一種茶樹咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因組編輯載體的構(gòu)建方法
【專利摘要】一種茶樹咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因組編輯載體的構(gòu)建方法，是以茶樹咖啡因合成酶基因為基礎(chǔ)設(shè)計兩條靶序列T1和T2；再分別構(gòu)建靶序列T1和和T2的sgRNA表達盒；再將雙元表達載體pYLCRISPR/Cas9P35S?H與上述T1sgRNA表達盒及T2sgRNA表達盒進行酶切?連接反應(yīng)，使T1sgRNA表達盒與T2sgRNA表達盒連接后插入該雙元表達載體中，從而獲得CRISPR/Cas9基因組編輯載體。本發(fā)明以茶樹咖啡因合成酶為例，聯(lián)合采用常規(guī)PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技術(shù)，構(gòu)建了包含茶樹咖啡因合成酶雙靶點的CRISPR/Cas9基因編輯載體，為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在茶樹中的應(yīng)用奠定了堅實基礎(chǔ)，同時對其它植物CRISPR/Cas9基因編輯載體的構(gòu)建提供了技術(shù)支撐。
【專利說明】
一種茶樹咖啡因合成酶CRI SPR/Cas9基因組編輯載體的構(gòu)建 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種茶樹咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因組 編輯載體的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 茶樹是我國重要的木本經(jīng)濟作物，在我國國民經(jīng)濟中占有重要地位。我國不僅是 世界上茶葉資源最豐富的國家，也是世界上茶葉資源最大的生產(chǎn)國、消費國和貿(mào)易國。然 而，我國具有多抗及高品質(zhì)的優(yōu)良茶樹品種不多。雖然我國一直非常重視茶樹的品種改良 工作，但由于茶樹具有生長周期長、自交不親和的特性，使得采用常規(guī)育種技術(shù)難以實現(xiàn)茶 樹育種工作取得突破性的進展。近年來分子育種及基因工程等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在水 稻、西紅柿、馬鈴薯等農(nóng)作物品種改良中發(fā)揮了重要作用，也為茶樹育種提供了新的途徑。 所以，茶樹分子生物學(xué)研究成為了茶葉科學(xué)中最活躍和進展最快的一個領(lǐng)域。近年來，茶樹 轉(zhuǎn)錄組測序工作取得了重要進展，目前Genbank已收錄了約35萬條茶樹mRNA序列，幾乎涵蓋 了茶樹中所有功能基因編碼序列。此外，我國茶樹的全基因組測序工作也于幾年前在數(shù)家 單位開始啟動，并已相繼完成，茶樹全基因組序列將會在短期內(nèi)釋放。然而，像其它植物一 樣，面對大量的基因序列，我們對其功能了解卻是非常缺少，從而制約了基因資源的利用。 因此，確定茶樹新基因的功能并高效利用新基因是未來茶樹分子生物學(xué)研究中一個非常重 要的主題，也就是說茶樹后基因組時代即將降臨。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的突飛猛進，新型 基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9)將會在茶樹功能基因研究中發(fā)揮重要作用，預(yù)計 將成為茶樹后基因組時代不可或缺的研究工具。
[0003] 基因組定點編輯技術(shù)是分子育種、基因的功能研究和遺傳改造等重要工具，是通 過某種途徑對基因組DNA特定位點進行改造的一種手段。迄今為止，應(yīng)用時間比較長的基因 組編輯技術(shù)有鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFN)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸 (Transcription activator-likeeffector nucleases，TALEN)技術(shù)。