一種與植物頂端優(yōu)勢相關(guān)的cad1蛋白及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與植物頂端優(yōu)勢相關(guān)的CAD1蛋白 及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物在生長過程中，主莖頂端的生長點(diǎn)活動(dòng)比較活躍，而側(cè)芽的生長發(fā)育卻受到 抑制，而當(dāng)植物去頂后這種現(xiàn)象又會(huì)被解除，這種頂芽抑制側(cè)芽生長發(fā)育的現(xiàn)象被稱為頂 端優(yōu)勢（apical dominance)。幾乎所有的高等植物在生長過程中都有頂端優(yōu)勢，它在植物 植株形態(tài)建成中起著至關(guān)重要的作用，是植物為了適應(yīng)自然環(huán)境、繁衍存活的一種主動(dòng)適 應(yīng)方式。
[0003] 多年來諸多研究表明，植物頂端優(yōu)勢是受多個(gè)基因和多種激素共同調(diào)控的復(fù)雜的 生命現(xiàn)象。頂端優(yōu)勢不僅是植物必需的一種生存機(jī)制，其原理的利用在農(nóng)業(yè)和園藝生產(chǎn)中 也有著重要意義，合理控制植物的頂端優(yōu)勢可用以有效改善株型和提高產(chǎn)量等。因此，通過 對水稻頂端優(yōu)勢的分子機(jī)理研究，克隆其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中不同環(huán)節(jié)上控制植物頂端優(yōu)勢或分蘗 生長的關(guān)鍵基因，并通過基因工程等方法應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中來，可以有效改良現(xiàn)有水稻品 種的株型，提高產(chǎn)量，從而緩解糧食供需矛盾，為解決當(dāng)前人類所面臨的糧食危機(jī)提供一個(gè) 新的突破口。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白質(zhì)。
[0005] 本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)：
[0006] a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0007] b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與植物頂端優(yōu)勢相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0008] 本發(fā)明提供的所述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料，為下述B1)至B5)中的任一種：
[0009] B1)編碼上述所述蛋白質(zhì)的核酸分子；
[0010] B2)含有B1)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0011] B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0012] B4)含有B1)所述核酸分子的重組質(zhì)粒、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組質(zhì)粒；
[0013] B5)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因 植物細(xì)胞系、或含有B3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
[0014] 上述相關(guān)生物材料中，B1)所述核酸分子如序列表中序列1的DNA分子所示。
[0015] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述所述蛋白質(zhì)或上述所述相關(guān)生物材料在增強(qiáng)植 物頂端優(yōu)勢中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0017] 本發(fā)明提供的構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的方法包括如下步驟：使上述所述蛋白質(zhì)在出發(fā)植 物中過表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植物與出發(fā)植物相比，具有如下性狀中的至少一種：
[0018] (1)植物的頂端優(yōu)勢增強(qiáng)；
[0019] ⑵株高增加；
[0020] (3)分蘗減少；
[0021] (4)莖桿變粗；
[0022] (5)株型變緊湊；
[0023] (6)穗粒數(shù)增加。
[0024] 上述方法中，所述使上述所述蛋白質(zhì)在出發(fā)植物中過表達(dá)的方法為：向出發(fā)植物 中導(dǎo)入上述所述蛋白質(zhì)的編碼基因，得到轉(zhuǎn)基因植物；轉(zhuǎn)基因植物與出發(fā)植物相比，頂端優(yōu) 勢增強(qiáng)。
[0025] 上述方法中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因如序列表中序列1的DNA分子所示。
[0026] 本發(fā)明最后一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0027] 本發(fā)明提供的構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的方法包括如下步驟：抑制上述所述蛋白質(zhì)在出發(fā) 植物中表達(dá)，進(jìn)而減弱植物的頂端優(yōu)勢。
[0028] 上述方法中，所述抑制上述所述蛋白質(zhì)在出發(fā)植物中表達(dá)的方法為：向出發(fā)植物 中導(dǎo)入干擾載體PTCK303/JL1460-CAD1，得到轉(zhuǎn)基因植物；轉(zhuǎn)基因植物與出發(fā)植物相比，頂 端優(yōu)勢減弱。
[0029] 上述方法中，所述干擾載體PTCK303/JL1460-CAD1的構(gòu)建方法：用限制性內(nèi)切酶 Spe I和Sac I對DNA片段A和骨架載體pTCK303/JL1460進(jìn)行雙酶切，將DNA片段A連 入PTCK303/JL1460載體，得到重組載體甲；用限制性內(nèi)切酶BamH I和Kpn I對DNA片段 B和重組載體甲進(jìn)行雙酶切，將DNA片段B連入重組載體甲，得到所述干擾載體pTCK303/ JL1460-CAD1。
[0030] 上述方法中，所述DNA片段A的序列如序列表中序列1的第1025至1380位核苷 酸所示；DNA片段B的序列如序列表中序列1的第1011至1366位核苷酸所示。
[0031] 上述方法中，所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為 水稻。
[0032] 本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的蛋白具有增強(qiáng)植物頂端優(yōu)勢，提高植物產(chǎn)量 的功能，在植物育種方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0033] 圖1為YIL55與CAD1突變體的表型比較。
