一種發(fā)酵制備d-泛解酸內(nèi)酯的方法
【專利摘要】一種發(fā)酵制備D?泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含：(1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌；(2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D?泛解酸；(3) 內(nèi)酯化步驟(2)的D?泛解酸，即得；其中，所述培養(yǎng)基為：甘油1?10%、蛋白胨0.2?2%、酵母膏0.2?2%、玉米漿0.5?5%、螺旋藻多糖0.05?0.2%、甘氨酸0.1?1%、其余為水。
【專利說(shuō)明】
一種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物化工領(lǐng)域，更具體的說(shuō)是涉及一種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 泛酸，又稱遍多酸、維生素 B5,廣泛存在于生物界中，是動(dòng)物體內(nèi)合成輔酶A的主要 原料，其主要作用是參與糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝。人體缺乏泛酸會(huì)引起肌肉酸痛或痙攣、 腎上腺機(jī)能不足和減退、注意力不集中、手腳麻木、便秘、精力缺乏、輕微鍛煉后即筋疲力 盡、憂慮、緊張以及磨牙等癥狀。泛酸以其特有的生化功能廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、飼料和食品等 領(lǐng)域。其活性成分為D-構(gòu)型的右旋泛酸，但因泛酸不穩(wěn)定，其工業(yè)應(yīng)用通常使用穩(wěn)定性好的 衍生物。目前比較有效、且廣為利用的泛酸系列產(chǎn)品是泛酸鈣、泛醇、泛硫乙胺等。
[0003] D-泛酸鈣是泛酸系列產(chǎn)品中產(chǎn)量最大的一種，也是泛酸最主要的商品形式，廣泛 應(yīng)用于飼料、醫(yī)藥、食品工業(yè)中。D-泛酸鈣作為輔酶A的組成物質(zhì)參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、糖和脂肪 的代謝，改善毛發(fā)色澤并預(yù)防疾病。特別是家禽家畜及魚科類動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、脂肪的合成 和分解，都不可缺少對(duì)泛酸鈣的需求。缺乏泛酸會(huì)導(dǎo)致家禽、家畜生長(zhǎng)遲緩，生殖機(jī)能發(fā)生 障礙，適應(yīng)性降低。
[0004] D-泛解酸內(nèi)酯(D-PL)，是合成D-泛酸系列產(chǎn)品重要的手型中間體。DL-泛解酸內(nèi)酯 的拆分方法大都是采用化學(xué)方法拆分，其缺點(diǎn)是拆分劑昂貴，成本高、分離困難。微生物酶 法拆分，即將合成的中間體DL-泛解酸內(nèi)酯或其類似物，用特異性酶拆分，得到D-PL，再進(jìn)一 步合成泛酸系列產(chǎn)品。該方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用，環(huán)境友好。盡管現(xiàn)在微生物酶法拆分DL-泛解酸內(nèi) 酯取得了一些成果，但是在實(shí)際應(yīng)用中仍舊有些問(wèn)題需要解決，比如發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酶速度 較慢、較少;酶在低pH值下不穩(wěn)定等問(wèn)題。
[0005] 針對(duì)這一問(wèn)題，本發(fā)明提供了 一種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油1-10%、蛋白胨〇. 2-2%、酵母膏0.2-2%、玉米漿0.5-5%、螺旋藻多糖 0 · 05-0 · 2%、甘氨酸0 · 1-1%、其余為水。
[0007] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述培養(yǎng)基為:甘油1.5%、蛋白胨0.8%、酵母膏1.1%、 玉米漿2.5%、螺旋藻多糖0.1%、甘氨酸0.8%、溶劑為水。
[0008] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述培養(yǎng)條件為pH 4-9,在20-40°C、100-300 rpm下 培養(yǎng)0.5-7天。
[0009] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述培養(yǎng)條件為pH 4-7,在26-29°C、100-300 rpm下 培養(yǎng)0.5-3天。
[0010] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述步驟(2)固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻 酸鈉并與水混合，水浴加熱并攪拌至完全溶化，然后靜置冷卻至室溫，得到聚乙烯醇-海藻 酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液中加入添加劑，再加入所述濕菌體，混合均 勻，得到菌體混合溶液;用注射器將菌體混合液滴加到交聯(lián)劑溶液中，浸泡1-3小時(shí)，取出， 用去離子水洗滌，即可。
[0011] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述聚乙烯醇的含量為1-10%，海藻酸鈉的含量為1-10%〇
[0012] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉一種 或幾種。
[0013] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和/或硝酸鈣和/或氯 化鋁的飽和硼酸溶液;所述濕菌體加入量為2-20%。
[0014] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，步驟(2)的水解條件為：用pH 6.0-9.0的Tris-HCl緩 沖液配制5-50%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加入微生物菌株和10-50mmol CaCl2。
[0015] 作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述步驟還包括，內(nèi)酯化D-泛解酸后經(jīng)提取得到D-泛解酸內(nèi)酯，其中內(nèi)酯化和提取條件為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水 相;水相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收， 得到D-泛解酸內(nèi)酯。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 參選以下本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方法的詳述以及包括的實(shí)施例可更容易地理解本發(fā) 明的內(nèi)容。除非另有限定，本文使用的所有技術(shù)以及科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通 技術(shù)人員通常理解的相同的含義。當(dāng)存在矛盾時(shí)，以本說(shuō)明書中的定義為準(zhǔn)。
[0017]如本文所用術(shù)語(yǔ)"由…制備"與"包含"同義。本文中所用的術(shù)語(yǔ)"包含"、"包括"、 "具有"、"含有"或其任何其它變形，意在覆蓋非排它性的包括。例如，包含所列要素的組合 物、步驟、方法、制品或裝置不必僅限于那些要素，而是可以包括未明確列出的其它要素或 此種組合物、步驟、方法、制品或裝置所固有的要素。
