水稻品種冷水紅灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個來源于水稻品種冷水紅的灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。所述的灰飛虱抗生性位點，命名為Qsbph4a，位于水稻4號染色體分子標(biāo)記RM1018與RM7187之間。用分子標(biāo)記RM1018引物或者用分子標(biāo)記RM7187引物擴增水稻灰飛虱抗性鑒定材料，若分別能夠擴增出160bp和157bp的擴增片段，則標(biāo)志著水稻材料內(nèi)存在灰飛虱抗生性位點Qsbph4a。采用本發(fā)明的灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法來檢測水稻灰飛虱抗性水平，能極大地提高灰飛虱抗生性水稻的檢測速度，提高水稻的產(chǎn)量和育種效率。
【專利說明】
水稻品種冷水紅灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及水稻品種冷水紅灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻(Oryzasativa L.)是世界上最重要的糧食作物之一，產(chǎn)量與播種面積均居世界首位。水稻病蟲害是制約水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要因素。稻飛虱是亞洲各國水稻生產(chǎn)上最重要的害蟲之一，給水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損害。目前，為害水稻的飛虱主要有褐飛虱(Nilaparvata Iugens)、灰飛虱(Laodelphax striatellus)和白背飛虱(Sogatellafurcifera)三種，其中灰飛虱發(fā)生最早，適應(yīng)性最廣，田間種群密度大，主要危害早、中稻秧田和分蘗期的稻苗或嫩穗。
[0003]灰飛風(fēng)(Laodelphgax s tr iate I Ius )，屬于同翅目(Homoptera)，飛風(fēng)科(Delphacide)，在世界上主要分布于東亞、東南亞、非洲、歐洲等廣大地區(qū)，在我國各主要稻區(qū)也分布廣泛，長江中下游和華北地區(qū)發(fā)生較多。寄主是各種草坪禾草及水稻、小麥、大麥、甘蔗、看麥娘、李氏禾和雙穗雀稗等多種禾本科植物，對農(nóng)業(yè)危害很大?；绎w虱是典型的刺吸式口器害蟲，除直接危害造成損失外，還能夠傳播水稻條紋葉枯病毒(rice stripevirus，RSV)、水稻黑條矮縮病毒(rice black streaked dwarf virus，RBSDV)及玉米粗縮病毒(maize rough dwarf virus，MRDV)等多種病害，自20世紀(jì)50年代以來灰飛虱逐漸發(fā)展成為亞洲水稻的主要害蟲，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重損失。
[0004]灰飛虱是溫帶昆蟲，具有耐寒、耐饑餓的生物學(xué)特性，灰飛虱種群具有的強抗逆能力和多態(tài)現(xiàn)象增加了種群在各種環(huán)境條件下的存活機會，導(dǎo)致其適生范圍范圍非常廣泛，普遍分布于東亞、東南亞、南亞的溫帶氣候帶。近幾年全球氣候變暖所致的暖冬和春季溫度升高，有利于灰飛虱種群的安全越冬和迅速繁衍，使得灰飛虱的越冬蟲源基數(shù)不斷加大。輪作及種植方式的多樣性，使得灰飛虱種群稻田、麥田、高粱地、田間雜草等互相轉(zhuǎn)移的橋梁增多，增加了種群在全年各種環(huán)境下的存活機會。目前防治灰飛虱主要措施是農(nóng)業(yè)防治，以使用化學(xué)藥劑為主，導(dǎo)致灰飛虱對多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性，從而使這種單一的防治措施面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，再加上灰飛虱的迀飛特性使得灰飛虱的殺滅非常困難。粳稻品種的推廣與種植，導(dǎo)致水稻抗蟲能力更加脆弱。近年來各地灰飛虱危害嚴(yán)重，田間群體密度很大。