但由于這兩項技術(shù) DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的改造較為復(fù)雜，對每一個基因位點的編輯都需要重新設(shè)計、合成和組裝2 個核酸酶，載體構(gòu)建困難，成為限制其發(fā)展的瓶頸?？茖W(xué)家一直在尋找精確而簡單的基因組 編輯方法，直到2013年發(fā)現(xiàn)了〇?13?1?/^ &89技術(shù)。〇?13?1?/^&89技術(shù)是通過一段1?熟來識別靶 位點，因而在設(shè)計和構(gòu)建上更加簡單，只需合成一個sgRNA就能實現(xiàn)對基因的特異性編輯。 CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，立即在整個生命科學(xué)領(lǐng)域掀起了席卷世界的一股"風(fēng)暴"，短短幾 年內(nèi)該技術(shù)迅速應(yīng)用于世界各地的實驗室，并成為基因組定點編輯的首選技術(shù)。
[0004] CRISPR/Cas廣泛存在于古生菌和細菌的基因組中，屬自身免疫系統(tǒng)，可降解入侵 的病毒或質(zhì)粒DNA。在該免疫系統(tǒng)中，Cas蛋白（CRISP-associated protein)含有兩個核酸 酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割兩條DNA鏈，切割后DNA雙鏈斷裂從而使入侵的外源DNA降解。 CRISPR/Cas系統(tǒng)的組成結(jié)構(gòu)比較固定，由CRISPR序列與Cas基因家族組成，其中CRISPR由一 系列高度保守的重復(fù)序列(Repeat)與間隔序列（Spacer)相間排列組成，間隔序列可特異識 別外源DNA。在CRISPR序列附近存在高度保守的CRISPR相關(guān)基因，這些基因編碼的蛋白具有 核酸酶功能，可以對DNA序列進行特異性切割。
[0005] CRISPR系統(tǒng)分為3種類型，現(xiàn)在常用的CRISPR/Cas系統(tǒng)由類型n系統(tǒng)改造而來。類 型II系統(tǒng)的特征性蛋白為Cas9蛋白，具有加工產(chǎn)生CRISPR RNA(crRNA)和切割雙鏈DNA功 能。crRNA(CRI SPR-derived RNA)通過喊基配對與tracrRNA( trans-activat ing RNA)結(jié)合 形成tracrRNA/crRNA復(fù)合體，此復(fù)合體一旦形成就能引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對 的序列靶位點剪切雙鏈DNA。而tracrRNA/crRNA復(fù)合體可通過人工設(shè)計，融合crRNA與 tracrRNA形成sgRNA(single-guided RNA)，sgRNA足以引導(dǎo)Cas9對DNA的定點切割。sgRNA可 以通過載體表達或者化學(xué)合成后與Cas9蛋白共同進入細胞，對特異DNA序列剪切，從而促使 DNA發(fā)生NHEJ(nonhomologous end-joining)導(dǎo)致的基因缺失或同源重組，實現(xiàn)基因敲除， 結(jié)合參見圖1<XRISPR-Cas9體系的RNA-DNA識別機制為選擇性基因組編輯提供了一個簡便 而強大的工具。來自Streptococcus pyogenes的Cas9由于識別序列僅為2個堿基(GG)，幾乎 可以在所有的基因中找到大量靶點，因此得到廣泛的應(yīng)用。Cas9蛋白在目前測試過的幾乎 所有生物和細胞中均有活性，包括細菌、酵母、植物、魚、以及哺乳動物細胞。該體系其中一 個最重要的優(yōu)勢是Cas9蛋白可在多個不同的sgRNA的引導(dǎo)下同時修飾多個基因組靶點。
[0006] 目前植物CRISPR/Cas9系統(tǒng)已日趨完善，已在十多種植物中成功實現(xiàn)了定點基因 組編輯，除了在本氏煙草擬南芥等模式植物上獲得了成功，很快在小麥、玉米、水稻、高粱、 西紅柿以及甜橙等作物上也成功實現(xiàn)了 CRISPR/Cas9的應(yīng)用。最近，先后利用CRISPR/Cas9 技術(shù)實現(xiàn)了木本植物楊樹和觀賞植物牽牛花基因組的定點編輯，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植 物中應(yīng)用推上了新的領(lǐng)域。