[0018] 連接詞"由…組成"排除任何未指出的要素、步驟或組分。如果用于權(quán)利要求中，此 短語(yǔ)將使權(quán)利要求為封閉式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但與其相關(guān)的常 規(guī)雜質(zhì)除外。當(dāng)短語(yǔ)"由…組成"出現(xiàn)在權(quán)利要求主體的子句中而不是緊接在主題之后時(shí)， 其僅限定在該子句中描述的要素;其它要素并不被排除在作為整體的所述權(quán)利要求之外。
[0019] 當(dāng)量、濃度、或者其它值或參數(shù)以范圍、優(yōu)選范圍、或一系列上限優(yōu)選值和下限優(yōu) 選值限定的范圍表示時(shí)，這應(yīng)當(dāng)被理解為具體公開了由任何范圍上限或優(yōu)選值與任何范圍 下限或優(yōu)選值的任一配對(duì)所形成的所有范圍，而不論該范圍是否單獨(dú)公開了。例如，當(dāng)公開 了范圍"1至5"時(shí)，所描述的范圍應(yīng)被解釋為包括范圍"1至4"、"1至3"、"1至2"、"1至2和4至 5"、"1至3和5"等。當(dāng)數(shù)值范圍在本文中被描述時(shí)，除非另外說(shuō)明，否則該范圍意圖包括其端 值和在該范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分?jǐn)?shù)。
[0020] 單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)討論對(duì)象，除非上下文中另外清楚地指明。"任選的"或者"任意 一種"是指其后描述的事項(xiàng)或事件可以發(fā)生或不發(fā)生，而且該描述包括事件發(fā)生的情形和 事件不發(fā)生的情形。
[0021] 說(shuō)明書和權(quán)利要求書中的近似用語(yǔ)用來(lái)修飾數(shù)量，表示本發(fā)明并不限定于該具體 數(shù)量，還包括與該數(shù)量接近的可接受的而不會(huì)導(dǎo)致相關(guān)基本功能的改變的修正的部分。相 應(yīng)的，用"大約"、"約"等修飾一個(gè)數(shù)值，意為本發(fā)明不限于該精確數(shù)值。在某些例子中，近似 用語(yǔ)可能對(duì)應(yīng)于測(cè)量數(shù)值的儀器的精度。在本申請(qǐng)說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，范圍限定可以 組合和/或互換，如果沒(méi)有另外說(shuō)明這些范圍包括其間所含有的所有子范圍。
[0022] 此外，本發(fā)明要素或組分前的不定冠詞"一種"和"一個(gè)"對(duì)要素或組分的數(shù)量要求 (即出現(xiàn)次數(shù))無(wú)限制性。因此"一個(gè)"或"一種"應(yīng)被解讀為包括一個(gè)或至少一個(gè)，并且單數(shù) 形式的要素或組分也包括復(fù)數(shù)形式，除非所述數(shù)量明顯旨指單數(shù)形式。
[0023] "聚合物"意指通過(guò)聚合相同或不同類型的單體所制備的聚合化合物。通用術(shù)語(yǔ) "聚合物"包含術(shù)語(yǔ)"均聚物"、"共聚物"、"三元共聚物"與"共聚體"。
[0024] "共聚體"意指通過(guò)聚合至少兩種不同單體制備的聚合物。通用術(shù)語(yǔ)"共聚體"包括 術(shù)語(yǔ)"共聚物"（其一般用以指由兩種不同單體制備的聚合物)與術(shù)語(yǔ)"三元共聚物"（其一般 用以指由三種不同單體制備的聚合物）。其亦包含通過(guò)聚合四或更多種單體而制造的聚合 物。"共混物"意指兩種或兩種以上聚合物通過(guò)物理的或化學(xué)的方法共同混合而形成的聚合 物。
[0025] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油1-10%、蛋白胨〇. 2-2%、酵母膏0.2-2%、玉米漿0.5-5%、螺旋藻多糖 0 · 05-0 · 2%、甘氨酸0 · 1-1%、其余為水。
[0026]甘油:指丙三醇，無(wú)色味甜澄明黏稠液體。無(wú)臭。有暖甜味。含量為1-10%。
[0027]蛋白胨：蛋白胨是將肉、酪素或明膠用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外觀呈淡黃 色的粉劑，具有肉香的特殊氣息。蛋白質(zhì)經(jīng)酸、堿或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨。蛋白胨 富含有機(jī)氮化合物，也含有一些維生素和糖類。它可以作為微生物培養(yǎng)基的主要原料，在抗 生素、醫(yī)藥工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)、生化制品及微生物學(xué)科研等領(lǐng)域中的用量均很大，可以用來(lái)治 療消化道疾?。徊煌纳矬w需要特定的氨基酸和多肽，因此存在著各種蛋白胨，一般來(lái) 說(shuō)，用于蛋白胨生產(chǎn)的蛋白包括動(dòng)物蛋白（酪蛋白、肉類）、植物蛋白（豆類）、微生物蛋白（酵 母)等三種。能為微生物提供C源、N源、生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。含量為0.2-2%。
[0028]酵母膏：指酵母浸膏，酵母浸膏富含完全蛋白質(zhì)，均衡的必需氨基酸以及B族維生 素、核苷酸、微量元素等，是最為理想的生物培養(yǎng)基原料和發(fā)酵工業(yè)中的主要原料，其功效 與8倍的酵母相當(dāng)，可以大大提高菌種的生產(chǎn)速率及發(fā)酵產(chǎn)品得率。酵母浸膏從原料來(lái)源可 分為面包酵母浸膏、啤酒酵母(釀造啤酒的副產(chǎn)物)和假絲酵母。含量為0.2-2%。
[0029]玉米漿：制造玉米淀粉須將玉米粒先用亞硫酸浸泡，浸泡液濃縮即制成黃褐色的 液體，叫玉米漿。玉米漿中含有豐富的可溶性蛋白、生長(zhǎng)素和一些前體物質(zhì)，含大約40%~ 50%固體物質(zhì)。味道:微咸。在玉米浸泡過(guò)程中若長(zhǎng)有乳酸菌和酵母菌，則提高玉米漿的質(zhì) 量;若長(zhǎng)有腐敗性細(xì)菌則降低玉米漿的質(zhì)量。玉米漿是微生物生長(zhǎng)很普遍應(yīng)用的有機(jī)氮源。 含量為0.5-5%。
[0030]螺旋藻多糖:屬于藍(lán)藻多糖類。從螺旋藻提取出的生理活性多糖，無(wú) 毒。
[0031 ]螺旋藻多糖的提取:提取螺旋藻多糖時(shí)先將螺旋藻干粉進(jìn)行破壁處理，用低極性 溶劑去親脂性成分，經(jīng)熱水抽提或堿液冷抽提，取上清液濃縮，乙醇醇析后離心、干燥得螺 旋藻粗多糖。螺旋藻中蛋白質(zhì)約占細(xì)胞干重的60-70%，因此提取螺旋藻多糖關(guān)鍵是有效地 去除蛋白質(zhì)。目前，去蛋白質(zhì)的方法主要有以下幾種 :Sevag法、泡沫分離技術(shù)、三氯乙酸法、 加熱濃縮法、酶法。Sevag法是去蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法，通常只適用于除少量蛋白，而且必須重 復(fù)多次。TCA法去蛋白能縮短流程，多糖損失率降低，有利于后繼純化。用酶法降解蛋白質(zhì)能 提高多糖粗產(chǎn)品的得率。含量為〇. 05-0.2%。
[0032]甘氨酸:又名氨基乙酸。含量為0.1-1%。
[0033]作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，培養(yǎng)條件為pH 4-9,在20-40°C、100-300 rpm下培養(yǎng) 0.5-7 天。
[0034]作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述培養(yǎng)基為:甘油1.5%、蛋白胨0.8%、酵母膏1.1%、 玉米漿2.5%、螺旋藻多糖0.1%、甘氨酸0.8%、溶劑為水。