[0034] 圖2為CAD1基因的精細(xì)定位與候選。
[0035] 圖3為過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系（p0E6)與空載對照（CL3)的表型比較。圖3A過表達(dá)轉(zhuǎn) 基因株系（P〇E6)與空載對照（CL3)的株型比較；圖3B過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系（p0E6)與空載對 照（CL3)的穗型比較；圖3C基因在過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系（p0E6)與空載對照（CL3)中的表達(dá) 量比較；圖3D過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系（p0E6)與空載對照（CL3)在株高、分蘗數(shù)、主莖直徑、每穗 粒數(shù)和單株谷粒重的比較。
[0036] 圖4為干擾轉(zhuǎn)基因植株與空載對照的植株的表型比較。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0038] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0039] 本發(fā)明引物合成及測序工作均由北京奧科鼎盛生物科技有限責(zé)任公司完成。
[0040] 實(shí)驗(yàn)材料：普通野生稻（0? rufipogon Griff.)的滲入系YIL55在文獻(xiàn)"Tan LB, Liu FX, Xue ff, Wang GJ, Ye S,Zhu ZF, Fu YC, Wang XK, Sun CQ. Development of Oryza rufipogon and Oryza sativa introgression lines and assessment for yield-related quantitative trait loci. Journal Integrative Plant Biology, 2007, 49:871-884，'中公 開過，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0041] pTCK303/JL1460 載體在文獻(xiàn) "Wang Z, Chen CG, Xu YY, Jiang RX, Han Y, Xu ZH and Chong K.A Practical Vector for Efficient Knockdown of Gene Expression in Rice (Oryza sativa L.). Plant Molecular Biology Reporter, 2004, 22:409 - 417." 中公 開過，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0042] pCAMBIA13(U-Ubiq 載體在文獻(xiàn)"Yu BS, Lin ZW，Lin HX, Li XJ, Li JY, WangYH, Zhang WX, ZhuZF, Zhai WX, Wang XK, Xie DX, Sun CQ. TAC1, a major quantitative trait locus controlling tiller angle in rice.Plant J, 2007, 52:891-898. "中公開過，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0043] 實(shí)施例1、控制水稻頂端優(yōu)勢CAD1基因的獲得
[0044] 將普通野生稻滲入系YIL55經(jīng)EMS處理并經(jīng)過多代自交和性狀觀察后，形成基因 型純和的突變體系。通過對這些突變體系的篩選發(fā)現(xiàn)了一個(gè)株高增加、分蘗減少、莖桿變 粗、株型變緊湊及穗粒數(shù)增加的突變體，同野生型植株相比其頂端優(yōu)勢明顯增強(qiáng)，將此突變 體命名為CAD1 (如圖1所示）。
[0045] 將CAD1與其誘變親本HL55,進(jìn)行雜交，雜交匕代表現(xiàn)為突變體表型，從而可以推 測出控制這個(gè)突變性狀的基因是顯性的。雜交Fi經(jīng)過自交后產(chǎn)生匕后代中，表型和CAD1 相同的單株與和野生型相同的單株比例接近3:1 ( x 2 = 0. 015 ;P = 0. 726)。由此可以得出 CAD1突變體表型性狀由一個(gè)顯性單基因控制，這個(gè)基因被命名為CAD1。
[0046] 首先用CAD1與日本晴雜交的小F2群體，將基因CAD1初略定位在第8染色體的SSR 標(biāo)記RM223與RM339之間。之后，用擴(kuò)大的F 2群體將基因CAD1定位在兩個(gè)新開發(fā)的標(biāo)記 sp5和sp7之間。這兩個(gè)標(biāo)記間物理距離約51kb，根據(jù)預(yù)測結(jié)果該區(qū)段內(nèi)共含有7個(gè)基因。 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CAD1和HL55基因組DNA，對該區(qū)段進(jìn)行測序，尋找EMS誘變產(chǎn)生的基因序列 方面的差異（如圖2所示）。測序結(jié)果顯示在該定位區(qū)段內(nèi)，在L0C_0s08g31470的第4外 顯子、CDS的第1244堿基處，有1個(gè)核苷酸由G突變?yōu)锳，從而導(dǎo)致所編碼的氨基酸由谷氨 酰胺改變?yōu)榫彼帷?br>[0047] 為驗(yàn)證上述突變是否為控制水稻頂端優(yōu)勢基因 CAD1，對由CAD1突變體和日本晴 構(gòu)建的F2中3個(gè)顯性交換單株進(jìn)行了基因型檢測，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的交換單株在突變位 點(diǎn)均發(fā)生了與突變體CAD1相同的堿基替換。
[0048] 為進(jìn)一步驗(yàn)證上述堿基突變是否是真實(shí)突變，按照上述方法對200份水稻品種和 地方種及100份野生種分別提取其基因組DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序，分析其在這些水稻樣 品中的序列。
[0049] 測序結(jié)果表明：所有測試水稻樣品在堿基變異處均與野生型YIL55序列一致，表 明該堿基突變只存在于CAD1突變體中，CAD1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，CAD1 蛋白的編碼基因序列如SEQ ID No. 1所不。
[0050] 實(shí)施例2、CADI轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及其鑒定
[0051] 一、CAD1植物過表達(dá)載體的構(gòu)建
[0052] 根據(jù)CAD1突變體中的L0C_0s08g31470的全長cDNA序列設(shè)計(jì)引物，并在引物兩端 分別引入限制性內(nèi)切酶Kpn I和Sac I識別位點(diǎn)及保護(hù)堿基，引物序列如下：FL1 F:5'-IM GTACCATGCGG