[0007] 然而，到目前為止尚未見有關(guān)CRISPR/Cas9技術(shù)在茶樹上的應(yīng)用報道，其中一個重 要的原因是針對茶樹的CRI SPR/Cas9基因編輯載體構(gòu)建技術(shù)尚不完善。本發(fā)明以茶樹中咖 啡因合成酶基因為例，建立了茶樹CRISPR/Cas9基因編輯載體的構(gòu)建方法，為CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在茶樹中的應(yīng)用奠定了堅實基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種茶樹咖啡因 合成酶CRISPR/Cas9基因組編輯載體的構(gòu)建方法，為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在茶樹中的 應(yīng)用奠定了堅實基礎(chǔ)。
[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種茶樹咖啡因合成酶 CRISPR/Cas9基因組編輯載體的構(gòu)建方法，該方法步驟如下：
[0010] 1)以茶樹咖啡因合成酶基因為基礎(chǔ)設(shè)計兩條靶序列，其中：
[0011] 靶序列T1 為：5'-CTCACAAGCAGAGAAGGCT-3'（SEQ ID No. 1)，靶序列T2為5'_ ATATCACTGCTGTGGCAGC-3'（SEQ ID No.2);
[0012] 2)構(gòu)建靶序列T1和和T2的sgRNA表達盒：
[0013]以PYLgRNA-AtU3d-LacZ質(zhì)粒為模板進行第一輪PCR反應(yīng)，獲得sgRNA表達的啟動子 片段和連接T1靶序列的gRNA片段，再通過重疊PCR(0verlapping PCR)反應(yīng)將該啟動子片段 與gRNA片段連接，以組裝成TlsgRNA表達盒；
[0014] 以pYLgRNA-AtU3b質(zhì)粒為模板進行第一輪PCR反應(yīng)，獲得sgRNA表達的啟動子片段 和連接T2靶序列的gRNA片段，再通過重疊PCR反應(yīng)將該啟動子片段與gRNA片段連接，以組裝 成T2sgRNA表達盒；
[0015] 3)利用限制性內(nèi)切酶Bsal-HF和連接酶T4DNA ligase，將雙元表達載體 pYLCRISPR/Cas9P35S-H與上述TlsgRNA表達盒及T2sgRNA表達盒進行酶切-連接反應(yīng)，使 TlsgRNA表達盒與T2sgRNA表達盒連接后插入該雙元表達載體中，從而獲得CRISPR/Cas9基 因組編輯載體。
[0016] 上述步驟2)中構(gòu)建TlsgRNA表達盒的第一輪PCR反應(yīng)包括二個PCR反應(yīng)，第一個PCR 反應(yīng)使用的引物序列如SEQ ID No. 3和SEQ ID No.6所示，第二個PCR反應(yīng)使用的引物序列 如5￡0 10如.5和5￡0 10如.4所示；重疊？〇?反應(yīng)使用的引物序列如5￡0 10如.9和5￡0 10 No.10；
[0017] 構(gòu)建T2sgRNA表達盒的第一輪PCR反應(yīng)包括二個PCR反應(yīng)，第一個PCR反應(yīng)使用的引 物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.8所示，第二個PCR反應(yīng)使用的引物序列如SEQ ID No.7 和SEQ ID No.4所示；重疊PCR反應(yīng)使用的引物序列如SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示。 [0018] 所述步驟2)中構(gòu)建TlsgRNA和T2sgRNA表達盒的第一輪PCR反應(yīng)時的反應(yīng)體系為： H20 13 ? 65yL、10 X Buffer2yL、2mM的dNTP 1 ? 5yL、25mM的MgS〇4〇 ? 6yL、5mM的正向引物0 ? 6yL、 5mM的反向引物0.6yL、模板0.75yL、lU/yL的KOD-Plus酶0.3yL，總體積20yL;反應(yīng)程序：94°C 預(yù)變性 3min，30 個循環(huán)，94°C 20s，58 °C 20s，68 °C 25s。
[0019] 所述步驟2)中構(gòu)建TlsgRNA和T2sgRNA表達盒的重疊PCR反應(yīng)時的反應(yīng)體系： H2019 ? 4此、10 X Buffer 3此、2mM的dNTP3yL、25mM的MgSCkl ? 2此、10mM的正向引物0 ? 9yL、 10mM的反向引物0.9yL、稀釋10倍的第一輪PCR產(chǎn)物lyL、lU/yL的KOD-Plus酶0.6yL，總體積 30yL;反應(yīng)程序：94°C 預(yù)變性 5min，22 個循環(huán)，94°C 25s，58 °C 25s，68 °C 30s。