[0035]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述培養(yǎng)條件為pH 4-7,在26-29°C、100-300 rpm下 培養(yǎng)0.5-3天。
[0036] 泛酸 泛酸，又稱遍多酸、維生素 B5,廣泛存在于生物界中，是動(dòng)物體內(nèi)合成輔酶A的主要原 料，其主要作用是參與糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝。人體缺乏泛酸會(huì)引起肌肉酸痛或痙攣、腎 上腺機(jī)能不足和減退、注意力不集中、手腳麻木、便秘、精力缺乏、輕微鍛煉后即筋疲力盡、 憂慮、緊張以及磨牙等癥狀。泛酸以其特有的生化功能廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、飼料和食品等領(lǐng) 域。其活性成分為D-構(gòu)型的右旋泛酸，但因泛酸不穩(wěn)定，其工業(yè)應(yīng)用通常使用穩(wěn)定性好的衍 生物。目前比較有效、且廣為利用的泛酸系列產(chǎn)品是泛酸鈣、泛醇、泛硫乙胺等。
[0037] D-泛酸鈣是泛酸系列產(chǎn)品中產(chǎn)量最大的一種，也是泛酸最主要的商品形式，廣泛 應(yīng)用于飼料、醫(yī)藥、食品工業(yè)中。D-泛酸鈣作為輔酶A的組成物質(zhì)參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、糖和脂肪 的代謝，改善毛發(fā)色澤并預(yù)防疾病。特別是家禽家畜及魚科類動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、脂肪的合成 和分解，都不可缺少對(duì)泛酸鈣的需求。缺乏泛酸會(huì)導(dǎo)致家禽、家畜生長(zhǎng)遲緩，生殖機(jī)能發(fā)生 障礙，適應(yīng)性降低。
[0038] D-泛醇，又名維生素原B5 泛醇進(jìn)入人體內(nèi)能轉(zhuǎn)化為泛酸，進(jìn)而合成輔酶A，促進(jìn) 人體蛋白質(zhì)、脂肪、糖類的代謝，保護(hù)皮膚表面的勃膜和毛發(fā)光澤，防止疾病的發(fā)生，缺乏D-泛醇就會(huì)導(dǎo)致皮膚病變及生理障礙。D-泛酸極不穩(wěn)定，其商品形式的固體D-泛酸鈣在應(yīng)用 范圍受到很大的限制，而D-泛醇是以液體的形式存在的等效物，能彌補(bǔ)D-泛酸鈣應(yīng)用領(lǐng)域 的不足。
[0039] D-泛硫乙胺又名潘特生，泛硫乙胺是雙分子泛酰硫基乙胺的一種化合物，是輔酶A 的組成成分。
[0040] D-泛解酸內(nèi)酯(D-PL)，是合成D-泛酸系列產(chǎn)品重要的手型中間體。DL-泛解酸內(nèi)酯 的拆分方法大都是采用化學(xué)方法拆分，用手型拆分劑(手型胺、奎寧化合物、二甲馬錢子堿 等）拆分DL-PL，其缺點(diǎn)是拆分劑昂貴，成本高、分離困難。
[0041 ]國(guó)內(nèi)采用物理方法誘導(dǎo)結(jié)晶法拆分泛酸鈣。
[0042]生物法制備D-PL主要包括直接發(fā)酵法和微生物酶法拆分兩種方法。
[0043] 直接用微生物發(fā)酵法的主要問(wèn)題是產(chǎn)量低。
[0044] 微生物酶法拆分，即將合成的中間體DL-泛解酸內(nèi)酯或其類似物，用特異性酶拆 分，得到D-PL，再進(jìn)一步合成泛酸系列產(chǎn)品。該方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用，環(huán)境友好。
[0045] 微生物酶法拆分有以下幾個(gè)路線：不對(duì)稱還原酮基泛解酸內(nèi)酯路線、不對(duì)稱氧化 和還原兩步酶法轉(zhuǎn)化消旋泛解酸內(nèi)酯、選擇性水解DL-PL。
[0046] 本發(fā)明微生物酶法拆分的機(jī)理是用立體專一性D-內(nèi)酯水解酶水解D-泛解酸內(nèi)酯， 得到D-泛解酸，再經(jīng)過(guò)內(nèi)酯化反應(yīng)生成D-泛解酸內(nèi)酯。未水解部分經(jīng)過(guò)消旋化可反復(fù)使用。
[0047] 產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的微生物種屬?gòu)V泛，主要有以下幾種:鐮孢霉菌屬、赤霉菌 屬、粘帚霉菌屬、黑曲霉屬、青霉屬、根霉屬、以及短梗霉屬等屬絲狀真菌。
[0048]本發(fā)明中選用的尖孢鐮孢菌作為微生物菌株，本發(fā)明的微生物菌株已經(jīng)在中國(guó)普 通微生物菌種保藏管理中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC 3.1784diT#SSFUSariUm oxysporum〇
[0049] 尖孢鐮孢菌 尖孢鐮孢菌，亦稱尖孢鐮刀菌，尖孢鐮刀菌是一類既可侵染植物又可在土壤內(nèi)生存的 兼性寄生真菌。和其它植物病原菌一樣，存在著種下分化，可侵染許多植物寄主，具有多種 ?；汀Ｔ赑DA平板上培養(yǎng)，菌落突起絮狀，菌絲白色質(zhì)密。菌落粉白色，淺粉色至肉色，略帶 有紫色，由于大量孢子生成而呈粉質(zhì)。菌落高3~5mm，小型分生孢子著生于單生瓶梗上，常 在瓶梗頂端聚成球團(tuán)，單胞，卵形;大型分生孢子鐮刀形，少許彎曲，多數(shù)為3隔。厚垣孢子尖 生或頂生，球形。
[0050] 本發(fā)明提供了 一種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油1-10%、蛋白胨〇. 2-2%、酵母膏0.2-2%、玉米漿0.5-5%、螺旋藻多糖 0 · 05-0 · 2%、甘氨酸0 · 1-1%、其余為水。
[0051] 培養(yǎng)條件為pH 4-7,在26-2%~、100-300 rpm下培養(yǎng)0.5-3天。
[0052] 菌體的固定化 菌體的固定化是指固定化菌體產(chǎn)生的酶。所謂的固定化酶是指采用有機(jī)或無(wú)機(jī)固定材 料作為載體，將酶包埋起來(lái)或束縛、限制于載體的表面和微孔中，使其仍具有催化活性，并 可回收及重復(fù)利用的酶化學(xué)方法與技術(shù)。與游離酶相比固定化酶具有以下的優(yōu)點(diǎn)：（1)采用 過(guò)濾或離心的方法極易與反應(yīng)液分開，使酶可長(zhǎng)期地反復(fù)地分批操作或裝柱連續(xù)反應(yīng)；（2) 酶的穩(wěn)定性有改進(jìn)；（3)酶反應(yīng)過(guò)程能嚴(yán)格控制；（4)由于酶不混入產(chǎn)物溶液中，產(chǎn)物純化可 以精簡(jiǎn)；（5)酶的使用效率提高，成本降低。
[0053]常用的酶的固定化方法： 吸附法 (1)物理吸附法 這種方法是將酶蛋白通過(guò)范德華力等弱相互作用，吸附到不溶于水的載體表面上而使 酶固定化。此法與前述的離子結(jié)合法比較，酶蛋白的活性中心不易受破壞，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)變 化也不明顯，從載體對(duì)酶的適應(yīng)性來(lái)看，這個(gè)方法是好的，但其缺點(diǎn)是酶與載體的相互作用 較弱，因而被吸附的酶極易從載體表面上脫落下來(lái)。炭，多孔玻璃，酸性白土，漂白土，高嶺 土，礬土，硅膠，膨潤(rùn)土，氟磷灰石等無(wú)機(jī)載體外，也可利用淀粉，谷蛋白這類生物大分子。
