結(jié)腸癌化療藥物伊立替康敏感性相關(guān)基因ugt1a1的snp檢測(cè)試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)療檢測(cè)領(lǐng)域，更具體的說是設(shè)及一種結(jié)腸癌化療藥物伊立替康敏感 性相關(guān)基因 UGT1A1的SNP檢測(cè)試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 伊立替康（Irinotecan，CPT-11)，也叫開普拓，它對(duì)大多數(shù)的癌癥都具有有效的抗 癌活性，是最普遍的化療處方藥物之一，特別是對(duì)提高結(jié)直腸癌根治術(shù)后的長(zhǎng)期生存率具 有重要意義。然而20%的患者采用W伊利替康為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案，會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的3-4級(jí) 中性粒細(xì)胞減少及腹瀉，毒性反應(yīng)是運(yùn)些患者不能耐受此藥治療的關(guān)鍵原因。伊立替康是 無活性的前藥，需經(jīng)徑酸醋酶的活化轉(zhuǎn)變?yōu)槠浠钚源x產(chǎn)物SN-38而發(fā)揮效用。具有藥物活 性的SN-38的主要清除途徑，是通過肝臟UGT1A1的糖基化作用轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的SN-38G，后者 通過尿液、膽汁排出體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)UGT1A1的表達(dá)是高度可變的，由此引起不同患者間SN- 38糖基化反應(yīng)的速率相差最高達(dá)50倍。UGT1A1基因啟動(dòng)子區(qū)具有一定多態(tài)性，其不典型 TATA盒區(qū)域中包含了5-8個(gè)TA重復(fù)序列。其中W含6個(gè)TA重復(fù)序列的基因型最為常見。隨著 TA重復(fù)序列數(shù)目的增加，UGT1A1表達(dá)下降。UGT1A1巧8指UGT1A1啟動(dòng)子不典型TATA盒區(qū)域包 含了 7個(gè)TA重復(fù)序列，該變異型與UGT1A1表達(dá)下降有關(guān)。在伊立替康治療中，UGT1A1巧8的突 變導(dǎo)致活性代謝產(chǎn)物SN-38的顯著積累，從而導(dǎo)致發(fā)生腹瀉/中性粒細(xì)胞減少的幾率顯著增 加。另外，UGT1A1*6發(fā)生突變后，會(huì)導(dǎo)致UGT1A1酶活性降低，也會(huì)導(dǎo)致SN-38在體內(nèi)的積累。 因此，UGT1A1基因型的檢測(cè)可用于臨床預(yù)測(cè)與伊立替康相關(guān)的嚴(yán)重毒副作用的發(fā)生。美國 食品和藥品監(jiān)督管理局要求伊立替康的包裝上注明該藥容易使UGT1A1巧8純合突變患者產(chǎn) 生嗜中性白血球減少癥，并且叮囑臨床醫(yī)師慎重考慮給藥劑量。
[0003] 目前針對(duì)基因多態(tài)性的檢測(cè)方法最常見方法為測(cè)序法，該方法適合高通量多位點(diǎn) 的檢測(cè)，但操作耗時(shí)長(zhǎng)且靈敏度低，不適合快速臨床檢測(cè);高分辨率溶解曲線法對(duì)設(shè)備要求 比較特殊，需要具有安裝高分辨率軟件、溫度比較敏感的機(jī)器才能使用，它的臨床推廣存在 一定的困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測(cè)結(jié)腸癌 化療藥物伊立替康敏感性相關(guān)基因 UGT1A1的SNP檢測(cè)試劑盒及其使用方法。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：
[0006] -種結(jié)腸癌化療藥物伊立替康敏感性相關(guān)基因 UGT1A1的SNP檢測(cè)試劑盒，其特征 在于:包括下列體積份的組成構(gòu)成： 引物 1~2份 探針 心2份
[0007] 預(yù)混液 10~25份 溶劑 10~15份
[000引所述引物為UGT1A1巧8引物和UGT1A1*6引物，
[0009] 所述UGT1A1巧8包括：
[0010] 正向引物:1161'141巧8斗：5'-44〔47^4(：1766了6了41^6-3'； [00川反向引物:1]61'141巧8-1?:5'-了〇：了6〇：464661'1^6-3'；
[001^ 所述UGT1A1*6引物包括：
[0013] 正向引物:1]61'141*6斗：5'-〔40：了64〔60：1^6176了4-3'；
[0014] 反向引物：1]61'141*6-尺：5'-〔4666了4〔61'(：1'1^4466了6了444-3'；
[0015] 所述探針為UGT1A1巧8探針和UGT1A1*6探針
[0016] UGT1A1巧8探針包括：
[0017] UGT1A1巧8野生型探針：
[001 引 5 ' -巧光基團(tuán)-TTGCCATATATATATATATAAGTAGGA-MGB-3 ' ；
[0019] UGT1A1巧8突變型探針：
[0020] 5 ' -巧光基團(tuán)-TGCCATATATATATATATATAAGTAGGA-MGB-3 ' ；
[0021] 所述UGT1A1*6探針包括：
[0022] UGT1A1*6野生型探針:5'-巧光基團(tuán)-CATCAGAGACGGAGCAT-MGB-3' ；
[0023] UGT1A1*6突變型探針:5'-巧光基團(tuán)-ATCAGAGACAGAGCAT-MGB-3'。
[0024] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述預(yù)混物為2 X PCR酶反應(yīng)預(yù)混液，所述2 X PCR酶反 應(yīng)預(yù)混液含有0 . lunits/μL 的Taq DNA Polymerase (recombinant)、4mmol/L的MgCl2、 0.5mmol/L的dNTPs。