[0005]在水稻生長前期，一般認為，灰飛虱的危害除了以成蟲、若蟲刺吸水稻汁液，引起植株黃葉、枯死，造成空秕率上升，千粒重下降，稻米品質(zhì)降低外，主要是它能在水稻生長前期作為傳毒媒介，傳播水稻條紋葉枯病、水稻黑條矮縮病等，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成較大損失。在水稻生長后期，灰飛虱一般以較大種群密度聚居于稻叢中上部，成蟲、若蟲均刺吸水稻莖桿和葉片汁液。在蟲口密度大時，稻株因體內(nèi)汁液大量喪失而枯黃?；绎w虱在葉片或穗子上排出大量蜜露，會影響水稻光合作用，還會滋生霉菌，引起稻粒霉?fàn)€。江蘇農(nóng)科院測定發(fā)現(xiàn)，灰飛虱危害嚴(yán)重植株比正常植株輕8.92克，株高降低33cm，穗長和每穗粒數(shù)分別降低5.49cm和28.5粒，半實率和不實率分別增加36.3%和3.20%，減產(chǎn)達41.5%。
[0006]目前使用化學(xué)藥劑為主的灰飛虱防治導(dǎo)致灰飛虱對多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性，此夕卜，灰飛虱的迀飛特性及其傳毒的瞬時性和持久性，致使防蟲治病的效果不佳。生產(chǎn)上通常采用加大化學(xué)藥劑的施用量來防蟲治蟲，導(dǎo)致灰飛虱天敵殺傷嚴(yán)重，嚴(yán)重傷害了田間生態(tài)平衡，從而使這種單一的防治措施面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。利用品種自身的抗性一直被認為是防控灰飛虱危害最為經(jīng)濟有效的方法。目前生產(chǎn)上推廣種植的粳稻品種大多感蟲，因此，挖掘抗稻灰飛虱種質(zhì)資源，選育高抗灰飛虱新品種，既能有效防止灰飛虱直接取食為害，也可以控制目前大爆發(fā)的條紋葉枯病、黑條矮縮病等病害，具有十分重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對常規(guī)水稻育種中灰飛虱抗生性鑒定穩(wěn)定性、重復(fù)性較差及費時費力等缺點，提供了水稻品種冷水紅灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法，該方法可以預(yù)測水稻植株對灰飛虱的抗生性，簡化了選擇方法，進而加快水稻灰飛虱抗生性品種的育種進程。
[0008]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
水稻品種冷水紅灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法，其特征在于:用分子標(biāo)記RM1018引物:SEQ ID N0.l/SEQ ID N0.2，或者用分子標(biāo)記RM7187引物:SEQ ID N0.3/SEQID N0.4擴增水稻灰飛虱抗性鑒定材料，如果用分子標(biāo)記RM1018引物:SEQ ID N0.l/SEQ IDN0.2能夠擴增出160bp的擴增片段，或用分子標(biāo)記RM7187引物:SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4能夠擴增出157bp的擴增片段，則標(biāo)志著水稻材料內(nèi)存在灰飛虱抗生性位點Qsbph4a。
[0009]所述的分子標(biāo)記方法包含以下步驟:
(1)以水稻灰飛虱高感品種武育粳3號為母本，灰飛虱高抗生性品種冷水紅為父本，配制雜種Fl，構(gòu)建了包含214個單株的F2分離群體，通過F2單株自交獲得214個F2:3家系；
(2)對F2:3家系采用水稻灰飛虱抗生性鑒定，獲得各家系的抗生性測驗值；
(3)采用CTAB微量法提取親本、Fl及F2:3定位群體單株的DNA;
(4 )用實驗室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的821對SSR引物(含128對自行合成引物)，對親本、Fl及F2:3定位群體進行PCR擴增尋找兩兩之間同時具有穩(wěn)定多態(tài)性的引物，用篩選到的204對多態(tài)性分子標(biāo)記檢測F2:3家系；
(5)根據(jù)定位群體各單株分子標(biāo)記多態(tài)性檢測結(jié)果，并結(jié)合其抗性表型參數(shù)，用Mapmaker/Exp3.0軟件進行基因和分子標(biāo)記位點的遺傳連鎖分析，利用Kosambi作圖函數(shù)將交換率轉(zhuǎn)換為遺傳距離(CM);
(6)米用基于復(fù)合區(qū)間作圖法軟件WindowsQTL Cartographer V2.5檢測水稻灰飛虱的抗生性QTL，LOD值的閾值定為2.5，在5%的總體顯著水平下檢測QTL，檢測抗性QTL的數(shù)目及其在染色體上的位置；