[0054] (2)離子吸附法 此法是通過(guò)離子效應(yīng)，將酶固定到具有離子交換基團(tuán)的非水溶性載體上。能用于離子 結(jié)合法的載體，除具有離子交換基團(tuán)的多糖類以外，聚電解質(zhì)，如離子交換樹脂等合成高分 子衍生物也可用作載體。離子結(jié)合法與前述的共價(jià)結(jié)合法比較，操作更加簡(jiǎn)便，處理?xiàng)l件比 較溫和，而且酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸很少發(fā)生變性，因而可以得到較高活性的 固定化酶。但這種方法與共價(jià)結(jié)合等化學(xué)方法比較，載體和酶的結(jié)合是依靠庫(kù)侖相互作用， 因而不夠牢固，易受所使用的緩沖溶液限制和反應(yīng)溶液pH值影響。在溶液離子強(qiáng)度較高的 情況下，由于去屏蔽效應(yīng)，會(huì)使酶從載體上脫落下來(lái)。
[0055] 包埋法 (1)凝膠包埋法 將酶包埋在交聯(lián)的不溶性凝膠的空隙中的方法。操作時(shí)，首先將酶和單聚物混合，然后 加入引發(fā)劑使單聚物發(fā)生聚合，從而制成凝膠固定化酶。交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠包埋法是首 先被采用的包埋技術(shù)。用此法固定的酶有:胰蛋酶、木瓜蛋白酶、P-淀粉酶、后來(lái)又有研究者 用此法固定了過(guò)氧化氫酶、胰凝乳蛋白酶、β-葡萄糖苷酶。
[0056] (2)微囊包埋法 共價(jià)結(jié)合法 共價(jià)結(jié)合法是指酶分子的功能團(tuán)和載體表面上的反應(yīng)基團(tuán)之間以共價(jià)鍵的方式相互 連接，形成固定化酶。常用載體包括天然高分子(纖維素、瓊脂糖、淀粉、葡萄糖凝膠、膠原及 衍生物等）、合成高聚物(尼龍、多聚氨基酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物等）。此法的優(yōu)點(diǎn)是 酶與載體間連接牢固，即使使用高底物濃度或離子強(qiáng)度的溶液進(jìn)行反應(yīng)，也不會(huì)導(dǎo)致酶和 載體的分離。因此具有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性，成為目前研究最為活躍的一類酶固定 化方法。
[0057]交聯(lián)法 交聯(lián)法是采用雙功能團(tuán)試劑或多功能團(tuán)試劑進(jìn)行酶分子之間的交聯(lián)，使酶分子和雙功 能試劑或多功能團(tuán)試劑之叫形成共價(jià)鍵，得到交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。除了酶分子之間發(fā)生交聯(lián)外， 還存在一定的分子內(nèi)交聯(lián)，根據(jù)使用條件和添加材料的不同，可制備不同物理性質(zhì)的固定 化酶。常用交聯(lián)劑有戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺、Ν，Ν-亞甲基雙丙烯酰胺等。此法的優(yōu)點(diǎn)是酶之 間連接牢固，具有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性，缺點(diǎn)是有時(shí)難以很好的控制反應(yīng)條件，反應(yīng) 劇烈時(shí)，常常引起酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，并導(dǎo)致活性中心受到破壞，從而難于保證每 次都能制得高活力的樣品。
[0058]本發(fā)明中，所用固定化的方法是包埋法。
[0059]步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱并攪拌至完全溶化，然后 靜置冷卻至室溫，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液中加 入添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液滴加 至|J交聯(lián)劑溶液中，浸泡1-3小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可。
[0060] 作為一種實(shí)施方式，所述聚乙烯醇的含量為1-10%，海藻酸鈉的含量為1-10%。
[0061] 作為一種實(shí)施方式，所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉一種或幾種。
[0062]作為一種實(shí)施方式，所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和/或硝酸鈣和/或氯化鋁的飽 和硼酸溶液。
[0063]作為一種實(shí)施方式，所述濕菌體加入量為2-20%。
[0064] 水解 將濕菌體或者固定化的菌絲體作為生物催化劑和DL-泛解酸內(nèi)酯底物混合，水解生成 的D-泛解酸。
[0065] DL-泛解酸內(nèi)酯底物為DL-泛解酸內(nèi)酯溶液和pH 6.0-9.0的Tris-HCl緩沖液混合， 配制成5-50% DL-泛解酸內(nèi)酯底物。
[0066] 稱取上述清洗后的菌體或者固定化后的菌體，加入到已經(jīng)混合均勻的5-50% DL-泛解酸內(nèi)酯底物和10-50mmol CaCl2,于20-40°C振蕩反應(yīng)0.1-40小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速120_ 200r pm /m i η，濾去菌絲。在2 0 °C，用1 dm的試管測(cè)試反應(yīng)液的旋光值。
[0067]其中，菌體的加入量為以每lg的DL-泛解酸內(nèi)酯底物加入0.25-1.5g的菌體，例如： 2g的DL-泛解酸內(nèi)酯底物加入0.5-3g的菌體。
[0068] 陰性對(duì)照組:將菌體加入到不加 DL-泛解酸內(nèi)酯底物中，相同方法測(cè)定旋光值，用 以觀察菌體自身是否產(chǎn)生具有旋光的物質(zhì)。
[0069] 提取 本發(fā)明中，DL-泛解酸內(nèi)酯經(jīng)水解后，得到D-泛解酸。然后將D-泛解酸進(jìn)行內(nèi)酯化得到 D-泛解酸內(nèi)酯，然后進(jìn)行萃取、脫色、濃縮、結(jié)晶，得到純D-泛解酸內(nèi)酯。具體步驟為： 將經(jīng)過(guò)水解后的酶解液，分別用乙酸乙酯萃取數(shù)次，分離出含D-泛解酸的水相;將含有 D-泛解酸的水相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，調(diào)pH至1.0-1.4,然后加入活性炭脫色，過(guò)濾;濾液 再用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，有機(jī)相蒸餾回收溶劑，得到純D-泛解酸內(nèi)酯。
[0070] 生物量與酶活的測(cè)定方法 生物量測(cè)定：取發(fā)酵液10mL，過(guò)濾收集菌絲體，105 °C烘干2h，測(cè)定干重2次，計(jì)算平均 值，即為發(fā)酵液的生物量，以g · Γ1，計(jì)。
[0071] 酶活定義:一定條件下，每分鐘水解1 ymolD-泛解酸內(nèi)酯成D-泛解酸的酶量定義 為1個(gè)酶活力單位(IU)。
[0072]酶活測(cè)定：取10mL發(fā)酵液中濾出的菌絲體，加入含有20g · I/1的泛解酸內(nèi)酯的 Tris-HCl (ρΗ7·5)緩沖液5mL，28°C搖床200 r · min-1反應(yīng)1小時(shí)，過(guò)濾除去菌體，濾液用注 射用水稀釋50倍，0.45μπι微孔濾膜過(guò)濾，取濾液進(jìn)樣。HPLC測(cè)定泛解酸生成量，并計(jì)算每升 發(fā)酵液或每克干菌體的酶活力單位。
[0073] 本發(fā)明的發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，采用的發(fā)酵培養(yǎng)中，所述培養(yǎng)基中加入 少量的螺旋藻多糖和甘氨酸;并且發(fā)現(xiàn)螺旋藻多糖和甘氨酸的加入可以明顯提高的細(xì)菌的 產(chǎn)酶量和產(chǎn)酶速度，甚至可以提高酶在低pH值下的穩(wěn)定性。