[0020] 本發(fā)明首次建立了茶樹CRISPR/Cas9基因編輯載體的構(gòu)建方法，為CRISPR/Cas9基 因編輯技術(shù)在茶樹中的應(yīng)用奠定了堅實基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0021] 圖1是CRISPR/Cas9工作原理圖。
[0022] 圖2是sgRNA設(shè)計；"一"連接處含有內(nèi)含子序列，GG表示PAM識別位點，下劃線標(biāo)記 的序列為候選靶序列。
[0023] 圖 3是.pYLgRNA-AtU3d-LacZ，pYLgRNA-AtU3b 和 pYLCRI SPR/Cas9P35S-H 質(zhì)粒電泳 圖。
[0024] 其中：a表不.pYLgRNA-AtU3d_LacZ質(zhì)粒；b表不pYLgRNA_AtU3b質(zhì)粒；c表不 pYLCRISPR/Cas9P35S-H 質(zhì)粒。
[0025]圖4是sgRNA表達盒的構(gòu)建流程圖。
[0026]圖5是第一、二輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖。
[0027] 其中:M為marker，Tl為針對靶序列T1的PCR，T2為針對靶序列T2的PCR，T1P和T2P表 示第一輪PCR產(chǎn)物混合后進行了純化。
[0028] 圖6是Golden gate cloning組裝茶樹CRISPR/Cas9基因組編輯載體。
[0029] 圖7是連接產(chǎn)物及質(zhì)粒酶切電泳圖。
[0030] 其中：L為連接產(chǎn)物，TCA為TCA基因編輯載體，C表示pYLCRI SPR/Cas9P35S-H空載 體，M為marker。
[0031]圖8是TCA基因編輯載體部分測序圖。
[0032]圖9是TCA基因編輯載體測序結(jié)果。
[0033] 其中：深灰色背景為AtU3d啟動子序列，淺灰色背景為AtU3b啟動子序列，前后加黑 斜體序列分別為靶序列T1和靶序列T2,下劃線標(biāo)記的序列為sgRNA的3'區(qū)域保守結(jié)構(gòu)序列。
【具體實施方式】 [0034] 1.材料與方法
[0035] 雙元表達載體pYLCRISPR/Cas9P35S-H，GeneBank登錄號為AY310901，是在雙元載 體質(zhì)粒pCAMBIA1300(ACCESSI0N:AF234296)的基礎(chǔ)上進行改造而來的，由花椰菜花葉病毒 (CaMV)35S啟動子驅(qū)動Cas9p序列的表達。該質(zhì)粒在E.coli T0P10F'（Laclq)菌株繁殖，該菌 株Laclq基因型產(chǎn)生的阻礙蛋白可抑制ccdB大腸桿菌致死基因的表達。植物CRISPR/sgRNA 載體pYLgRNA-AtU3d-LacZ(KR029100 ? 1)和pYLgRNA-AtU3b(KR029097 ? 1)，為植物CRISPR/ Cas9基因編輯載體的中間載體，分別提供small nuclear(sn)RNA U3d和U3b啟動子序列，驅(qū) 動sgRNA的表達并保證轉(zhuǎn)錄出的sgRNA停留在細胞核中與Cas9結(jié)合，且二者均提供長度為 57nt的sgRNA3'區(qū)域保守結(jié)構(gòu)序列，可與靶基因的20nt靶序列組裝成sgRNA。此外，pYLgRNA-AtU3d_LacZ還提供了LacZ標(biāo)記基因（198bp)的表達元件，可在含有X-gal的培養(yǎng)基產(chǎn)生藍色 菌斑篩選陽性克隆。
[0036] 本文所需引物序列如表1所示，引物合成與序列測序均由上海生工生物工程技術(shù) 服務(wù)公司完成，測序引物使用TCA-SP-L2和TCA-SP-R-C。
[0037]表1所需引物序列
[0039] 2 .sgRNA序列設(shè)計及分析