(7)獲得水稻灰飛虱高抗生性品種冷水紅抗生性基因位點Qsbph4a，位于第4號染色體分子標(biāo)記RM1018引物與分子標(biāo)記RM7187引物之間，通過檢測第4號染色體上該兩個引物標(biāo)記的帶型數(shù)據(jù)，可以預(yù)測該植株灰飛虱的抗生性，大大提高灰飛虱抗生性水稻的選擇效率。
[0010]所述的水稻灰飛虱抗生性鑒定的具體方案為:將催芽后的水稻種子播于直徑為6cm、高15cm的無色透明玻璃杯中，每個品種5株，重復(fù)3次，待秧苗長至1.5_2.0葉，每杯接入1-2齡的灰飛虱若蟲約25頭，紗布封口，10天后統(tǒng)計每個杯子剩余的蟲數(shù)，計算灰飛虱若蟲的殘存率，作為抗生性測驗值。
[0011 ]所述的用CTAB微量法提取親本、Fl及F2: 3定位群體單株的DNA的具體流程為:取
0.3-0.5g新鮮的水稻葉片，于液氮中研成粉;將凍粉轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，立即加入500yLDNA提取緩沖液，置65°C溫浴20min ；加入700yL氯仿/異丙醇，輕緩顛倒離心管混勻，12000r/min離心1min;轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，加入600yL異丙醇，12000r/min離心5min;棄上清液，加入600yL的70%乙醇，12000r/min離心5min;棄70%乙醇，風(fēng)干;加0.2mL TE，溶解后4°C保存。
[0012]所述的對親本、Fl及F2:3定位群體進行PCR擴增的PCR反應(yīng)體系為:總體積為1yL，1mM Tris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2,50μΜ dNTPs，0.2μΜ 引物，0.5U Taq 酶和20ng DNA模板;PCR擴增程序為:94°C預(yù)變性5min;94°C變性lmin，55°C退火復(fù)性lmin，72°C延伸1.5min，共35個循環(huán);最后72°C保溫1min;擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)銀染檢測。
[0013]所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳的具體方法為:100ml8%凝膠工作液配方為:ddH2070ml，10*TBE 1ml，40%丙烯酰胺(19: l)20ml，TEMED 10ul，10%AP 100ul;其中，10*TBE是將108g Tris堿和55g硼酸先溶解于蒸饋水，加40ml 0.5mol/L EDTACPH 8.0)，再加ddifeO定容到100ml; 19:1(10ml)丙烯酰胺是將38g丙烯酰胺和2g N，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶解于ddH20，定容至100ml，過濾后4°C保存。
[0014]所述的擴增灰飛虱抗生性位點Qsbph4a的分子標(biāo)記引物選自分子標(biāo)記RM1018引物:SEQ ID N0.l/SEQ ID N0.2和分子標(biāo)記RM7187引物:SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4。
[0015]所述的分子標(biāo)記引物在水稻育種中的應(yīng)用。
[0016]所述的分子標(biāo)記引物在快速篩選灰飛虱高抗生性水稻品種或品系中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明所提供的水稻品種冷水紅灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法，具有抗性基因位點位置明確、鑒定方便等優(yōu)點。本發(fā)明通過檢測4號染色體上與水稻灰飛虱抗生性QTL緊密連鎖的SSR標(biāo)記，即可以預(yù)測水稻植株的灰飛虱抗生性水平，大大提高了灰飛虱抗生性水稻的選擇效率，加快了育種進程。
【附圖說明】
[0018]圖1所示4號染色體上與水稻灰飛虱抗生性QTL緊密連鎖的SSR標(biāo)記在染色體上的位置。
[0019]圖2應(yīng)用4號染色體上與水稻灰飛虱抗生性QTL緊密連鎖的SSR標(biāo)記預(yù)測水稻植株灰飛虱抗生性的電泳圖譜Mark; 1:武育粳3號；2:冷水紅;3:F1; 4_13:灰飛虱感蟲單株；14-23:灰飛虱抗生性單株。
【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合實施案例對本發(fā)明作進一步說明，而非限制本發(fā)明，實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)技術(shù)方法。