[0074] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述。有必要在此指出的是，以下實(shí)施例只用 于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員 根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0075] 另外，如果沒(méi)有其它說(shuō)明，所用原料都是市售的。
[0076] 測(cè)試： 1.酶活測(cè)定：取10mL發(fā)酵液中濾出的菌絲體，加入含有20g · I/1的泛解酸內(nèi)酯的 Tris-HCl (ρΗ7·5)緩沖液5mL，28°C搖床200 r ·π?η-1反應(yīng)0.5小時(shí)，過(guò)濾除去菌體，濾液用 注射用水稀釋50倍，0.45μπι微孔濾膜過(guò)濾，取濾液進(jìn)樣。HPLC測(cè)定泛解酸生成量，并計(jì)算每 升發(fā)酵液或每克干菌體的酶活力單位。
[0077] 2.產(chǎn)酶時(shí)間：分別在培養(yǎng) 1211、2411、3611、4811、6011、7211、8411、9611、10811、12011取樣， 利用高效液相色譜來(lái)測(cè)定生物量和酶活，確認(rèn)出產(chǎn)酶時(shí)間，以樣品能夠產(chǎn)酶速率達(dá)到7.1 g/L的時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行檢測(cè)。
[0078] 5天內(nèi)未達(dá)到:指在培養(yǎng)的120h內(nèi)產(chǎn)酶速率均未達(dá)到7.1 g/L。
[0079] 3.相對(duì)酶活：以未處理的酶液活性為100%為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算。
[0080] 4.酶轉(zhuǎn)化率：以完全沒(méi)有和尖孢鐮孢菌接觸的底物的轉(zhuǎn)化率為0,以此為標(biāo)準(zhǔn)計(jì) 算。
[0081 ]其中高效液相色譜的檢測(cè)條件： 色譜柱：〇丨&111〇118；[11]\1〇18柱（25〇1]1111\4.61]1111，5以111)，流動(dòng)相：4:13=9:1(其中4為乙臆-KH 2P〇4溶液（0.02mol · L-用lmol · L-^CL調(diào)節(jié)溶液的pH值至3.00，B為純乙腈），流速 lmL · mirT1，檢測(cè)波長(zhǎng):215nm，柱溫:25°C。在此條件下，泛解酸和泛解酸內(nèi)酯的保留時(shí)間分 別為4. Omin和 7 · 5min。
[0082]實(shí)施例1: 一種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油1%、蛋白胨〇. 2%、酵母膏0.2%、玉米漿0.5%、螺旋藻多糖0.05%、甘氨 酸0.1%、其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 7,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱并攪拌至完全溶化， 然后靜置冷卻至室溫，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液 中加入添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液 滴加到交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為2%，海藻酸鈉的含量為2%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和硝酸鈣和氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為2%; 所述水解條件為：用pH 7的Tris-HCl緩沖液配制的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加入微生 物菌株和lOmmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0084]實(shí)施例2: -種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油10%、蛋白胨2%、酵母膏2%、玉米漿5%、螺旋藻多糖0.2%、甘氨酸1%、 其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 7,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱并攪拌至完全溶化， 然后靜置冷卻至室溫，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液 中加入添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液 滴加到交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為2%，海藻酸鈉的含量為1.75%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和硝酸鈣和氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為20%; 所述水解條件為：用pH 7的Tris-HCl緩沖液配制50%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加入 微生物菌株和50mmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0086]實(shí)施例3: -種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述微生物菌株為尖孢鐮孢菌； 所述培養(yǎng)基為:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米漿3%、螺旋藻多糖0.1%、甘氨酸0.5%、 其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 7,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱并攪拌至完全溶化， 然后靜置冷卻至室溫，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液 中加入添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液 滴加到交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為2%，海藻酸鈉的含量為1.5%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和硝酸鈣和氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為10%; 所述水解條件為：用pH 7.0的Tris-HCl緩沖液配制25%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0088]實(shí)施例4: 一種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述微生物菌株為尖孢鐮孢菌； 所述培養(yǎng)基為：甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米漿3%、螺旋藻多糖0.05%、甘氨酸 0.05%、其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 7.0,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱至完全溶化，然后靜 