[0040]為提高打靶效率針對TCS基因設(shè)計2個靶點，設(shè)計靶點遵循如下原則：目的基因的 正鏈和負(fù)鏈靶點的打靶效率大致相同，都可以設(shè)計靶點；靶點的GC%盡量不要低于40%，靶 點序列6(：%偏高(50-70%)有較高的打靶效率;靶點內(nèi)（按5-吧0如6-3方向）不要有連續(xù)4個 以上的T，以防RNA Pol III將其作為轉(zhuǎn)錄終止信號；雖然非特異打靶(脫靶)對植物基因打 靶不是很重要的問題，但應(yīng)進行靶點特異性分析，用靶點+NGG(前后各加幾十堿基)與茶樹 轉(zhuǎn)錄組做blast分析，避免使用與同源序列差異少于5個堿基的靶點(在切點附近和PAM可有 2個堿基差異就具有特異性）。把靶點序列連接到s g R N A序列的5 '端（靶序列+ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT TTTTTT)，做二級結(jié)構(gòu)分析。
[0041 ] 3 ?采用常規(guī)PCR和Overlapping PCR構(gòu)建sgRNA表達盒
[0042] 3.1Target lsgRNA(TlsgRNA)構(gòu)建
[0043] 3.1.1第一輪 PCR
[0044] 以2-5ng PYLgRNA-AtU3d-LacZ質(zhì)粒為模板分別進行兩個PCR反應(yīng)，在第一個PCR反 應(yīng)中使用引物TCA-U-F(上游引物）和TCAU3dT 1 (下游引物），第二個PCR反應(yīng)使用引物 TCAgRT 1 (上游引物)和TCA-gR-R(下游引物）。第一個PCR和第二個PCR反應(yīng)分別在兩個PCR管 中進行，采用相同的PCR反應(yīng)體系和相同的PCR反應(yīng)程序。將第一個和第二個PCR反應(yīng)的產(chǎn)物 混合后，取3yL PCR產(chǎn)物，電泳檢查產(chǎn)物長度是否符合預(yù)期。
[0045] 上述PCR反應(yīng)體系，總體積20yL:H20 13.65yL、10XBuffer 2yL、2mM的dNTP1.5yL、 25mM的 MgS040.6yL、5mM的正向引物0.6yL、5mM的反向引物0.6yL、模板0.75yL、lU/yL 的 K0D-Plus酶0.3yL〇
[0046] 上述 PCR 反應(yīng)程序：94°C 預(yù)變性 3min，30 個循環(huán)，94°C 20s，58 °C 20s，68 °C 25s。
[0047] 3.1.2第二輪 PCR
[0048] 取第一輪PCR中的二次PCR反應(yīng)產(chǎn)物混合后所得的第一輪PCR產(chǎn)物U3dTl-gRNAlyL， 用H20稀釋10倍;再取lyL稀釋的第一輪PCR產(chǎn)物U3dTl-gRNA作為模板，以TCA-Pps-R-C和 TCA-Pgs-GG2分別作為上、下游引物，PCR擴增U3dTl-gRNA。取3yL PCR產(chǎn)物，電泳檢查產(chǎn)物長 度是否符合預(yù)期，并估計樣品的大致濃度。
[0049]采用的PCR反應(yīng)體系，總體積30yL:H20 19.4yL、10XBuffer 3yL、2mM的dNTP3yL、 25mM的MgSCk 1.2yL、10mM的正向引物0.9yL、10mM的反向引物0.9yL、稀釋10倍的第一輪PCR 產(chǎn)物 lyL、lU/yL 的KOD-Plus 酶0 ? 6yL。
[0050]采用的 PCR 反應(yīng)程序：94°C 預(yù)變性 5min，22 個循環(huán)，94°C 25s，58 °C 25s，68 °C 30s。
[0051 ] 3.2Target 2sgRNA(T2sgRNA)構(gòu)建 [0052] 3.2.1第一輪 PCR
[0053] 分別取2-5ng pYLgRNA-AtU3b質(zhì)粒作為模板進行二個PCR反應(yīng)，在第一個PCR反應(yīng) 中使用引物TCA-U-F (上游引物)和TCAU3bT2 (下游引物），第二個PCR反應(yīng)使用引物TCAgRT2 (上游引物)和TCA-gR-R(下游引物）。TCA-U-F/TCAU3bT2擴出U3bT2序列，TCAgRT2/TCA-gR-R 擴出T2sgRNA序列。反應(yīng)完畢，將兩個反應(yīng)的產(chǎn)物混合，取3yLPCR產(chǎn)物，電泳檢查產(chǎn)物長度是 否符合預(yù)期。
[0054] 采用的 PCR 反應(yīng)體系，總體積 20yL:H2013.65yL、10XBuffer2yL、2m]\^dNTP1.5yL、 25mM的MgSCkO. 6yL、5mM的正向引物0.6yL、5mM的反向引物0.6yL、模板0.7 5yL、1U/yL的K0D-Plus酶0.3yL〇
[0055] 采用的 PCR 反應(yīng)程序：94°C 預(yù)變性 3min，30 個循環(huán)，94°C 20s，58 °C 20s，68 °C 25s。
[0056] 3.2.2第二輪卩0?
