對(duì)照組實(shí)驗(yàn)小鼠在三免二周后，分別使用各型產(chǎn)氣莢膜梭菌 1MLD 100的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒，并于一周內(nèi)觀察和記錄小鼠發(fā)病死亡情況。攻毒結(jié)果表 明，攻毒劑量組(免疫ε-his)對(duì)各型產(chǎn)氣莢膜梭菌的攻擊均具有一定的免疫保護(hù)效果。ε-his在抵抗Α型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí)的免疫保護(hù)率為90% (18只存活，2只死亡），roS對(duì)照組 小鼠全部死亡；ε-his在抵抗B型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí)的免疫保護(hù)率為95% (19只存活，1只 死亡），PBS對(duì)照組小鼠全部死亡；ε-his在抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí)的免疫保護(hù)率為 80% (16只存活，4只死亡），PBS對(duì)照組小鼠全部死亡；ε-his在抵抗D型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí) 的免疫保護(hù)率為95% (19只存活，1只死亡），PBS對(duì)照組小鼠全部死亡。將純化后的ε-his作 為診斷抗原包被酶標(biāo)板檢測(cè)檢測(cè)小鼠免疫抗原或者攻毒后的血清抗體，發(fā)現(xiàn)ε-his作為診 斷抗原建立的檢測(cè)方法均具有非常好的靈敏性與特異性。分別檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中小鼠初免后 0-6周的血清中抗體效價(jià)水平，結(jié)果表明ε-hi s融合毒素蛋白免疫組抗體效價(jià)有明顯升高， 在二免后抗體效價(jià)快速上升，三免后7-14天抗體效價(jià)達(dá)到峰值，最高抗體效價(jià)達(dá)1:128000。
[0134] 實(shí)施例3、ε-his誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
[0135] 1、誘導(dǎo)溫度和時(shí)間的優(yōu)化
[0136] 將BL21(DE3)/pET30a-e-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB液體 培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0D 6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)分別進(jìn)行下述6種誘導(dǎo)表 達(dá)。第一種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在37°C誘導(dǎo)1小時(shí)。第二種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的 IPTG在37°C誘導(dǎo)2小時(shí)。第三種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在37°C誘導(dǎo)4小時(shí)。第四種誘導(dǎo) 表達(dá)是用〇.75mM的IPTG在37°C誘導(dǎo)5小時(shí)。第五種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo) 13小時(shí)。第六種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)24小時(shí)。
[0137] 取lmL誘導(dǎo)后的重組菌液置于1.5mL離心管中，做好標(biāo)記，4°C條件下8000rpm/min 離心30min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入lmL PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄 掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200此PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得 到全菌蛋白液體。向全菌蛋白液體中加入1〇此5XSDS-PAGE loading Buffer，充分混勾 后，置沸水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分 析。結(jié)果表明BL21(DE3)/pET30a-e-Y在誘導(dǎo)溫度為37°C，誘導(dǎo)時(shí)間在l_4h的條件下，ε-his 蛋白表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升，5h誘導(dǎo)條件下蛋白表達(dá)量有所下降。但是隨著誘導(dǎo)溫度 的降低，ε-his表達(dá)量也有所增加，當(dāng)誘導(dǎo)溫度降低至16°C，時(shí)間為誘導(dǎo)13h時(shí)，ε-his表達(dá)量 達(dá)到最高，目的蛋白ε_(tái)hi s占全菌總蛋白的91 %。繼續(xù)培養(yǎng)至24h，ε-hi s的表達(dá)量略有下降， 因此，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BL21(DE3)/pET30a-e-Y的最佳誘導(dǎo)溫度為16°C，誘導(dǎo)時(shí)間為13-24h。
[0138] 2、IPTG濃度的優(yōu)化
[0139] 將BL21(DE3)/pET30a-e-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB液體 培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0D 6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)分別進(jìn)行下述6種誘導(dǎo)表 達(dá)。第一種誘導(dǎo)表達(dá)是用O.lmM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時(shí)。第二種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.3mM的 IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時(shí)。第三種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.5mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時(shí)。第四種誘導(dǎo) 表達(dá)是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時(shí)。第五種誘導(dǎo)表達(dá)是用ImM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13 小時(shí)。第六種誘導(dǎo)表達(dá)是用0mM的IPTG在16 °C誘導(dǎo)13小時(shí)。
[0140] 取lmL誘導(dǎo)后的重組菌液置于1.5mL離心管中，做好標(biāo)記，4°C條件下8000rpm/min 離心30min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入lmL PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄 掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200此PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得 到全菌蛋白液體。將全菌蛋白液體于4 °C離心機(jī)中16000rpm/min離心30min，收集上清液(命 名為含蛋白上清液），向含蛋白上清液中加入l〇yL 5 XSDS-PAGE loading Buffer，充分混 勻后，置沸水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分 析。結(jié)果表明ε-his在不同濃度的IPTG誘導(dǎo)下，表達(dá)量也有所不同。ε-his表達(dá)量與加入IPTG 濃度在〇. 1-0.75mM之間呈遞增關(guān)系。當(dāng)IPTG誘導(dǎo)濃度為ImM時(shí)，蛋白表達(dá)量有所減少，這可 能與IPTG本身的毒性有關(guān)。因此選擇IPTG濃度0.75mM為最佳誘導(dǎo)濃度。
[0141] 3、誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化
[0142] 將BL21(DE3)/pET30a-e-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB液體 培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)分別進(jìn)行下述2種誘導(dǎo)表 達(dá)。第一種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時(shí)。第二種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的 IPTG在16°C誘導(dǎo)16小時(shí)。
[0143] 取lmL誘導(dǎo)后的重組菌液置于1.5mL離心管中，做好標(biāo)記，4°C條件下8000rpm/min 離心30min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入lmL PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄 掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200此PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得 到全菌蛋白液體。