置冷卻至45°C，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液中加入 添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液滴加到 交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為1.5%，海藻酸鈉的含量為2%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和硝酸鈣和氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為10%; 所述水解條件為：用pH 7的Tris-HCl緩沖液配制25%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加入 微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0090]實(shí)施例5: -種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米漿3%、螺旋藻多糖0.3%、甘氨酸1.5%、 其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 7,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱至完全溶化，然后靜 置冷卻至45°C，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液中加入 添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液滴加到 交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為1.5%，海藻酸鈉的含量為3%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和硝酸鈣和氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為10%; 所述水解條件為：用pH 7.0的Tris-HCl緩沖液配制25%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0092]實(shí)施例6: -種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油50%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米漿3%、螺旋藻多糖0.1%、其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 7,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱并攪拌至完全溶化， 然后靜置冷卻至室溫，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液 中加入添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液 滴加到交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為0.5%，海藻酸鈉的含量為3%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉一種或幾種； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和/或硝酸鈣和/或氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為10%; 所述水解條件為：用pH 7的Tris-HCl緩沖液配制25%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加入 微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0094]實(shí)施例7: -種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米漿3%、甘氨酸0.5%、其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 7,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱并攪拌至完全溶化， 然后靜置冷卻至室溫，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液 中加入添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液 滴加到交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為3%，海藻酸鈉的含量為3%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉一種或幾種； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和/或硝酸鈣和/或氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為10%; 所述水解條件為：用pH 7.0的Tris-HCl緩沖液配制25%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0096]實(shí)施例8: -種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米漿3%、其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 7,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱至完全溶化，然后靜 置冷卻至45°C，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液中加入 添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液滴加到 交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為0.5%，海藻酸鈉的含量為2%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和硝酸鈣和氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為10%; 所述水解條件為：用pH 7.0的Tris-HCl緩沖液配制25%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0098]實(shí)施例9: 一種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米漿3%、螺旋藻多糖0.1%、甘氨酸0.5%、 其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 4.0,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱至完全溶化，然后靜 置冷卻至45°C，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液中加入 添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液滴加到 交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為1%，海藻酸鈉的含量為1%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和硝酸鈣和氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為10%; 