[0021 ] 一、抗源的篩選與武育粳3號/冷水紅F2群體構(gòu)建:
多年的大田育種材料鑒定觀察水稻品種冷水紅對南方稻區(qū)大規(guī)模發(fā)生的害蟲灰飛虱有較好的抗生性。冷水紅，原產(chǎn)于河北省豐南縣，是一種極為珍貴的優(yōu)質(zhì)米，被專家認定為是康熙皇帝“御田胭脂米”，當(dāng)?shù)厝朔Q它為“三伸腰”，又叫“黑谷子”。為準(zhǔn)確鑒定冷水紅對灰飛虱的抗生性水平，2012年正季于灰飛虱爆發(fā)時期從大田采集灰飛虱，進一步篩選2-3齡灰飛虱若蟲進行抗生性實驗?？股詫嶒灧椒ㄈ缦?將催芽后的冷水紅和其它鑒定品種水稻種子分別播于直徑為6cm、高15cm的無色透明玻璃杯中，每個品種5株，重復(fù)3次，待秧苗長至1.5-2.0葉，每杯接入1-2齡的灰飛虱若蟲約25頭，紗布封口，10天后統(tǒng)計每個杯子剩余的蟲數(shù)，計算灰飛虱若蟲的殘存率，作為抗生性測驗值。冷水紅和感蟲水稻品種武育粳3號的抗生性測驗值均值分別為84.2%與27.5%，表明冷水紅對灰飛虱具有極佳的抗生性。2012年以水稻灰飛虱高感品種武育粳3號為母本，灰飛虱高抗生性品種冷水紅為父本，配制雜種Fl，構(gòu)建了包含214個單株的F2分離群體，2013年秋季通過F2單株自交獲得214個F2:3家系。
[0022]二、對F2:3家系采用水稻灰飛虱抗生性鑒定，獲得各家系的抗生性測驗值；
2014年，采用同步驟一的抗生性方法檢測F2:3家系對灰飛虱的抗生性，獲得各家系的抗生性測驗值。
[0023]三、SSR標(biāo)記分析:
(I)采用CTAB微量法提取親本、Fl及F2:3定位群體單株的DNA;
(2 )用實驗室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的821對SSR引物(含128對自行合成引物)，對親本、Fl及F2:3定位群體進行PCR擴增尋找兩兩之間同時具有穩(wěn)定多態(tài)性的引物，用篩選到的204對多態(tài)性分子標(biāo)記檢測F2:3家系；
(3)CTAB微量法提取親本、Fl及F2:3定位群體單株的DNA的具體流程為:取0.3-0.5g新鮮的水稻葉片，于液氮中研成粉;將凍粉轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，立即加入500yL DNA提取緩沖液，置65°C溫浴20min;加入700yL氯仿/異丙醇，輕緩顛倒離心管混勻，12000r/min離心1min；轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，加入600yL異丙醇，12000r/min離心5min；棄上清液，加入600yL的70%乙醇，12000r/min離心5min ；棄70%乙醇，風(fēng)干;加0.2mL TE，溶解后4°C保存；
(4)對親本、FI及F2:3定位群體進行PCR擴增的PCR反應(yīng)體系為:總體積為10μL，1mMTris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，50μΜ dNTPs，0.2μΜ引物，0.5U Taq 酶和 20ngDNA模板;PCR擴增程序為:94 °C預(yù)變性5min ； 94 °C變性Imin，55 V退火復(fù)性Imin，72 °C延伸1.5min，共35個循環(huán);最后72°C保溫1min;擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)銀染檢測；
(5)聚丙烯酰胺凝膠電泳的具體方法為:10ml8%凝膠工作液配方為:ddH20 70ml，10*TBE 1ml，40%丙烯酰胺(19:1 )20ml，TEMED 10ul ,10% AP 100ul;其中，10*TBE是將 108gTris堿和55g硼酸先溶解于蒸餾水，加40ml 0.5mol/L EDTA(PH為8.0)，再加ddH20定容到1000ml; 19:1(10ml)丙烯酰胺是將38g丙烯酰胺和2g N，，N亞甲雙丙烯酰胺溶解于ddH20，定容至100ml，過濾后4°C保存。
[0024]四、抗性QTL定位:
(1)根據(jù)定位群體各單株分子標(biāo)記多態(tài)性檢測結(jié)果，并結(jié)合其抗性表型參數(shù)，用Mapmaker/Exp3.0軟件進行基因和分子標(biāo)記位點的遺傳連鎖分析，利用Kosambi作圖函數(shù)將交換率轉(zhuǎn)換為遺傳距離(CM);