[0057] 取第一輪PCR中的二次PCR反應(yīng)產(chǎn)物混合后所得的第一輪PCR產(chǎn)物U3bT2-gRNAlyL， 用H20稀釋10倍;再取1此稀釋的第一輪PCR產(chǎn)物U3bT2-gRNA作為模板，以TCA-Pps-GG2和 TCA-Pgs-L-C為引物，PCR擴增U3bT2-gRNA。取3yL電泳檢查產(chǎn)物長度是否符合預(yù)期。
[0058] 采用的？^?反應(yīng)體系，總體積30此:112〇19.4此、10\8吐€613此、2111]\1的(1階？3此、 25mM的MgSOU . 2yL、10mM的正向引物0.9yL、10mM的反向引物0.9此、稀釋10倍的第一輪PCR 產(chǎn)物 lyL、lU/yL 的KOD-Plus 酶0 ? 6yL。
[0059] 采用的 PCR 反應(yīng)程序：94°C 預(yù)變性 5min，22 個循環(huán)，94°C 25s，58 °C 25s，68 °C 30s。
[0060] 4 ?組裝 sgRNA 表達盒到 pYLCRISPR/Cas9 載體
[0061 ] 4.1雙元表達載體pYLCRISPR/Cas9P35S-H與sgRNA表達盒的酶切-連接反應(yīng)
[0062] 于上述通過常規(guī)PCR和Overlapping PCR構(gòu)建好的TlsgRNA和T2sgRNA表達盒中分 別加入9倍體積的無水乙醇混勾，室溫下12000rpm/min離心10min，去上清，加入lmL70%質(zhì) 量濃度的乙醇洗沉淀1次，室溫下12000rpm/min離心3min，去上清，37°C干燥30min，各加入 30此無菌水。使用雙元表達載體與sgRNA表達盒的酶切-連接反應(yīng)體系進行酶切、連接。反應(yīng) 程序:37°C孵育lmin，16°C孵育lmin，30個循環(huán)，最后75°C滅活內(nèi)切酶5min。酶切-連接產(chǎn)物 加入9倍體積的無水乙醇混勾，室溫下12000rpm/min離心10min，去上清，加入lmL70%質(zhì)量 濃度的乙醇洗沉淀1次，室溫下12000rpm/min離心3min，去上清，37°C干燥30min，各加入lOy L無菌水。
[0063] 上述提及的雙元表達載體與sgRNA表達盒的酶切-連接反應(yīng)體系：10 X CutSmart Buffer 3yL、10mM ATP 3yL、pYLCRISPR/Cas9質(zhì)粒 160ng、TlsgRNA表達盒30ng、T2sgRNA表達 盒30ng、BsaI_HF lyL、T4DNA ligase 0.2iiL、H2〇加至30此〇 [0064] 4.2酶切-連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與質(zhì)粒提取
[0065] 從-80°C冰箱中取出50yL DH 5a感受態(tài)細胞，放置在冰上直至融化，取8yL連接產(chǎn) 物加入DH 5a感受態(tài)細胞離心管，輕輕小彈離心管使之混勻，冰浴20min，于42°C水浴中熱擊 90s后，迅速將管子移到冰中放置2min，加入平衡至室溫的750yLLB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 45min，取 100yL菌液涂到含50yg/mLKan、0.5mM IPTG和40yg/mL X-gal的LB平板，將平板于 37 °C倒置過夜培養(yǎng)，挑取藍斑菌落，于3mL含50yg/mLKan的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜， 使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，使用Mlu頂每切驗證，挑取正確質(zhì)粒進行測序驗證。
[0066] 5 ?結(jié)果與分析
[0067] 5.1sgRNA 設(shè)計
[0068] sgRNA序列全長97nt，分為兩部分，5'決定靶序列的20nt種子序列（seed sequence)和3'區(qū)域為保守的結(jié)構(gòu)序列。因此構(gòu)建針對特定革EU立點的sgRNA，只需要克隆決 定革G序列的5 '端20nt。從genbank中下載茶樹TCA基因組序列和cDNA序列，分析其內(nèi)含子所 在區(qū)域。結(jié)果表明（如圖2所示），TCS1基因含3個內(nèi)含子。在此基礎(chǔ)上搜尋TCA的CRISPR/Cas9 靶序列，結(jié)果共搜尋到18個不含內(nèi)含子的候選靶序列。對18個候選靶序列進行結(jié)構(gòu)分析，靶 序列與sgRNA序列產(chǎn)生連續(xù)配對7bp以上會抑制其與染色體DNA靶序列結(jié)合靶點，因此要避 免使用連續(xù)配對7bp以上的靶序列。分析結(jié)果表明，在TCA1基因0RF內(nèi)的靶序列 "CTCACAAGCAGAGAAGGCT"（設(shè)為靶序列T1，如SEQ ID No. 1所示）和非編碼區(qū)內(nèi)靶序列 "八丁厶1^^〇'6(^6了660460；'（設(shè)為靶序列了2，如3￡0 10如.2所示)較為理想，能作為881?祖序列 的seed sequence〇