所述水解條件為：用pH 4.0的Tris-HCl緩沖液配制25%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0100]實(shí)施例10. -種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米漿3%、螺旋藻多糖0.1%、甘氨酸0.5%、 其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 9,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱至完全溶化，然后靜 置冷卻至45°C，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液中加入 添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液滴加到 交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為3%，海藻酸鈉的含量為2%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和硝酸鈣和氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為10%; 所述水解條件為：用pH 9.0的Tris-HCl緩沖液配制25%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0102]實(shí)施例11: 一種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米漿3%、其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 4,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱至完全溶化，然后靜 置冷卻至45°C，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液中加入 添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液滴加到 交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為8%，海藻酸鈉的含量為2%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉一種或幾種； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和/或硝酸鈣和/或氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為10%; 所述水解條件為：用pH 6.0的Tris-HCl緩沖液配制25%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0104]實(shí)施例12:-種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米漿3%、其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 9,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱并攪拌至完全溶化， 然后靜置冷卻至室溫，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液 中加入添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液 滴加到交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為10%，海藻酸鈉的含量為10%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉一種或幾種； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和/或硝酸鈣和/或氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為10%; 所述水解條件為：用pH 9.0的Tris-HCl緩沖液配制5-50%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后 加入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0106]實(shí)施例13:-種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米漿3%、螺旋藻多糖0.1%、其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 4,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱并攪拌至完全溶化， 然后靜置冷卻至室溫，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液 中加入添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液 滴加到交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為5%，海藻酸鈉的含量為3%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉一種或幾種； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和/或硝酸鈣和/或氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為10%; 所述水解條件為：用pH 6.0的Tris-HCl緩沖液配制25%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0108]實(shí)施例14: 一種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米漿3%、螺旋藻多糖0.1%、其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 9,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱并攪拌至完全溶化， 然后靜置冷卻至室溫，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液 中加入添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液 滴加到交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為5%，海藻酸鈉的含量為5%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉一種或幾種； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和/或硝酸鈣和/或氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為10%; 所述水解條件為：用pH 9.0的Tris-HCl緩沖液配制25%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0110]實(shí)施例15: -種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米漿3%、甘氨酸0.5%、其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 4,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱并攪拌至完全溶化， 然后靜置冷卻至室溫，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液 中加入添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液 滴加到交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為2%，海藻酸鈉的含量為3%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和硝酸鈣和氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為10%; 所述水解條件為：用pH 6.0的Tris-HCl緩沖液配制25%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0112]實(shí)施例16: -種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為:甘油5%、蛋白胨1%、酵母膏1%、玉米漿3%、甘氨酸0.5%、其余為水； 發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:pH 9,在30°C、200 rpm下培養(yǎng)5天； 固定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱并攪拌至完全溶化， 然后靜置冷卻至室溫，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液 中加入添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液 滴加到交聯(lián)劑溶液中，浸泡2小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可； 其中，所述聚乙烯醇的含量為3%，海藻酸鈉的含量為5%; 所述添加劑為硅藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉； 所述交聯(lián)劑溶液為含有氯化鈣和硝酸鈣和氯化鋁的飽和硼酸溶液； 所述濕菌體加入量為10%; 所述水解條件為：用pH 9.0的Tris-HCl緩沖液配制25%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加 入微生物菌株和30mmol CaCl2; 所述內(nèi)酯化和提取的步驟為:分別用乙酸乙酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水 相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
[0114] 以上數(shù)據(jù)可以看出，與不使用特定量螺旋藻多糖和甘氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)的尖孢鐮 孢菌的產(chǎn)酶速率和酶活性相比，本發(fā)明培養(yǎng)得到的尖孢鐮孢菌的產(chǎn)酶可以在低pH下穩(wěn)定， 且產(chǎn)酶速率快，因此提供了本發(fā)明的有益技術(shù)效果。
[0115] 前述的實(shí)例僅是說(shuō)明性的，用于解釋本公開的特征的一些特征。所附的權(quán)利要求 旨在要求可以設(shè)想的盡可能廣的范圍，且本文所呈現(xiàn)的實(shí)施例僅是根據(jù)所有可能的實(shí)施例 的組合的選擇的實(shí)施方式的說(shuō)明。因此，
【申請(qǐng)人】的用意是所附的權(quán)利要求不被說(shuō)明本發(fā)明 的特征的示例的選擇限制。而且在科技上的進(jìn)步將形成由于語(yǔ)言表達(dá)的不準(zhǔn)確的原因而未 被目前考慮的可能的等同物或子替換，且這些變化也應(yīng)在可能的情況下被解釋為被所附的 權(quán)利要求覆蓋。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，其特征在于，所述步驟包含： (1) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)尖孢鐮孢菌； (2) 將培養(yǎng)后的尖孢鐮孢菌與底物混合，水解得到D-泛解酸； ⑶內(nèi)酯化步驟⑵的D-泛解酸，即得;其中， 所述培養(yǎng)基為：甘油1-10%、蛋白胨〇. 2-2%、酵母膏0.2-2%、玉米漿0.5-5%、螺旋藻多糖 0 · 05-0 · 2%、甘氨酸0 · 1-1%、其余為水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基為： 甘油1.5%、蛋白胨0.8%、酵母膏1.1%、玉米漿2.5%、螺旋藻多糖0.1%、甘氨酸0.8%、溶劑為水。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)條件為 pH 4-9,在20-40 °C、100-300 rpm下培養(yǎng)0.5-7天。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)條件為 pH 4-7,在26-29°C、100-300 rpm下培養(yǎng)0.5-3天。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，其特征在于，所述步驟(2)固 定化的步驟為:稱取聚乙烯醇和海藻酸鈉并與水混合，水浴加熱并攪拌至完全溶化，然后靜 置冷卻至室溫，得到聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液;在聚乙烯醇-海藻酸鈉混合溶液中加入 添加劑，再加入所述濕菌體，混合均勻，得到菌體混合溶液；用注射器將菌體混合液滴加到 交聯(lián)劑溶液中，浸泡1-3小時(shí)，取出，用去離子水洗滌，即可。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，其特征在于，所述聚乙烯醇的 含量為1_1〇%，海藻酸鈉的含量為1 _1〇%。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，其特征在于，所述添加劑為硅 藻土、活性炭、貝殼粉、石灰粉一種或幾種。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑溶液 為含有氯化鈣和/或硝酸鈣和/或氯化鋁的飽和硼酸溶液;所述濕菌體加入量為2-20%。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，其特征在于，步驟(2)的水解 條件為：用pH 6.0-9.0的Tris-HCl緩沖液配制5-50%的DL-泛解酸內(nèi)酯溶液;然后加入微生 物菌株和 10_50mmol CaCl2。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵制備D-泛解酸內(nèi)酯的方法，其特征在于，所述步驟還包 括，內(nèi)酯化D-泛解酸后經(jīng)提取得到D-泛解酸內(nèi)酯，其中內(nèi)酯化和提取條件為:分別用乙酸乙 酯萃取3次，分離出含D-泛解酸的水相;水相用鹽酸進(jìn)行內(nèi)酯化反應(yīng)，脫色，過(guò)濾;濾液用乙 酸乙酯萃取提取有機(jī)相，蒸餾回收，得到D-泛解酸內(nèi)酯。
【文檔編號(hào)】C12P17/04GK105950679SQ201610361405
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】周中平, 張秋華, 張海峰
【申請(qǐng)人】兄弟科技股份有限公司