(2)米用基于復(fù)合區(qū)間作圖法軟件WindowsQTL Cartographer V2.5檢測水稻灰飛虱的抗生性QTL，LOD值的閾值定為2.5，在5%的總體顯著水平下檢測QTL，檢測抗性QTL的數(shù)目及其在染色體上的位置； (3)在4號染色體上檢測到I個水稻灰飛虱抗性QTL，LOD值為4.48，貢獻率為31.2%，命名為Qsbph4a，位于第4號染色體分子標(biāo)記RM1018引物與分子標(biāo)記RM7187引物之間。
[0025]五、通過檢測第4號染色體上該兩個引物標(biāo)記的帶型數(shù)據(jù)，預(yù)測植株對灰飛虱抗生性水平:
用分子標(biāo)記RM1018引物或者用分子標(biāo)記RM7187引物擴增水稻灰飛虱抗性鑒定材料，如果用分子標(biāo)記RM1018引物能夠擴增出160bp的擴增片段，或用分子標(biāo)記RM7187引物能夠擴增出157bp的擴增片段(如圖2)，則標(biāo)志著水稻材料內(nèi)存在灰飛虱抗生性位點Qsbph4a，通過檢測Qsbph4a的存在可以預(yù)測該植株對水稻灰飛虱的抗生性水平，大大提高灰飛虱抗生性水稻的選擇效率。
[0026]上述實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。
【主權(quán)項】
1.水稻品種冷水紅灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法，其特征在于:用分子標(biāo)記RM1018引物:SEQ ID N0.l/SEQ ID N0.2，或者用分子標(biāo)記RM7187引物:SEQ ID N0.3/SEQID N0.4擴增水稻灰飛虱抗性鑒定材料，如果用分子標(biāo)記RM1018引物:SEQ ID N0.l/SEQ IDN0.2能夠擴增出160bp的擴增片段，或用分子標(biāo)記RM7187引物:SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4能夠擴增出157bp的擴增片段，則標(biāo)志著水稻材料內(nèi)存在灰飛虱抗生性位點Qsbph4a。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻品種冷水紅灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法，其特征在于所述的分子標(biāo)記方法包含以下步驟: (1)以水稻灰飛虱高感品種武育粳3號為母本，灰飛虱高抗生性品種冷水紅為父本，配制雜種Fl，構(gòu)建了包含214個單株的F2分離群體，通過F2單株自交獲得214個F2:3家系； (2)對F2:3家系采用水稻灰飛虱抗生性鑒定，獲得各家系的抗生性測驗值； (3)采用CTAB微量法提取親本、Fl及F2:3定位群體單株的DNA; (4)用實驗室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的821對SSR引物(含128對自行合成引物)，對親本、Fl及F2:3定位群體進行PCR擴增尋找兩兩之間同時具有穩(wěn)定多態(tài)性的引物，用篩選到的204對多態(tài)性分子標(biāo)記檢測F2:3家系； (5)根據(jù)定位群體各單株分子標(biāo)記多態(tài)性檢測結(jié)果，并結(jié)合其抗性表型參數(shù)，用Mapmaker/Exp3.0軟件進行基因和分子標(biāo)記位點的遺傳連鎖分析，利用Kosambi作圖函數(shù)將交換率轉(zhuǎn)換為遺傳距離(CM); (6)米用基于復(fù)合區(qū)間作圖法軟件WindowsQTL Cartographer V2.5檢測水稻灰飛虱的抗生性QTL，LOD值的閾值定為2.5，在5%的總體顯著水平下檢測QTL，檢測抗性QTL的數(shù)目及其在染色體上的位置； (7)獲得水稻灰飛虱高抗生性品種冷水紅抗生性基因位點Qsbph4a，位于第4號染色體分子標(biāo)記RM1018引物與分子標(biāo)記RM7187引物之間，通過檢測第4號染色體上該兩個引物標(biāo)記的帶型數(shù)據(jù)，可以預(yù)測該植株灰飛虱的抗生性，大大提高灰飛虱抗生性水稻的選擇效率。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水稻品種冷水紅灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法，其特征在于所述的水稻灰飛虱抗生性鑒定的具體方案為:將催芽后的水稻種子播于直徑為6cm、高15cm的無色透明玻璃杯中，每個品種5株，重復(fù)3次，待秧苗長至1.5_2.0葉，每杯接入1-2齡的灰飛虱若蟲約25頭，紗布封口，10天后統(tǒng)計每個杯子剩余的蟲數(shù)，計算灰飛虱若蟲的殘存率，作為抗生性測驗值。