[0069] 5 ? 2pYLgRNA-AtU3d-LacZ、pYLgRNA-AtU3b 和 pYLCRISPR/Cas9P35S-H 質(zhì)粒提取
[0070] 將分別含有 PYLgRNA-AtU3d-LacZ、pYLgRNA-AtU3b 和 pYLCRISPR/Cas9P35S-H 質(zhì)粒 的菌劃線活化，挑取單菌搖菌，采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。電泳結(jié)果表明，提取的質(zhì)粒 符合下一步實驗的要求。
[0071] 5.3sgRNA表達盒的構(gòu)建
[0072] sgRNA需要在植物細胞內(nèi)合成從而指導(dǎo)Cas9蛋白編輯革巴基因，而sgRNA的合成是通 過sgRNA表達盒來完成，sgRNA表達盒由啟動子序列和gRNA序列組成。pYLgRNA載體 (PYLgRNA-AtU3d-LacZ、pYLgRNA-AtU3b)提供了不同的snRNA啟動子可在植物細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄 gRNA，并使gRNA停留在細胞核內(nèi)發(fā)揮其功能。此外，pYLgRNA載體還提供gRNA中保守序列。因 此，以pYLgRNA質(zhì)粒為模板，通過常規(guī)PCR可以獲得snRNA啟動子序列和gRNA中保守序列，而 gRNA中5 '段的種子序列在引物合成時導(dǎo)入，聯(lián)合應(yīng)用常規(guī)PCR和overlapping PCR將啟動子 序列和gRNA序列組裝在一起（如圖4)。如圖5所示，針對靶序列T1的第一輪PCR獲得了一個 360bp和一個130bp左右的片段，分別為U3d啟動子和連接T1靶序列的gRNA;而針對靶序列T2 的第一輪PCR獲得了一個380bp和一個130bp左右的片段，分別為U3b啟動子和連接T2靶序列 的gRNA;針對靶序列T1的第二輪PCR將U3d啟動子片段和gRNA片段2個分離的片段連接在一 起組裝成TlsgRNA表達盒;針對靶序列T2的第二輪PCR將U3b啟動子片段和gRNA片段2個分離 的片段連接在一起組裝成T2sgRNA表達盒。
[0073] 5.4TlsgRNA和T2sgRNA表達盒的拼接及與Cas9雙元表達載體的組合
[0074] TlsgRNA和T2sgRNA兩個單獨的表達盒構(gòu)建好后，需要將兩個表達盒拼接在一起， 并且插入Cas9雙元表達載體中，以便通過農(nóng)桿菌的介導(dǎo)整合到茶樹基因組中，從而在茶樹 細胞內(nèi)進彳丁表達，獲得Cas9和gRNA，進而對目標(biāo)基因進彳丁編輯。我們應(yīng)用Golden gate cl on ing技術(shù)，一步完成sgRNA表達盒的拼接及與Cas9雙元表達載體的組合，從而獲得 CRISPR/Cas編輯載體（圖6)。如圖7所示，酶切、連接產(chǎn)物可見一條980bp左右的電泳條帶，表 明T1 sgRNA和T2sgRNA表達盒連接成功，同時還可見一條MOOObp的電泳條帶，說明T1 sgRNA 和T2sgRNA表達盒可能已組裝進入pYLCRI SPR/Cas9P35S-H雙元表達載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 a后搖菌提取質(zhì)粒，以Mlu頂每切，結(jié)果如圖7所示，可見兩條電泳條帶，其中一條950bp左右 的條帶為TlsgRNA和T2sgRNA連接片段，而pYLCRISPR/Cas9P35S-H雙元表達載體未見950bp 左右的電泳條帶，說明酶切、連接成功，獲得了 TCA CRISPR/Cas9基因編輯載體。
[0075] 5.5測序驗證11^0?13?1?/^389基因編輯載體
[0076]為了進一步驗證TCA CRISPR/Cas9基因編輯載體是否構(gòu)建成功，將獲得的10個質(zhì) 粒送上海生物工程技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果(如圖8)表明，TlsgRNA和T2sgRNA表達盒構(gòu) 建成功，在119bp處檢測到Tl，T2靶序列，緊接靶序列后檢測到gRNA保守序列的存在，同時在 T1和T2靶序列上游分別檢測到U3d和U3b啟動子序列，在TlsgRNA表達盒上游T2sgRNA表達盒 下游均檢測到了pYLCRISPR/Cas9P35S-H雙元表達載體序列，結(jié)合參見圖9。測序結(jié)果表明： TlsgRNA表達盒和T2sgRNA表達盒構(gòu)建成功，并成功組裝入pYLCRISPR/Cas9P35S-H雙元表達 載體，證實TCA CRISPR/Cas9基因編輯載體構(gòu)建成功。