[0144] 向全菌蛋白液體中加入10yL 5 XSDS-PAGE loading Buffer，充分混勻后，置沸水 浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分析。
[0145] 結(jié)果表明BL21(DE3)/pET30a-e-Y在誘導(dǎo)溫度為16°C，誘導(dǎo)時(shí)間在13h與16h的條件 下，目的蛋白ε-his表達(dá)量變化不大，此時(shí)表達(dá)的蛋白幾乎均為可溶性蛋白，沉淀中的不溶 性包涵體蛋白幾乎沒(méi)有表達(dá)。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為16°C，誘導(dǎo)時(shí)間在13h與16h的條件下表達(dá)的可 溶性目的蛋白純度較高，表達(dá)量接近。因此，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，進(jìn)一步確定了重組菌的最佳誘 導(dǎo)溫度為16°C，誘導(dǎo)時(shí)間為13_16h。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 制備重組ε蛋白的方法，包括使重組ε蛋白的編碼基因在生物中進(jìn)行表達(dá)得到所述重 組ε蛋白的步驟;所述生物為微生物、植物或非人動(dòng)物； 所述重組ε蛋白為a)或b)或c)或d): a) 由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b) 由SEQ ID No.2第51-370位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； c) 在a)或b)所示的蛋白質(zhì)的羧基端或/和氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白； d) 將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加得到的可溶性蛋白質(zhì)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述使重組ε蛋白的編碼基因在生物中進(jìn) 行表達(dá)包括將所述重組ε蛋白的編碼基因?qū)胧荏w微生物，得到表達(dá)所述重組ε蛋白的重組 微生物，培養(yǎng)所述重組微生物，表達(dá)得到所述重組ε蛋白。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述受體微生物為Cl )_C4)中的任一種： C1)原核微生物； C2)革蘭氏陰性細(xì)菌； C3)埃希氏菌屬細(xì)菌； C4)大腸桿菌BL21(DE3)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述蛋白質(zhì)的編碼基因?yàn)槿缦?) 或2)或3)或4)所示的基因： 1) 編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子； 2) 編碼序列是SEQ ID No. 1的第151-1113位所示的DNA分子； 3) 與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述重組ε蛋白。5. 根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于:所述重組微生物為將pET30a-e-Y 導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)得到的表達(dá)氨基酸序列是SEQ ID No.2的重組ε蛋白的重組微生 物，所述重組微生物命名為BL21(DE3)/pET30a-e-Y，所述pET30a-e-Y為將載體pET30a( + )的 BamHI和Xhol位點(diǎn)之間的序列替換為SEQ ID No. 1第151-1113位所示的DNA片段得到的重組 載體。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述表達(dá)為誘導(dǎo)表達(dá)。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在16 °C誘 導(dǎo)13-16小時(shí)或13-24小時(shí)或13小時(shí)或16小時(shí)。8. 下述任一種產(chǎn)品： P1)重組ε蛋白，所述重組ε蛋白為a)或b)或c)或d): a) 由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b) 由SEQ ID No.2第51-370位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； c) 在a)或b)所示的蛋白質(zhì)的羧基端或/和氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白； d) 將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加得到的可溶性蛋白質(zhì)； P2)與所述重組ε蛋白相關(guān)的生物材料，所述生物材料為下述B1)至B16)中的任一種： Β1)編碼所述重組ε蛋白的核酸分子； Β2)含有Β1)所述核酸分子的表達(dá)盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體； B4)含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體； B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物； B6)含有B2)所述表達(dá)盒的重組微生物； B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物； B8)含有Μ)所述重組載體的重組微生物； Β9)含有Β1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系； Β10)含有Β2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系； Β11)含有Β3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系； Β12)含有Μ)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞系； Β13)含有Β1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； Β14)含有Β2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； Β15)含有Β3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； Β16)含有M)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； Ρ3)預(yù)防動(dòng)物產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的疫苗，其含有所述重組ε蛋白或所述生物材料。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述重組ε蛋白按照權(quán)利要求1-7中任一所 述的方法制備； 所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因： 1) 編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子； 2) 編碼序列是SEQ ID No. 1的第151-1113位所示的DNA分子； 3) 與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA 分子； 所述重組載體為權(quán)利要求5中所述pET30a-e_Y; 所述重組微生物為El)或E2): E1)所述重組微生物為將所述重組ε蛋白的編碼基因?qū)胧荏w微生物，得到表達(dá)所述重 組ε蛋白的重組微生物，所述受體微生物為Cl )_C4)中的任一種： C1)原核微生物； C2)革蘭氏陰性細(xì)菌； C3)埃希氏菌屬細(xì)菌； C4)大腸桿菌BL21(DE3); 所述重組微生物為將權(quán)利要求5中所述BL21 (DE3 )/pET30a-e-Y; 所述預(yù)防動(dòng)物產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的疫苗的活性成分為所述重組ε蛋白或所述生物材 料。10. 下述任一種應(yīng)用： Υ1)權(quán)利要求8或9中所述重組ε蛋白在制備抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗中的應(yīng)用； Υ2)權(quán)利要求8或9中所述生物材料在制備抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗中的應(yīng)用； Υ3)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法在制備抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗中的應(yīng)用； Υ4)權(quán)利要求8或9中所述重組ε蛋白在制備產(chǎn)氣莢膜梭菌病診斷抗原中的應(yīng)用； Υ5)權(quán)利要求8或9中所述重組ε蛋白在制備單克隆抗體中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/08GK106008682SQ201610301989
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月9日
【發(fā)明人】宋曉暉, 孫雨, 翟新驗(yàn), 趙柏林
【申請(qǐng)人】中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心