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水稻品種冷水紅灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法，其特征在于所述的用CTAB微量法提取親本、Fl及F2:3定位群體單株的DNA的具體流程為:取0.3-0.5g新鮮的水稻葉片，于液氮中研成粉;將凍粉轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，立即加入500yL DNA提取緩沖液，置65°C溫浴20min;加入700yL氯仿/異丙醇，輕緩顛倒離心管混勻，12000r/min離心1min;轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，加入600yL異丙醇，12000r/min離心5min;棄上清液，加入600yL的70%乙醇，12000r/min離心5min ；棄70%乙醇，風(fēng)干；加0.2mL TE，溶解后4°C保存。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水稻品種冷水紅灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法，其特征在于所述的對親本、Fl及F2: 3定位群體進行PCR擴增的PCR反應(yīng)體系為:總體積為1yL，1mM Tris-HCl pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2,50μΜ dNTPs，0.2μΜ 引物，0.5U Taq 酶和20ng DNA模板;PCR擴增程序為:94°C預(yù)變性5min;94°C變性lmin，55°C退火復(fù)性lmin，72°C延伸1.5min，共35個循環(huán);最后72°C保溫1min;擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)銀染檢測。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的水稻品種冷水紅灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法，其特征在于所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳的具體方法為:100ml 8%凝膠工作液配方為:ddH2070ml，10*TBE 1ml，40%丙烯酰胺(19: l)20ml，TEMED 10ul，10%AP 100ul;其中，10*TBE是將108g Tris堿和55g硼酸先溶解于蒸饋水，加40ml 0.5mol/L EDTACPH 8.0)，再加ddifeO定容到100ml; 19:1(10ml)丙烯酰胺是將38g丙烯酰胺和2g N，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶解于ddH20，定容至100ml，過濾后4°C保存。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻品種冷水紅灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法，其特征在于所述的擴增灰飛虱抗生性位點Qsbph4a的分子標(biāo)記引物選自分子標(biāo)記RM1018引物:SEQ ID N0.l/SEQ ID N0.2和分子標(biāo)記RM7187引物:SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的水稻品種冷水紅灰飛虱抗生性位點及其分子標(biāo)記方法，其特征在于所述的分子標(biāo)記引物在水稻育種中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的分子標(biāo)記引物在快速篩選灰飛虱高抗生性水稻品種或品系中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861722SQ201610381385
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月2日
【發(fā)明人】王紀(jì)芝
【申請人】王紀(jì)芝