【主權(quán)項】
1. 一種茶樹咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因組編輯載體的構(gòu)建方法，其特征在于，該方 法步驟如下： 1 )以茶樹咖啡因合成酶基因為基礎(chǔ)設(shè)計兩條靶序列，其中靶序列T1為：5'- 2) 構(gòu)建靶序列T1和和T2的sgRNA表達盒： 以PYLgRNA-AtU3d-LacZ質(zhì)粒為模板進行第一輪PCR反應(yīng)，獲得sgRNA表達的啟動子片段 和連接T1靶序列的gRNA片段，再通過重疊 PCR反應(yīng)將該啟動子片段與gRNA片段連接，以組裝 成T1 SgRNA表達盒； 以pYLgRNA-AtU3b質(zhì)粒為模板進行第一輪PCR反應(yīng)，獲得sgRNA表達的啟動子片段和連 接T2靶序列的gRNA片段，再通過重疊 PCR反應(yīng)將該啟動子片段與gRNA片段連接，以組裝成 T2sgRNA表達盒； 3) 利用限制性內(nèi)切酶Bsal-HF和連接酶T4DNA ligase，將雙元表達載體pYLCRISPR/ Cas9P35S-H與上述TlsgRNA表達盒及T2sgRNA表達盒進行酶切-連接反應(yīng)，使TlsgRNA表達盒 與T2sgRNA表達盒連接后插入該雙元表達載體中，從而獲得CRISPR/Cas9基因組編輯載體。2. 如權(quán)利要求1所述的一種茶樹咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因組編輯載體的構(gòu)建方 法，其特征在于，所述步驟2)中構(gòu)建T1 sgRNA表達盒的第一輪PCR反應(yīng)包括二個PCR反應(yīng)，第 一個PCR反應(yīng)使用的引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID如.6所示，第二個?0?反應(yīng)使用的引 物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.4所示；重疊 PCR反應(yīng)使用的引物序列如SEQ ID No.9和 SEQ ID No.10； 構(gòu)建T2sgRNA表達盒的第一輪PCR反應(yīng)包括二個PCR反應(yīng)，第一個PCR反應(yīng)使用的引物序 列如SEQIDNo.3和SEQIDNo.8所示，第二個PCR反應(yīng)使用的引物序列如SEQIDNo.7和 SEQ ID No.4所示；重疊 PCR反應(yīng)使用的引物序列如SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 12所示。3. 如權(quán)利要求2所述的一種茶樹咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因組編輯載體的構(gòu)建方 法，其特征在于，所述步驟2)中構(gòu)建TlsgRNA和T2sgRNA表達盒的第一輪PCR反應(yīng)時的反應(yīng)體 系為：H 20 13 · 65yL、10 X Buffer2yL、2mM的dNTPl · 5yL、25mM的MgS〇4〇 · 6yL、5mM的正向引物 0.6yL、5mM的反向引物0.6yL、模板0.75yL、lU/yL 的KOD-Plus 酶0.3yL，總體積 20yL;反應(yīng)程 序：94°C 預(yù)變性 3min，30 個循環(huán)，94°C 20s，58 °C 20s，68 °C 25s。4. 如權(quán)利要求2所述的一種茶樹咖啡因合成酶CRISPR/Cas9基因組編輯載體的構(gòu)建方 法，其特征在于，所述步驟2)中構(gòu)建TlsgRNA和T2sgRNA表達盒的重疊 PCR反應(yīng)時的反應(yīng)體 系：H20 19 · 4yL、10 X Buffer 3yL、2mM的dNTP3yL、25mM的MgSOU · 2yL、10mM的正向引物0 · 9μ L、lOmM的反向引物0.9yL、稀釋10倍的第一輪PCR產(chǎn)物lyL、lU/yL的KOD-Plus酶0.6yL，總體 積 30yL;反應(yīng)程序：94°C 預(yù)變性 5min，22 個循環(huán)，94°C 25s，58 °C 25s，68 °C 30s。
【文檔編號】C12N15/66GK105821075SQ201610254568
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】劉碩謙, 唐雨薇, 田娜, 劉麗萍, 王若嫻, 梁恒
【申請人】湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)