[0025] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述溶劑為雙蒸水。
[0026] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述引物和探針體積比為1:1。
[0027] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述正向引物和反向引物用量相同。
[0028] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述UGT1A1巧8野生型探針和UGT1A1巧8突變型探針用 量相同。
[0029] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述UGT1A1*6野生型探針和UGT1A1*6突變型探針用量 相同。
[0030] 試劑盒的使用方法，包括W下步驟：
[0031] 1)提取待測(cè)人的基因組DNA;
[0032] 2)每個(gè)PCR體系為包含體積分的:預(yù)混液10~25份，DNA模板1份，引物1~2份、探針 1~2份；
[0033] 3)將配置好的PCR體系放入巧光定量PCR儀中，進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè);反應(yīng)條件 為：
[0034] 95°C 10分鐘預(yù)變性;循環(huán)階段，95°C 15秒并在此采集巧光信號(hào)，60°C 1分鐘，40-60 個(gè)循環(huán)；
[0035] 4)通過巧光定量PCR儀所收集數(shù)據(jù)確定檢測(cè)位點(diǎn)的基因型。
[0036] 作為本發(fā)明的最優(yōu)選方案，
[0037] 1)提取待測(cè)人的基因組DNA;
[0038] 2)每個(gè)PCR體系中，包含2 X PCR酶反應(yīng)預(yù)混液15化，DNA模板化L，正向反向引物各1 化，野生型和突變型巧光探針各化L，雙蒸水10化；
[0039] 其中2 XPCR酶反應(yīng)預(yù)混液成分及含量：Taq DNA Polymerase(recombinant): 0.1 un i t S /μ 1; MgC 12: 4mmo 1 /1; dNTPs (dATP，dCTP，dGTP，dTTP): 0.5mmo 1 /1;
[0040] 其中基因組DNA模板中DNA含量lO-lOOng，正向反向引物濃度100-100化M，野生型 和突變型巧光探針濃度lOO-lOOOnM;
[0041 ] 3)將配置好的PCR體系放入巧光定量PCR儀中，進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè);反應(yīng)條件 為：
[0042] 95°C 10分鐘預(yù)變性;循環(huán)階段，95°C 15秒并在此采集巧光信號(hào)，60°C 1分鐘，40-60 個(gè)循環(huán)；
[0043] 4)通過巧光定量PCR儀所收集數(shù)據(jù)確定檢測(cè)位點(diǎn)的基因型。
[0044] W人基因組DNA為模板，分別加入檢測(cè)UGT1A1*28型、UGT1A1*6型多態(tài)性的對(duì)應(yīng)特 異引物和巧光探針，構(gòu)成實(shí)時(shí)巧光定量PCR體系，經(jīng)過Real-time PCR反應(yīng)，通過巧光定量 PCR儀所收集的數(shù)據(jù)確定UGT1A1的基因型。
[0045] 本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)中的直接測(cè)序法相比，不需要復(fù)雜的設(shè)備， 本身就是對(duì)人體基因組中的一個(gè)序列進(jìn)行檢測(cè)。用巧光PCR法直接對(duì)提取出來的人DNA進(jìn)行 檢測(cè)，具有較高的分辨度，不需要測(cè)序儀器，就可W是實(shí)現(xiàn)對(duì)于結(jié)腸癌化療藥物伊立替康敏 感性相關(guān)基因的檢測(cè)。同時(shí)，也大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，在判斷上也十分直觀，從最終導(dǎo)出的 數(shù)據(jù)圖中就可W直接得出結(jié)論，在判斷上更加容易。
[0046] 本申請(qǐng)方案具有快速、靈敏、容易判斷等優(yōu)點(diǎn)，適合臨床的檢測(cè)和推廣。
【附圖說明】
[0047] 圖1為UGT1A1巧8位點(diǎn)野生型樣品巧光定量PCR曲線圖。
[004引圖2為UGT1A1巧8位點(diǎn)雜合突變型樣品巧光定量PCR曲線圖。
[0049]圖3為UGT1A1巧8位點(diǎn)純合突變型樣品巧光定量PCR曲線圖。
[(K)加]圖4為UGT1A1*6位點(diǎn)野生型樣品巧光定量PCR曲線圖。
[0051 ]圖5為UGT1A1*6位點(diǎn)雜合突變型樣品巧光定量PCR曲線圖。
[0052] 圖6為UGT1A1*6位點(diǎn)純合突變型樣品巧光定量PCR曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0053] 下面將結(jié)合附圖所給出的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳述。
[0054] 參照?qǐng)D1所示，本實(shí)施例的一種結(jié)腸癌化療藥物伊立替康敏感性相關(guān)基因 UGT1A1 的SNP檢測(cè)試劑盒，其特征在于:包括下列體積份的組成構(gòu)成： 引物 1~2份 探針 1~2粉
[0化5] 預(yù)混液 10~25份 溶劑 10~15份
[0056] 所述引物為UGT1A1巧8引物和UGT1A1*6引物，